7株雞滑液囊支原體四川分離株全基因組分析

劉麗佳，王 譽(yù)，張煥容,王嘉博

(西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041)

滑液囊支原體(Mycoplasmasynoviae，MS)是一種危害禽類和鳥類健康的重要病原，可引起滑液囊支原體病，又稱傳染性滑膜炎[1]。該病可通過直接接觸水平傳播或經(jīng)卵垂直傳播，不同發(fā)育階段的雞均可感染，導(dǎo)致采食量下降，飼料轉(zhuǎn)化率下降，生長發(fā)育遲緩，胴體降級(jí)[2-3]；成年雞關(guān)節(jié)腫大，滑膜炎，出現(xiàn)呼吸癥狀，蛋雞產(chǎn)蛋率下降，蛋殼頂端異常，種蛋孵化率降低[4]。單一的MS感染很少導(dǎo)致雞死亡，但會(huì)降低雞的免疫力，導(dǎo)致繼發(fā)感染[5]。Olson等首次在美國發(fā)現(xiàn)該病，隨后在法國、意大利、澳大利亞及葡萄牙等國家相繼報(bào)道該病。近年來，國內(nèi)外多個(gè)地區(qū)均存在MS感染，且該病有發(fā)展及蔓延趨勢(shì)，給養(yǎng)禽業(yè)帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失。馬爽等[6]對(duì)我國11個(gè)省份不同雞場(chǎng)進(jìn)行檢測(cè)，均發(fā)現(xiàn)MS感染，雞群感染率超過69%[7]。MS基因組較細(xì)菌小，為750～850 kb，G+C含量為28%左右。NCBI收錄的MS全基因組有10條，包括巴西MS53株[8]、美國WVU-1853株[9]、澳大利亞86079/7 NS株[10]、中國河南HN01株[11]，以及經(jīng)86079/7 NS誘導(dǎo)獲得的MS-H株[12]。MS-H株是MS弱毒疫苗生產(chǎn)用菌株，是全球通用的MS弱毒疫苗株，但研究表明，MS-H株疫苗僅對(duì)未感染MS的雞群有效，對(duì)已感染MS的雞群幾乎無效，甚至可能會(huì)加重病情[13]。全基因組測(cè)序是了解基因序列信息的一種重要手段，中國目前只有1株分離自河南的HN01全基因組序列，因此，關(guān)于我國MS的遺傳多樣性資料不全面。本實(shí)驗(yàn)室于2018—2019年，從川西4個(gè)規(guī)模2 000只以上三黃雞肉雞場(chǎng)分離出7株MS[14]，4個(gè)場(chǎng)均未免疫M(jìn)S弱毒疫苗，發(fā)病雞表現(xiàn)為跗關(guān)節(jié)腫大、胸部囊腫，剖檢時(shí)可見跗關(guān)節(jié)腔、爪墊、胸部龍骨滑膜囊有淡黃色膠凍樣分泌物，或黃色干酪樣分泌物附著。本試驗(yàn)對(duì)7株MS進(jìn)行全基因組測(cè)序，通過生物信息學(xué)分析，確定MS分離株的基因組成、基因島等基因組特征；并與NCBI上其他MS株的基因組序列比較分析，明確川西地區(qū)MS菌株的遺傳進(jìn)化關(guān)系和差異基因，為進(jìn)一步研究MS的致病機(jī)制、開發(fā)MS亞單位疫苗和建立特異性檢測(cè)技術(shù)等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 MS分離株

7株MS四川分離株由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存，分別命名為MS251、MS254、MS221、MS231、MS12H、MS1G、MSK1，其中MS251、MS254、MS221、MS231分離自同一雞場(chǎng)，MS12H、MS1G、MSK1分離自其他3個(gè)雞場(chǎng)。改良 Frey氏培養(yǎng)基購自北京中海生物科技有限公司。

1.2 MS分離株培養(yǎng)和DNA提取

分別將7株MS株各200 μL菌液接種到1.8 mL改良Frey氏液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待培養(yǎng)基顏色變黃時(shí)收集菌液即為MS分離株種子菌液。經(jīng)半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)及菌落形態(tài)觀察確定是否符合MS的培養(yǎng)特征，并將經(jīng)特異性PCR擴(kuò)增鑒定的種子菌液擴(kuò)大培養(yǎng)后提取MS基因組DNA。要求基因組DNA完整且沒有降解，在23 kb以上，OD260 nm/OD280 nm值為1.8～2.0；DNA濃度>30 ng·μL-1。

1.3 全基因組測(cè)序、原始數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估和質(zhì)量控制

7株MS全基因組測(cè)序由北京賽默百合生物科技有限公司完成，采用Illumina HiSeq平臺(tái)測(cè)序，構(gòu)建PE 測(cè)序文庫，得到的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)過 Base Calling處理后，F(xiàn)ASTQ 格式文件存儲(chǔ)讀長(read)的堿基及其質(zhì)量信息。對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)使用 FastQC(版本 0.11.5)進(jìn)行堿基質(zhì)量統(tǒng)計(jì)，并使用 R 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。使用 Trimmomatic(版本 0.36)對(duì)序列進(jìn)行修剪和去除接頭序列。

1.4 7株MS的基因從頭組裝、基因預(yù)測(cè)和注釋

利用Edena軟件，通過設(shè)置默認(rèn)參數(shù)將所有過濾后的 reads 進(jìn)行組裝，得到最終的組裝結(jié)果并統(tǒng)計(jì)長度信息。使用經(jīng)典的OLC(overlap-layout-consensus)算法架構(gòu)的組裝工具，將經(jīng)過算法處理后的reads進(jìn)行組裝。組裝后，得到多條Contig。使用 Prodigal對(duì)CDS進(jìn)行預(yù)測(cè)，使用SignalP對(duì)信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)，使用 infernal+Rnammer對(duì)tRNA、rRNA 進(jìn)行預(yù)測(cè)。將所有的CDS序列利用blast比對(duì)到KEGG、Swissport、Nr、Nt、eggNOG 數(shù)據(jù)庫，并進(jìn)行注釋，evalue 閾值統(tǒng)一為1×10-35。

1.5 MS全基因組比較分析

在進(jìn)行全基因組比較時(shí)，引用了NCBI上收錄的8株MS的全基因組序列，分別為86079-7 NS(NZ_CP012624.1)、86079/7 NS (NZ_CP029258.1)、HN01(NZ_CP034544.1)、MS53(NC_007294.1)、MS-H(NZ_KP704286.1)、MS-H(NZ_CP021129.1)、NCTC10124(NZ_LS991953.1)、WVU1853T(NZ_CP011096.1)。使用Xshell軟件對(duì)注釋完成的7株MS四川分離株全基因組進(jìn)行篩選統(tǒng)計(jì)，包括總基因長度、GC含量、編碼基因。使用R語言中的genoPlotR包，將7株MS四川分離株的全基因組與NCBI上記錄的8株MS全基因組比較，分析分離株與其他野毒株和疫苗株的差異。將差異區(qū)域進(jìn)行線性分析。

2 結(jié) 果

2.1 提取的MS分離株DNA質(zhì)量

MS分離株DNA提取結(jié)果表明MS基因組DNA完整且沒有降解，在23 kb以上， 測(cè)量的OD260 nm/OD280 nm比值為1.8～2.0；DNA濃度大于30 ng·μL-1，符合測(cè)序要求。

2.2 全基因組測(cè)序及預(yù)測(cè)

使用Xshell軟件中 shell腳本語言對(duì)全基因組篩選統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，7株MS全基因總長度在760～810 kb， GC含量28.2%～28.44%，編碼基因數(shù)677～725個(gè)， CDS 636～685個(gè)，rRNAs 5 個(gè)， tRNA數(shù)34個(gè)，tmRNA 1個(gè)。詳見表1。

表1 7株MS全基因組的基本信息

2.3 基因注釋

2.3.1 COG文庫注釋 將所有預(yù)測(cè)到的蛋白質(zhì)與 EggNOG 4.0數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)后，取evalue 1×10-35為閾值，取best hit one 作為映射依據(jù)進(jìn)行COG 注釋。COG基因功能注釋后分類結(jié)果顯示，7株MS 四川分離株MS251、MS254、MS221、MS231、MS12H、MS1G、MSK1功能基因數(shù)分別為528、527、527、527、512、514、510個(gè)。按照功能分類又可分為三大類，第一類代謝基因，包括氨基酸的運(yùn)輸和代謝、碳水化合物的運(yùn)輸和代謝、輔酶的運(yùn)輸和代謝、無機(jī)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、核苷酸的運(yùn)輸和代謝、次生代謝產(chǎn)物生物合成運(yùn)輸和分解代謝、能源生產(chǎn)與轉(zhuǎn)換；第二類信息儲(chǔ)存和處理基因，包括轉(zhuǎn)錄、復(fù)制重組和修復(fù)、防御機(jī)制；第三類為細(xì)胞過程和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因，包括細(xì)胞周期控制、細(xì)胞分裂和染色體分割、細(xì)胞壁/膜/外殼起源、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性，分泌和囊泡運(yùn)輸、翻譯后修飾，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換，伴侶、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生。還含有功能未知基因和預(yù)測(cè)基因，結(jié)果如表2所示。結(jié)果顯示，7株MS功能基因種類相同，來自同一雞場(chǎng)的4個(gè)分離株MS251、MS254、MS221、MS231，其功能基因個(gè)數(shù)幾乎相同，而分別來自其他3個(gè)雞場(chǎng)的MS12H、MS1G、MSK1間功能基因個(gè)數(shù)差異相對(duì)較小，但較來自同一雞場(chǎng)的4株MS碳水化合物的運(yùn)輸和代謝基因數(shù)少8～9個(gè)，其他部分基因數(shù)差異在0～3個(gè)之間，如表2所示。

表2 7株MS分離株 COG注釋結(jié)果

2.3.2 GO文庫注釋 將所有基因序列比對(duì)到Swissport數(shù)據(jù)庫，并使用 blast2 GO進(jìn)行GO Mapping。所有的GO根據(jù)GO的有向無環(huán)圖向上回溯，直到第3層，而后統(tǒng)計(jì)第3層GO的分析結(jié)果。結(jié)果顯示，功能基因包括分子功能、生物過程、細(xì)胞成分3大部分。分子功能基因包括催化活性、結(jié)構(gòu)分子活性、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、翻譯調(diào)節(jié)活性、分子功能調(diào)節(jié)因子、結(jié)合因子；生物過程基因包括細(xì)胞過程、生物調(diào)節(jié)、對(duì)刺激的反應(yīng)、代謝過程、生物間相互作用、定位、復(fù)制；細(xì)胞成分基因包括細(xì)胞解剖實(shí)體、含蛋白質(zhì)的復(fù)合物。分析結(jié)果表明，7株MS四川分離株功能基因種類相同，同場(chǎng)內(nèi)分離的MS251、MS254、MS221、MS231，功能基因數(shù)幾乎相同，分別來自3個(gè)雞場(chǎng)的MS分離株MS12H、MS1G、MSK1間在部分功能基因數(shù)上差異相對(duì)較小，但較同場(chǎng)內(nèi)分離的4株MS的催化活性基因數(shù)少7～8個(gè)、細(xì)胞過程基因數(shù)少4～6個(gè)，其他部分基因數(shù)差異在0～3個(gè)之間，如表3所示。

表3 7株MS分離株GO文庫注釋結(jié)果

2.3.3 KEGG 文庫注釋 將所得的序列比對(duì)到 KEGG數(shù)據(jù)庫并進(jìn)一步映射到 KO(KEGG orthology)，并通過 KO 映射到 Pathway，對(duì)KEGG 每一個(gè)功能模塊的 Pathway 映射到的基因數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)的結(jié)果如下，細(xì)胞過程：細(xì)胞群落-原核生物、細(xì)胞生長和死亡、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性、運(yùn)輸和分解代謝；環(huán)境信息處理：膜運(yùn)輸、信號(hào)傳導(dǎo)；遺傳信息處理：翻譯、復(fù)制和修復(fù)、折疊、分類和降解、轉(zhuǎn)錄；新陳代謝：碳水化合物代謝、核苷酸代謝、能量代謝、輔助因子和維生素的代謝、氨基酸代謝、類脂物代謝作用、其他氨基酸的代謝、生物降解和代謝、萜類和多酮的代謝、其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成、糖的生物合成和代謝。結(jié)果顯示，7株MS四川分離株功能基因種類相同，MS251、MS254、MS221、MS231各種功能基因數(shù)目幾乎相同，MS12H、MS1G、MSK1間部分功能基因數(shù)差異相對(duì)較小，較4株同場(chǎng)分離MS的膜運(yùn)輸基因少6～9個(gè)、碳水化合物代謝基因少12～13個(gè)，氨基酸代謝基因少3～6個(gè)，能量代謝基因數(shù)少2～5個(gè)，其他部分基因數(shù)相差異在0～3個(gè)之間。詳見表4。

2.3.4 Nr 和Nt文庫注釋結(jié)果 將所有的基因序列比對(duì)到 Nr和Nt 數(shù)據(jù)庫,結(jié)果顯示，7株MS分離株測(cè)序基因99.69%以上來源于MS基因，但有少部分基因可能來源于雞毒支原體。證明7株分離株為MS。

2.4 專業(yè)數(shù)據(jù)庫分析

2.4.1 PHI-base 數(shù)據(jù)庫分析 PHI-base數(shù)據(jù)庫(pathogen host interactions database)從文獻(xiàn)中收集了大量致病基因和效應(yīng)基因的序列。根據(jù)數(shù)據(jù)庫中病原基因表型對(duì)照分析7株MS分離株的基因表型結(jié)果顯示，導(dǎo)致病原菌致病能力喪失的基因?yàn)?個(gè)；導(dǎo)致病原菌致病能力減弱的基因MS251、MS221、MS231為44個(gè)，其余菌株45個(gè)；對(duì)病原菌致病性沒有影響的基因均為10個(gè)；導(dǎo)致病原致病能力增強(qiáng)的基因MS1G 8個(gè)，其余菌株有9個(gè)；致病效應(yīng)基因7株MS均為2個(gè)，致死因子基因MS251、MS254、MS221、MS231為3個(gè)，MS12H、MS1G、MSK1為2個(gè)，抗藥和感藥基因在各分離株均1個(gè)。詳見表5。

表4 7株MS分離株KEGG 文庫注釋結(jié)果

2.4.2 VFDB 數(shù)據(jù)庫分析 使用 blastp將所有預(yù)測(cè)出的蛋白質(zhì)序列比對(duì)到 VFDB 數(shù)據(jù)庫中，以1×10-35作為閾值進(jìn)行篩選。VFDB記錄了大量毒力因子序列信息，結(jié)果顯示分離的7株MS含有25種毒力因子，msbA、sugC、oppF基因拷貝數(shù)均為2，tnp其拷貝數(shù)MS251、MS254、MS221、MS231、MS12H、MS1G、MSK1分別為6、5、5、5、3、3、2，VlhA基因高拷貝存在各菌株中，其拷貝數(shù)分別為17、16、17、13、14、25、13個(gè)，表明VlhA是MS主要的毒力因子，對(duì)MS的致病性具有重大作用，剩余毒力基因7株MS拷貝數(shù)均為1。詳見表6。

2.5 全基因組比較

2.5.1 全基因組進(jìn)化圖 用MEGAX軟件將7株MS分離株與NCBI上收錄的8株MS全基因組比較，發(fā)現(xiàn)7株MS四川分離株與NCBI上收錄的HN01基因組最接近，而與NCBI上其余7株MS遺傳距離較遠(yuǎn)，7株MS分離株間基因組存在差異，MS251、MS221和MSK1聚為一小支，MS231、MS12H和MS254、MS1G與HN01聚為另一小支。詳見圖1。

2.5.2 全基因組比較圈圖 用MEGAX軟件將7株MS分離株與NCBI上收錄的8株MS全基因組進(jìn)行圈圖比較(圖2)，發(fā)現(xiàn)7株MS四川分離株與巴西分離株MS53、美國分離株WVU-1853、澳大利亞分離株86079/7 NS以及疫苗株MS-H差異較大，而與中國河南分離株HN01最相近，但在37～50、190～220、490～500、530～560、680～780、790～820 kb 6處片段區(qū)域與HN01存在差異(圖2)。

表5 7株MS分離株P(guān)HI 文庫分析結(jié)果

表6 7株MS分離株毒力因子種類及數(shù)量

圖1 7株MS和8株NCBI登錄菌株進(jìn)化圖Fig.1 Evolution diagram of 7 MS and 8 NCBI registered strains

2.5.3 與HN01差異區(qū)域線性分析 使用R語言中的genoPlotR作圖，將分離株與HN01株6處差異片段區(qū)域進(jìn)行線性比較。比較37～50 kb片段區(qū)域,發(fā)現(xiàn)HN01上存在的3個(gè)基因lepB、NA和fusA在7株MS四川分離株上分布不一致。lepB基因在MS251、MS254、MS221、MS12H呈長片段對(duì)應(yīng)，但是片段倒位，與HN01方向相反，且位置也發(fā)生改變，而在MS231、MS1G和MSK1上呈小片段對(duì)應(yīng)。NA和fusA對(duì)應(yīng)片段都是散射性地分布在7株MS四川分離株間，且片段較短(圖3)。

RuvB. Holliday_junction_ATP-dependent_DNA_helicase_RuvB; Pa. Phosphate_acyltransferase; R3. Ribonuclease_3; aRlmCD. 23S_rRNA_(uracil-C(5))-methyltransferase_aRlmCD; MnmA. tRNA-specific_2-thiouridylase_MnmA; Lld. L-lactate_dehydrogenase; RecO. DNA_repair_protein_RecO; A. DNA_topoisomerase_4_subunit_A; Pgdp1. Putative_glycerophosphoryl_diester_phosphodiesterase_1; IV. DNA_polymerase_IV; Cop1. ComE_operon_protein_1; Ef4. Elongation_factor_4; FtsH. ATP-dependent_zinc_metalloprotease_FtsH; PcrA. ATP-dependent_DNA_helicase_PcrA; RR. Ribonuclease_R; Gtl. Glycine--tRNA_ligase; NrnA. Bifunctional_oligoribonuclease_and_PAP_phosphatase_NrnA紅色線段和紅色邊框線段代表與HN01的基因方向相反，藍(lán)色線段代表與HN01的基因方向相同，下圖同The red line segment and the red border line represent the opposite direction to the HN01 gene, the blue line represents the same direction as the HN01 gene, the same as below圖3 37～50 kb間線性比較圖Fig.3 Linear comparison between 37-50 kb

比較190～220 kb序列，發(fā)現(xiàn)HN01上的rumC在MS251、MS254、MS221、MS12H上都有對(duì)應(yīng)長片段分布，片段倒位，與HN01方向相反，存在移位。NA在MS251、MS254、MS221上有對(duì)應(yīng)長片段，倒位，有移位。secDF、obgE、trpS則在7株MS四川分離株上呈散在分布的小片段，既有同向的，也有反向的。在7株MS分離株上此基因片段間都有OPPF和sugC2個(gè)毒力因子片段(圖4)。

490～500 kb間，HN01上的5個(gè)基因與7株MS分離株分布不一致。efp在MS231上有長片段對(duì)應(yīng)，在MS251、MS254、MS221、MS12H上有部分片段對(duì)應(yīng)，長度相同，位置對(duì)應(yīng)，基因片段倒位，與HN01株方向相反，有移位。dcm在MS231和MS1G分離株上有長片段對(duì)應(yīng)，倒位，在其余5株上對(duì)應(yīng)片段散在分布，片段較短，方向與HN01上既有相同的也有相反的。NA、aspS和hisS基因在7株MS四川分離株上對(duì)應(yīng)片段散在分布，片段較短(圖5)。

RecO. DNArepair_protein_RecO; RuvB. Holliday_junction_ATP-dependent_DNA_helicase_RuvB; RibF. Putative_riboflavin_biosynthesis_protein_RibF; OppF. Oligopeptide_transport_ATP-binding_protein_OppF; MnmG. tRNA_uridine_5-carboxymethylaminomethyl_modification_enzyme_MnmG; SugC. Trehalose_import_ATP-binding_protein_SugC; NrnA. Bifunctional_oligoribonuclease_and_PAP_phosphatase_NrnA圖4 190～220 kb間線性比較圖Fig.4 Linear comparison between 190-220 kb

RibF. Putative_riboflavin_biosynthesis_protein_RibF; Smc. Chromosome_partition_protein_Smc; EcfA1. Energy-coupling_factor_transporter_ATP-binding_protein_EcfA1; DnaA. Chromosomal_replication_initiator_protein_DnaA; OppF. Oligopeptide_transport_ATP-binding_protein_OppF圖5 490～500 kb線性比較圖Fig.5 Linear comparison between 490-500 kb

530～560 kb 間差異片段基因比較結(jié)果表明：HN01只有1個(gè)基因NA在MS231和MS1G上有長片段對(duì)應(yīng)，倒位，且有位移。在MS251、MS254、MS221、MS12H上有NA基因?qū)?yīng)小片段，且位置相同(圖6)。

在680～780 kb間，HN01上有1個(gè)基因pyk在MS251、MS221、MS12H上有該基因長片段對(duì)應(yīng)，但都倒位，MS251和MS221位置相同，而MS12H位置不同，其他4株MS只有小片段對(duì)應(yīng)，且方向不同(圖7)。

790～820 kb之間，HN01上有3個(gè)基因，其中rnc在MS251和MS12H上有大片段對(duì)應(yīng)，倒位，且基因位置不同。NA在MS251、MS254、MS221、MS12H上有基因片段對(duì)應(yīng)，位置相似，但倒位，如圖8所示。

以上結(jié)果表明6段基因線性比較，MS251、MS254、MS221、MS12H結(jié)構(gòu)相似，MS231和MS1G相似，MSK1較短，與其他6株MS差異較大。7株MS分離株中除了HN01的基因外，在6個(gè)區(qū)域中，還含有其他的基因，包括一些酶、生長因子、毒力因子。其中圖4中，7株MS上都有毒力基因OPPF和sugC。這6個(gè)區(qū)域的差異對(duì)于四川分離株生物學(xué)特性及理化性質(zhì)可能具有影響。

OpuBA. Transport_ATP-binding_protein_OpuBA; LolD. Lipoprotein-releasing_system_ATP-binding_protein_LolD; SecY. preprotein_translocase_subunit_SecY; BceA. Bacitracin_export_ATP-binding_protein_BceA; YbeY. Endoribonuclease_YbeY圖7 680～780 kb線性比較圖Fig.7 Linear comparison between 680-780 kb

DnaK. Chaperone_protein_DnaK; YcfH. putative_deoxyribonuclease_YcfH; CysA. Sulfate/thiosulfate_import_ATP-binding_protein_CysA; SecA. preprotein_translocase_subunit_SecA; MnmE. tRNA_modification_GTPase_MnmE圖8 790～820 kb線性比較圖Fig.8 Linear comparison between 790-820 kb

3 討 論

近年來，四川地區(qū)雞群MS感染較為嚴(yán)重。本試驗(yàn)前期從四川地區(qū)4個(gè)暴發(fā)MS的雞場(chǎng)分離出7株MS，并對(duì)其致病性和耐藥性等生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。MS感染對(duì)雞和火雞的養(yǎng)殖影響嚴(yán)重[15]。MS-H株是世界上唯一的MS弱毒疫苗株[16]。研究發(fā)現(xiàn)MS-H對(duì)國內(nèi)雞群MS的預(yù)防有的有效，有的效果差，甚至無效[17]。因此MS流行毒株全基因組測(cè)序分析對(duì)MS疫苗株的篩選、亞單位疫苗的開發(fā)和特異性檢測(cè)技術(shù)的建立是一項(xiàng)基礎(chǔ)性的工作。

本研究對(duì)7株MS四川分離株進(jìn)行全基因組測(cè)序，eggNOG 根據(jù)序列的相似性尋找直系同源基因，基因編碼蛋白序列功能的注釋有COG、GO、KEGG等多數(shù)據(jù)庫形式，多數(shù)據(jù)庫比對(duì)保證了基因注釋的全面性，各數(shù)據(jù)庫比對(duì)結(jié)果相似，確定7株分離菌株均為MS，其中來自同一雞場(chǎng)的4株MS在基因數(shù)量及種類上差異較小，而與分離自另外3個(gè)雞場(chǎng)的3株MS差異較大，表明MS四川分離株存在豐富的遺傳多樣性。

PHI數(shù)據(jù)庫是研究病原與機(jī)體相互作用的專業(yè)數(shù)據(jù)庫，用于研究致病菌與宿主間的相互作用[18]。PHI數(shù)據(jù)庫分析7株MS導(dǎo)致病原菌致病能力降低的基因，除了共有基因，MS251、MS254、MS221、MS231還含有MoDeam基因，MS254特有g(shù)lcA基因，MS12H、MS1G、MSK1含有FgTRR(FGSG_00871)和CaNAG1基因。致死因子中，MS251、MS254、MS221、MS231只含有GzOB009、GzOB006，而MS12H、MS1G、MSK1還含有TRR1基因。這些基因的差異可能與各MS分離株的致病性有關(guān)，推測(cè)MS251、MS254、MS221可能比MS12H、MS1G、MSK1有更強(qiáng)的致病性。TRR1基因表達(dá)硫氧還蛋白還原酶，Trr1可以降低Trx2-5，從而控制細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，深刻影響球孢白僵菌對(duì)節(jié)肢動(dòng)物的殺滅潛力。這些基因?qū)S致病性的影響還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。藥敏試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)7株分離株對(duì)土霉素、大觀霉素、泰樂菌素、替米考星等敏感，對(duì)紅霉素的MIC值較高，但基因庫分析7株MS只有1個(gè)抗藥基因GyrA具有抗氟喹諾酮類藥物的能力。

VFDB數(shù)據(jù)庫是記錄大量毒力因子序列信息的數(shù)據(jù)庫[19]，毒力因子是微生物代謝產(chǎn)生的具有侵襲力和毒力的分子，幫助微生物逃避或抑制宿主免疫反應(yīng)。本研究將MS四川分離株序列信息導(dǎo)入VFDB數(shù)據(jù)庫分析，發(fā)現(xiàn)MS含有25種毒力因子，大多數(shù)毒力因子為單拷貝數(shù)，但msbA、sugC、oppF、VlhA、tnp為多拷貝數(shù)。MS中主要的毒力因子基因大多數(shù)與黏附和侵襲力有關(guān)。如VlhA在7株MS四川分離株中以多拷貝形式存在，拷貝數(shù)最小13，最大25，該基因編碼蛋白包含變脂蛋白(MSPB)和可變血凝素蛋白(MSPA)，介導(dǎo)MS黏附、侵襲和免疫逃避，是重要的毒力因子[20-21]。除VlhA外，pdhb、eno、CT396、MG-301等毒力基因，都已證明與支原體的黏附有關(guān)。前期初步研究顯示7株MS分離株對(duì)紅細(xì)胞具有吸附能力，以及對(duì)雞胚和雛雞有感染能力，但未對(duì)菌株間致病力強(qiáng)弱進(jìn)行比較，因此需要在后續(xù)試驗(yàn)中，驗(yàn)證菌株毒力基因差異對(duì)致病力的影響。

用MEGAX軟件，將7株MS四川分離株與NCBI上收錄的8株MS全基因組比較，發(fā)現(xiàn)7株MS與中國河南HN01株基因組最近，且與世界各國流行株差異較大，說明中國MS流行株有其獨(dú)特性[11]。進(jìn)一步通過全基因組圈圖比較，發(fā)現(xiàn)7株MS四川分離株和HN01株在全基因組上共有6個(gè)差異區(qū)域，在6個(gè)差異區(qū)域內(nèi)，既包含HN01上的同源基因，還含有其他的差異基因，且同源基因長度相似，但有的出現(xiàn)倒位，這可能對(duì)MS的生物學(xué)特性產(chǎn)生影響。支原體DNA復(fù)制和修復(fù)功能的部分缺失可以阻止大的基因組倒位的形成[22]，已有研究發(fā)現(xiàn)MS-H基因組中存在55 kb的倒位，而MS-H親本株86079/7 NS的全基因組中也存在相同的倒位，證實(shí)基因組倒置不是由化學(xué)誘變引起的，而是自然發(fā)生的[10,23]。因此7株MS基因組中基因的倒位也可能是自然發(fā)生的。

在與HN01差異區(qū)域190～220 kb，7株MS四川分離株都存在毒力基因OppF和sugC，OppF為細(xì)胞質(zhì)ATP酶，為肽的轉(zhuǎn)運(yùn)提供能量[24-25]，對(duì)MS在氣管黏膜上皮細(xì)胞的定殖必不可少[26]。在MS-H疫苗株中oppF的移碼突變，導(dǎo)致其編碼蛋白的改變，最終導(dǎo)致該蛋白正常功能的喪失[23]，而在測(cè)序結(jié)果中顯示OPPF提前終止，沒有表達(dá)出完整的蛋白。sugC在結(jié)核分枝桿菌中編碼一種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，參與海藻糖的輸入，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的一個(gè)功能是作為ATPase的結(jié)構(gòu)域[27]。除了毒力因子基因片段外，差異區(qū)域也包括一些編碼酶和其他各種因子的基因，這些差異可能影響MS的生物學(xué)特性。比較7株MS四川分離株之間6個(gè)差異區(qū)域發(fā)現(xiàn)，總體上，MS251、MS254、MS221基因結(jié)構(gòu)相似；MS1G和MS231相近；MSK1單獨(dú)一支，且每個(gè)差異區(qū)域片段均較短。表明四川分離株在同場(chǎng)和不同場(chǎng)間，都存在遺傳多樣性。

4 結(jié) 論

目前，中國各個(gè)地區(qū)均存在MS感染。四川地區(qū)MS分離株全基因組比較分析發(fā)現(xiàn)，分離株與我國河南分離株HN01相近，與世界上主要MS流行株不同，可稱為中國流行株。四川地區(qū)MS分離株與HN01株基因組的6個(gè)差異基因區(qū)域編碼基因片段長度和方向倒位等變化，說明四川分離株發(fā)生了變異。而7株MS四川分離株間6個(gè)差異基因區(qū)域的不同，表明四川分離株不僅在不同場(chǎng)間，而且在同場(chǎng)間也存在遺傳多樣性。