外源GABA對NaCl脅迫下垂穗披堿草種子萌發(fā)及幼苗生理特性的影響

宋建超， 楊 航， 景媛媛， 陳彥珠， 魚小軍

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院， 草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室， 甘肅省草業(yè)工程實驗室， 中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

隨著農(nóng)業(yè)和工業(yè)的不斷發(fā)展，污水、廢氣的排放導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境污染加劇。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中，人們單純的追求作物高產(chǎn)高質(zhì)，不注重化肥、農(nóng)藥以及灌溉方式等的合理使用，加之氣候變化，導(dǎo)致全球鹽漬化土壤面積不斷增加[1]。草地的不合理利用和過度放牧等也會加劇土壤的鹽漬化[2]。據(jù)聯(lián)合國教科文組織和聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織的不完全統(tǒng)計，世界范圍內(nèi)鹽堿地面積約為9.54億hm2[3]。中國現(xiàn)有鹽漬化土壤面積約為3 693.3萬hm2，主要分布在我國東北，華北、西北和濱海地區(qū)[3]，嚴(yán)重阻礙了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和發(fā)展[4]。滲透脅迫、離子毒害和營養(yǎng)元素失調(diào)是鹽脅迫對植物造成的主要傷害，嚴(yán)重抑制了植物的生長發(fā)育[5-8]。同時鹽脅迫還使植物的光合作用和呼吸作用受阻，影響植物的吸水性，阻礙植物根系對必需營養(yǎng)元素的汲取，最終導(dǎo)致作物減產(chǎn)[9-10]。土壤鹽漬化已然成為威脅農(nóng)業(yè)以及生態(tài)環(huán)境的世界性問題。

垂穗披堿草(Elymusnutans)為禾本科披堿草屬多年生叢生植物，具有抗旱、耐堿、營養(yǎng)品質(zhì)好、適口性好、耐放牧等特性[11-12]，是青藏高原優(yōu)良的牧草品種之一[13-14]。垂穗披堿草憑借較強的繁殖能力、對臨時生境的高度適應(yīng)性，在退化草地的改良和人工草地的建設(shè)中扮演著重要角色，是高寒地區(qū)草地恢復(fù)、生態(tài)修復(fù)和建植人工草地的首選草種[15]。但是，土壤鹽漬化抑制了垂穗披堿草種子萌發(fā)和幼苗生長，導(dǎo)致幼苗生長緩慢、死亡[16]，從而阻礙了退化草地的修復(fù)和人工草地的建植。

目前植物生長調(diào)節(jié)劑被廣泛應(yīng)用于緩解植物對逆境的抗性研究中[17]。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是普遍存在于生物體內(nèi)的一類四碳非蛋白質(zhì)氨基酸[18]，是植物細(xì)胞自由氨基酸庫中的重要組分，調(diào)控植物體內(nèi)碳、氮兩大代謝途徑，可通過調(diào)節(jié)碳氮平衡和胞質(zhì)pH、促進(jìn)氨基酸和碳水化合物代謝、誘導(dǎo)激素合成(乙烯)等，參與植物生長發(fā)育調(diào)控，提高植物的適應(yīng)性和抵御非生物脅迫、病蟲害的能力[19]。GABA在植物體內(nèi)作為一種信號分子，與植物激素相互協(xié)調(diào)發(fā)揮作用，在逆境脅迫下GABA能夠發(fā)揮滲透調(diào)節(jié)、抗氧化保護(hù)以及清除活性氧的功能[20]。研究表明，植物在適宜生長條件下體內(nèi)GABA含量低，當(dāng)受到外界脅迫時，植物體內(nèi)GABA含量會迅速增加，表明GABA可能在抵御非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用[21]。已有報道指出，通過GABA浸種能夠促進(jìn)小麥(Triticumaestivum)幼苗的生長，并且在0.5 mmol·L-1GABA處理下小麥發(fā)芽率和鮮重明顯提高，可以減輕鹽脅迫對小麥幼苗造成的傷害[22]。田小磊等[23]的研究表明，鹽脅迫嚴(yán)重抑制了玉米(Zeamays)種子的萌發(fā)，添加外源GABA可顯著提高玉米種子的發(fā)芽率，并且能夠提高超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(Peroxidase，POD)和過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性，來緩解鹽脅迫對玉米幼苗的傷害。

然而，不同植物對外源GABA的響應(yīng)存在差異，并且有關(guān)其調(diào)節(jié)垂穗披堿草種子萌發(fā)過程中耐鹽性和耐鹽機制的研究較少。因此，本試驗研究100 mmol·L-1NaCl脅迫下，施加不同濃度的外源GABA對垂穗披堿草種子萌發(fā)和幼苗生理特性的影響，旨在探究外源GABA提高垂穗披堿草耐鹽性的生理機制，以期為垂穗披堿草抗逆性研究奠定理論基礎(chǔ)，并為其耐鹽性栽培管理以及退化草地修復(fù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試種子為垂穗披堿草種子，產(chǎn)地位于青海省，于2020年9月下旬收獲，帶回實驗室并保存于4℃低溫種子庫中，初始發(fā)芽率約為90%。本試驗于2021年7月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院實驗室進(jìn)行。

GABA購買上海麥克林生化科技有限公司，純度≥99%，可配制成含10 mmol·L-1GABA的100 mmol·L-1NaCl母液備用，使用前稀釋為相應(yīng)濃度的處理液。

1.2 材料處理

從供試垂穗披堿草種子中，挑選大小均一且無霉變和破損的種子，用75%的乙醇溶液消毒1 min，用蒸餾水反復(fù)沖洗7～9次，將殘余乙醇沖洗干凈，最后用濾紙吸干種子表面水分備用。

1.3 試驗設(shè)計

本試驗采用100 mmol·L-1NaCl溶液作為鹽脅迫處理，此時的脅迫程度為中度鹽脅迫[16]。挑選經(jīng)消毒處理過的垂穗披堿草種子50粒，置于雙層濾紙的9 cm一次性培養(yǎng)皿中，加入配置好的含GABA的NaCl溶液。本研究共設(shè)置8個處理分別為(表1)：CK1(對照(蒸餾水))，CK2(100 mmol·L-1NaCl溶液，G1(100 mmol·L-1NaCl + 0.05 mmol·L-1GABA)，G2(100 mmol·L-1NaCl+0.10 mmol·L-1GABA)，G3(100 mmol·L-1NaCl+0.25 mmol·L-1GABA)，G4(100 mmol·L-1NaCl+0.50 mmol·L-1GABA)，G5(100 mmol·L-1NaCl+1.00 mmol·L-1GABA)，G6(100 mmol·L-1NaCl+2.00 mmol·L-1GABA)，每個處理設(shè)3次重復(fù)。將培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行發(fā)芽試驗，萌發(fā)條件為光照14 h/25℃，黑暗10 h/15℃，光照強度為6 000 lx[24]。在固定時間進(jìn)行稱重補充散失的水分以保持鹽溶液濃度，每天觀察并記錄當(dāng)日發(fā)芽數(shù)，胚芽長度達(dá)到種子長度1/2為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，并連續(xù)記錄12 d。試驗第5 d計算發(fā)芽勢，發(fā)芽試驗結(jié)束后統(tǒng)計發(fā)芽指標(biāo)以及幼苗根長和苗長，并且進(jìn)行幼苗生理指標(biāo)的測定。

表1 試驗各處理溶液濃度Table 1 The solution concentration of each treatment in the experiment

1.4 測定指標(biāo)與方法

1.4.1發(fā)芽指標(biāo)的測定 種子萌發(fā)相關(guān)指標(biāo)發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)等測定和計算公式如下[25]：

發(fā)芽勢(Germinating energy,GE，%)=(發(fā)芽試驗前5 d的正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%

發(fā)芽率(Germination percenage，G，%)=(發(fā)芽終期12 d內(nèi)的正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%

發(fā)芽指數(shù)(Germination inde,GI)=∑(Gt/Dt)

式中Gt為第t天相應(yīng)的發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

活力指數(shù)(Vigor index，VI)=GI×S

式中S為幼苗平均長度，GI為發(fā)芽指數(shù)。

1.4.2生長指標(biāo)的測定 苗長和根長：發(fā)芽試驗結(jié)束后，在各處理培養(yǎng)皿中隨機選取10株幼苗，用直尺(0.1 cm)測量幼苗苗長和根長。

1.4.3幼苗生理指標(biāo)的測定 可溶性糖(Soluble sugar,SS)含量采用蒽酮比色法測定，可溶性蛋白(Soluble protein,SP)含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定，脯氨酸(Proline,Pro)含量采用磺基水楊酸法測定，丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定[26]。POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測定，CAT活性采用紫外吸收法測定，SOD活性采用氮藍(lán)四唑(Nitro-blue tetrazolium，NBT)法測定[27]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2019處理數(shù)據(jù)和制圖，用SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素方差(ANOVA)分析，并用Duncan法進(jìn)行多重比較，差異顯著性均采用P<0.05表示，各指標(biāo)數(shù)據(jù)均為3個重復(fù)的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

利用主成分分析將外源GABA對NaCl脅迫下垂穗披堿草種子萌發(fā)和幼苗生長的相關(guān)指標(biāo)降維,篩選出耐鹽性綜合指標(biāo)，并計算出綜合指標(biāo)權(quán)重，最后采用隸屬函數(shù)進(jìn)行外源GABA對NaCl脅迫下垂穗披堿草種子萌發(fā)和幼苗生長緩解效應(yīng)的綜合評價。以上參考王苗苗等[28]的方法，計算方法如下：

(1)各處理綜合指標(biāo)隸屬函數(shù)值：

(1)

Xj表示第j個綜合指標(biāo)；Xjmin表示第j個綜合指標(biāo)最小值；Xjmax表示第j個綜合指標(biāo)最大值。

(2)各處理綜合指標(biāo)權(quán)重：

(2)

wj表示第j個綜合指標(biāo)在所有綜合指標(biāo)中的重要程度即權(quán)重；Pj表示第j個綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率。

(3)各處理緩解效應(yīng)綜合評價：

(3)

D值為外源GABA在NaCl脅迫下垂穗披堿草種子萌發(fā)和幼苗生長的緩解效應(yīng)綜合評價值，其值越高說明在該濃度處理下外源GABA對NaCl脅迫的緩解效應(yīng)越好。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源GABA對NaCl脅迫下垂穗披堿草種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

與CK1(蒸餾水)相比，NaCl脅迫(100 mmol·L-1)顯著抑制了垂穗披堿草的萌發(fā),降低了其苗長和根長，外源添加0.05～2.00 mmol·L-1GABA能夠明顯促進(jìn)垂穗披堿草種子的萌發(fā)和生長(表2)。NaCl脅迫(CK2)處理下，垂穗披堿草種子的萌發(fā)指標(biāo)均顯著低于蒸餾水對照(CK1)處理(P<0.05)。NaCl脅迫處理下，外源添加0.05～2.00 mmol·L-1GABA可提高垂穗披堿草種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率，且不同濃度處理間存在差異。與CK2相比，G4(0.5 mmol·L-1)處理下垂穗披堿草的發(fā)芽勢和發(fā)芽率分別提高了130.43%和26.87%。在NaCl脅迫處理下，添加外源GABA顯著提高了垂穗披堿草種子的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)(P<0.05)，且不同濃度處理間存在差異。與CK2相比，在G4(0.5 mmol·L-1)處理下垂穗披堿草的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)分別提高了82.11%和224.00%。

鹽脅迫顯著抑制了垂穗披堿草幼苗的生長(表2)，與CK1相比，其苗長和根長顯著降低(P<0.05)。NaCl脅迫處理下，外源添加0.05～2.00 mmol·L-1GABA顯著提高了垂穗披堿草幼苗的苗長和根長(P<0.05)，且不同濃度處理之間存在差異，與CK2相比，G4處理下垂穗披堿草的苗長和根長分別提高了77.98%和107.34%。

表2 外源GABA對NaCl脅迫下垂穗披堿草種子萌發(fā)及幼苗生長的影響Table 2 Effects of exogenous GABA on seed germination and seedling growth of Elymus nutans under NaCl stress

2.2 外源GABA對NaCl脅迫下垂穗披堿草種子萌發(fā)過程中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和MDA含量的影響

與CK1(蒸餾水)相比，100 mmol·L-1鹽脅迫顯著提高了垂穗披堿草幼苗可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量(P<0.05)(圖1)。在鹽脅迫下，外源添加0.05～2.00 mmol·L-1GABA提高了垂穗披堿草幼苗可溶性蛋白和脯氨酸含量(P<0.05)，可溶性糖含量則呈現(xiàn)“先降后升”的變化趨勢。并且不同濃度GABA處理間存在差異，其中可溶性糖含量在G5和G6處理下最高，高溶性蛋白含量在G4和G5處理下最高，脯氨酸含量在G5處理下最高，分別較CK2處理提高了16.71%和22.48%，75.54%和61.58%，36.35%。

如圖1D所示，與CK1處理相比，100 mmol·L-1鹽脅迫顯著提高了垂穗披堿草幼苗丙二醛含量(P<0.05)。在鹽脅迫下，外源添加0.05～2 mmol·L-1GABA能夠顯著降低丙二醛含量，并且不同濃度處理均與CK2差異顯著(P<0.05)。其中，在G4和G5處理下丙二醛降低效果最好，分別較CK2處理降低了53.72%和49.41%。

圖1 外源GABA對NaCl脅迫下垂穗披堿草幼苗可溶性糖(A)、可溶性蛋白(B)、脯氨酸(C)和MDA(D)含量的影響Fig.1 Effect of exogenous GABA on the contents of soluble sugar (A),soluble protein (B),proline (C) and MDA (D) in Elymus nutans seedlings under NaCl stress注：不同小寫字母表示各處理間差異顯著(P<0.05)，下圖同Note:Different lowercase letters indicate significant differences between each treatment at the 0.05 level,the same as below

2.3 外源GABA對NaCl脅迫下垂穗披堿草幼苗體內(nèi)抗氧化酶活性的影響

由圖2可知，與CK1(蒸餾水)相比，100 mmol·L-1鹽脅迫和鹽脅迫下不同濃度的GABA處理顯著增加了幼苗POD，CAT和SOD活性(P<0.05)。鹽脅迫下，外源添加0.05～2.00 mmol·L-1GABA能顯著提高垂穗披堿草幼苗抗氧化酶POD，CAT和SOD活性(P<0.05)，且在不同濃度GABA處理間存在差異，其中G5處理對POD活性的促進(jìn)效果最佳，G4處理對CAT和SOD活性的促進(jìn)效果最佳，三種酶活性分別較CK2處理提高了97.27%，56.19%和31.91%。

圖2 外源GABA對NaCl脅迫下垂穗披堿草幼苗SOD(A)，CAT(B)，POD(C)活性的影響Fig.2 Effects of exogenous GABA on SOD (A),CAT (B) and POD (C) activities of Elymus nutans seedlings under NaCl stress

2.4 綜合評價

采用主成分分析法，將NaCl脅迫下垂穗披堿草種子萌發(fā)參數(shù)、幼苗生長和幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、抗氧化系統(tǒng)等指標(biāo)分為了2個主成分(表2)。其中第1主成分各指標(biāo)系數(shù)較大的是發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、苗長和根長，特征值為6.936，貢獻(xiàn)率為53.351%。第2主成分各指標(biāo)系數(shù)較大的是可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量及POD，CAT，SOD活性，特征值為5.392，貢獻(xiàn)率為41.473%，二者累計貢獻(xiàn)率達(dá)到了94.825%。

利用隸屬函數(shù)法對外源GABA對NaCl脅迫緩解效應(yīng)進(jìn)行綜合評價(表3)得出，添加外源GABA在G2至G6處理對NaCl脅迫的緩解效果明顯。在G4(0.5 mmol·L-1)處理下，外源GABA對垂穗披堿草種子萌發(fā)和幼苗生長緩解NaCl脅迫的效果最佳。綜合評價結(jié)果為：G4>G5>G3>G6>G2>CK1>G1>CK2。

表3 各綜合指標(biāo)系數(shù)及貢獻(xiàn)率Table 3 Coefficient and contribution rate of each comprehensive index

續(xù)表3

表4 不同處理各綜合指標(biāo)值、權(quán)重、隸屬函數(shù)值、D值及鹽脅迫緩解效應(yīng)評價Table 4 The comprehensive index values,index weight,membership function value,D values and mitigation effect evaluation of salt stress under different treatments

3 討論

鹽脅迫是影響植物種子萌發(fā)和幼苗生長的主要非生物脅迫。種子萌發(fā)是植物開始個體發(fā)育第一階段的復(fù)雜生理過程，是影響植物生命周期的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[17]。種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)反映了種子的發(fā)芽速率，活力指數(shù)則說明了種子能否迅速發(fā)芽和生長的整齊程度[29]。本研究表明，在100 mmol·L-1的NaCl脅迫處理下顯著抑制了垂穗披堿草種子的萌發(fā)和生長。原因可能是100 mmol·L-1NaCl處理損壞了細(xì)胞質(zhì)膜，增大了細(xì)胞膜通透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)液外流，打破胞內(nèi)離子平衡，影響了垂穗披堿草種子萌發(fā)和幼苗生長，這與前人的研究結(jié)果一致[17]。有研究表明，種子萌發(fā)過程中氨基酸代謝發(fā)生改變，激活包括谷氨酸脫羧酶(Glutamate decarboxylase，GAD)等多種關(guān)鍵酶，參與種子的萌發(fā)過程，而GABA作為谷氨酸脫羧酶的產(chǎn)物，在植物種子萌發(fā)期間發(fā)揮著重要作用[18]。并且在種子萌發(fā)期間，GAD催化谷氨酸脫去羧基生成的GABA，經(jīng)GABA-T催化GABA生成琥珀酸半醛(Succinic semialdehyde，SSA)，隨后被催化生成琥珀酸，參與三羧酸(Tricarboxylic-acid，TCA)循環(huán)或直接進(jìn)入呼吸鏈氧化，為抵抗脅迫反應(yīng)提供能量[30-32]。本研究結(jié)果表明，在NaCl脅迫下，添加外源GABA可顯著促進(jìn)垂穗披堿草種子萌發(fā)和幼苗的生長，且在0.5 mmol·L-1GABA處理下的效果最優(yōu)。趙嫚等[19]研究發(fā)現(xiàn)，外源施用0.5～2.0 μmol·L-1GABA促進(jìn)了鹽脅迫下金花菜(Medicagopolymorpha)種子萌發(fā)和幼苗的生長，這與本研究結(jié)果類似。研究表明，添加外源GABA增加了玉米幼苗在高鹽脅迫下內(nèi)源GABA的濃度，使幼苗的耐鹽性增強[33]。也有報道指出，外源GABA可誘導(dǎo)植物體內(nèi)乙烯的合成，而乙烯對促進(jìn)種子萌發(fā)具有重要作用[34]。說明，施用外源GABA可提高植物內(nèi)源GABA含量，誘導(dǎo)乙烯的合成，并為植物抵抗外界脅迫提供能量，從而促進(jìn)種子的萌發(fā)和幼苗的生長發(fā)育。

滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)是植物體內(nèi)應(yīng)對逆境脅迫誘導(dǎo)積累的重要信號物質(zhì)，在植物種子萌發(fā)的過程中起到關(guān)鍵作用[35]。在鹽脅迫下，植物體內(nèi)產(chǎn)生滲透脅迫，不得不積累更多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來緩解鹽脅迫引發(fā)的滲透脅迫。本研究結(jié)果表明，在100 mmol·L-1NaCl脅迫處理下，垂穗披堿草幼苗可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量較CK1(蒸餾水)顯著增加，來調(diào)節(jié)滲透平衡，從而緩解鹽脅迫。在鹽脅迫下，添加外源GABA顯著增加了垂穗披堿草幼苗可溶性蛋白和脯氨酸含量，可溶性糖含量呈“先降后升”趨勢。研究表明，施用外源GABA增加了鹽脅迫下甜高粱(Sorghumdochna)幼苗的可溶性糖和可溶性蛋白含量，緩解了其所受的鹽脅迫，這與本研究結(jié)果類似[36]。王驍[37]的研究結(jié)果表明，在高濃度鹽脅迫下添加外源GABA后西伯利亞白刺(Nitrariasibirica)幼苗的可溶性糖和脯氨酸含量呈“先升后降”趨勢。以上研究均說明，鹽脅迫下植物通過提高自身滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來緩解鹽脅迫，添加外源GABA可促使植物幼苗可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累增多，一方面為種子萌發(fā)不斷提供能量和營養(yǎng)物質(zhì)，另一方面有助于有害物質(zhì)的中和，提高植物的耐鹽性。

4 結(jié)論

NaCl脅迫抑制了垂穗披堿草種子的萌發(fā)和幼苗的生長，外源GABA處理可促進(jìn)NaCl脅迫下垂穗披堿草種子的萌發(fā)和幼苗的生長。在NaCl(100 mmol·L-1)脅迫下，外源施用0.05～2.00 mmol·L-1GABA促進(jìn)了垂穗披堿草種子萌發(fā)和幼苗生長，并且增加了萌發(fā)過程中幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，降低MDA含量，提高抗氧化酶活性，改善了垂穗披堿草種子萌發(fā)過程中的耐鹽性。利用隸屬函數(shù)綜合評價得出：0.5 mmol·L-1外源GABA處理對促進(jìn)NaCl脅迫下垂穗披堿草種子萌發(fā)和幼苗生長效果最佳。建議可通過包衣或浸種0.5 mmol·L-1GABA提高NaCl脅迫下垂穗披堿草種子的出苗率，并促進(jìn)幼苗生長。