外源赤霉素GA3施加對紫花苜蓿-根瘤菌共生體系的影響

何玉娟, 李東琴,2, 鄧 波*, 楊 軍, 對山艾力·卡布吐拉, 楊 超

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 北京 100193； 2.甘肅省酒泉市林果服務(wù)中心， 甘肅 酒泉 735000； 3.烏魯木齊綠之園園林開發(fā)有限公司， 新疆 烏魯木齊 830000； 4.特克斯縣林業(yè)和草原局， 新疆 特克斯 8355005； 5.天山西部國有林管理局特克斯分局， 新疆 特克斯 835500)

在根瘤菌與植物的共生過程中，植株為了平衡碳水化合物的支出與氮素收入，會通過生長素、赤霉素、細(xì)胞分裂素、乙烯以及脫落酸等植物激素進(jìn)行局部調(diào)控[1]。其中，赤霉酸(Gibberellins或Gibberellic acid,GA)是基于赤霉烷結(jié)構(gòu)的一類植物激素，是典型的植物生長調(diào)節(jié)劑，參與細(xì)胞分裂和種子發(fā)芽等生理過程[2]，根瘤菌的侵染、根瘤原基的建立和根瘤結(jié)構(gòu)的成熟都需要GA[3]。有研究發(fā)現(xiàn)植物形成根瘤的不同階段合成GA基因上調(diào)，表明結(jié)瘤期間GA作用于植物根毛卷曲、侵染線和根瘤原基的形成[4-5]。大豆(Glycinemax)接種根瘤菌12 h后，參與GA合成的基因顯著上調(diào)，增加早期結(jié)瘤過程中活性GA的水平[3,6]，而田菁(Sesbaniarostrata)和百脈根(Lotusccorniculatus)根瘤中結(jié)瘤的后期階段GA的合成基因上調(diào)[4-5]。接種根瘤菌之前，用GA生物合成抑制劑作用于蕓扁豆(PhaseoluslunatusL.)和田菁(Sesbaniarostrata)可抑制或完全阻斷根瘤的形成[4,7]。Dobert等和Lievens等分別發(fā)現(xiàn)赤霉素和G420氧化酶基因在蕓扁豆(PhaseoluslunatusL.)和田菁的根瘤、細(xì)菌侵染線和前感染區(qū)中有較強(qiáng)表達(dá)力[7]。此外，外源施加GA可彌補(bǔ)內(nèi)源GA的不足或缺失，即在合適的條件下，外源GA可發(fā)揮與內(nèi)源GA同樣的作用，外源施加GA能夠促進(jìn)結(jié)瘤[8]，現(xiàn)在已鑒定出赤霉素的形式有130多種，但是僅僅只有幾種具有生物活性，如真菌產(chǎn)物赤霉素GA3或赤霉酸。Ferguson發(fā)現(xiàn)赤霉素GA生物合成變異株形成根瘤數(shù)顯著少于野生型，當(dāng)赤霉素信號途徑受損時，豌豆(Pisumsativum)突變株的根部結(jié)瘤過程受到抑制，外源加入GA時，結(jié)瘤數(shù)目又恢復(fù)正常[9]。但也有研究結(jié)果顯示，在百脈根結(jié)瘤過程中，赤霉素信號途徑的正調(diào)控因子LjSLEEPYl基因的過表達(dá)顯著減少了百脈根的結(jié)瘤數(shù)；外源施加GA抑制了在表皮發(fā)生的根毛卷曲現(xiàn)象，并且抑制了NSP2和NIN的表達(dá)[5]。引起這種差異的原因可能是豆科植物種類、植株生長條件、應(yīng)用技術(shù)以及赤霉素的形態(tài)和濃度等[3]，過高或過低濃度的赤霉素都會抑制根瘤的形成。

目前，赤霉素在結(jié)瘤過程中的作用主要集中在大豆、田菁等一年生植物上，對于外源施加不同濃度梯度赤霉素對紫花苜蓿結(jié)瘤過程的影響鮮見報道。本研究通過外源添加赤霉素于苜蓿-根瘤菌共生體系中，研究其對苜蓿-根瘤菌結(jié)瘤效果的影響，并進(jìn)一步探究外源赤霉素對苜蓿結(jié)瘤過程中具體的作用階段。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本文所用苜蓿品種為‘中苜1號’(MedicagosativaL. ‘Zhongmu No. 1’)，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究提供。苜蓿中華根瘤菌gfp-Sm1021(抗400 mg·L-1硫酸鏈霉素(str)及80 mg·L-1壯觀霉素)由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院國家農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，赤霉素GA3購于西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司Sigma官網(wǎng)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計與方法

1.2.1外源赤霉素對苜蓿-根瘤菌共生體系結(jié)瘤效果的影響試驗(yàn) 采取試管培養(yǎng)的方式，將發(fā)芽的種子以無菌操作方式播于裝有濾紙條的試管，在幼苗根尖施加20 μL濃度梯度為10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9，10-10mol·L-1的GA3，以不施GA3為對照，共10個濃度，每種濃度3個重復(fù)，每個重復(fù)5株，共150株。隨后接種處理好的苜蓿根瘤菌50 μL(根瘤菌采用YEM液體培養(yǎng)基，溫度28℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)，根瘤菌培養(yǎng)至48 h對數(shù)生長穩(wěn)定期)，并加滅菌的Fahraeus無氮營養(yǎng)液15 mL，置于22～28℃溫室中培養(yǎng)，每天光照16 h。接種后第10 d開始記錄根瘤數(shù)量，每隔5 d記錄一次，直至第35 d天，培養(yǎng)至第20 d記錄植株莖長和根長。

1.2.2外源赤霉素對根毛卷曲和根瘤原基的影響試驗(yàn) 選取長勢一致的幼苗轉(zhuǎn)移到帶濾紙的方形培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿放置4株幼苗，幼苗根系施用 0(對照)、10-5和10-9mol·L-1的GA3溶液20 μL，隨后接苜蓿根瘤菌50 μL，以開始接種起記為0 h，每個處理10個重復(fù)，共計30株幼苗。接種48 h后，利用體式顯微鏡(OLYMPUS SZX18)觀測根毛卷曲的整體趨勢，隨后放于光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS BX53)10倍鏡下，隨機(jī)選取10個連續(xù)不重復(fù)的視野，數(shù)出總根毛數(shù)以及卷曲根毛數(shù)，用Camon DS126 271拍照開始觀察根毛卷曲情況；接種72 h后，開始觀察根瘤原基發(fā)育情況。依次進(jìn)行取材、脫水、包埋后將修整好的蠟塊置于石蠟切片機(jī)上切片，片厚4 μm。切片漂浮于攤片機(jī)40℃溫水上將組織展平，用載玻片將組織撈起，放進(jìn)60℃烘箱內(nèi)烤片，待水烤干蠟烤化后經(jīng)HE染色、脫水封片將切片從二甲苯溶液中取出稍晾干，中性樹膠封片。置于Nikon Eclipse ci顯微鏡鏡檢，圖像分析用Nikon DS-U3采集。染色結(jié)果為：細(xì)胞核藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)紅色。

1.2.3外源赤霉素對根系分泌木犀草素的影響試驗(yàn) 選取幼苗根系長至2～3 cm左右的苜蓿，轉(zhuǎn)移到大搪瓷盤，根系施用0(對照)、10-5和10-9mol·L-1的GA3溶液20 μL，隨后接苜蓿根瘤菌50 μL，以開始接種起記為0 h，在接種后12 h，24 h，36 h，48 h進(jìn)行取樣，剪去苜蓿幼苗根稱取0.75 g鮮樣，在液氮中迅速將材料充分研磨成粉末狀，把粉末轉(zhuǎn)移至2.5 mL離心管中，加入2 mL 80%的乙醇提取液，超聲提取4 h，13 400 r·min-1離心15 min，將上清液轉(zhuǎn)入2 mL離心管中，用0.45 μm濾膜過濾樣品，利用高效液相色譜檢測木樨草素含量。每個處理10個重復(fù)，共計30株幼苗。

1.2.4外源赤霉素對根瘤菌生長的影響試驗(yàn) 在濃度為10-5mol·L-1和10-9mol·L-1的YMA液體培養(yǎng)基中接入苜蓿根瘤菌種子液5 mL，以未添加GA3處理為對照，每隔6 h測定各處理菌液吸光度值(Optical density)和pH值，測量時間為6 h，12 h，18 h，24 h，30 h，36 h，42 h，48 h，54 h，60 h，66 h，72 h，每個處理3個重復(fù)，共108瓶。用分光光度計(UH5300)在600 nm處測量各處理菌液OD值，pH值采用pH計(PB-10)測定；采用乙烯還原法測定根瘤菌的固氮酶活性，在濃度為10-5mol·L-1和10-9mol·L-1的LNB5液體培養(yǎng)液中按1%接種量接種苜蓿根瘤菌，隨后用橡膠瓶塞密封，再用封口膜密封一次，用注射器吸出1 mL空氣，然后注入等體積的乙炔,再次用封口膜密封一次，培養(yǎng)24 h后，利用島津GC-2010氣相色譜儀測定乙烯生成速率。

1.2.5外源赤霉素對苜蓿根瘤菌相關(guān)基因的影響試驗(yàn) 用濃度為10-5mol·L-1和10-9mol·L-1GA3處理苜蓿根瘤菌后，采用TriZol法進(jìn)行總RNA提取；并采用定量檢測(儀器：BioTek-Epoch)和瓊脂糖熒光定量檢測對苜蓿根瘤菌提取的RNA進(jìn)行質(zhì)量鑒定；對苜蓿根瘤菌反轉(zhuǎn)錄制備cDNA稀釋30倍后作為模板，采用ABI 7 500 Real Time PCR儀(美國Applied Biosystem公司)進(jìn)行Real-Time PCR擴(kuò)增(表1，表2)。

表1 Real-Time PCR反應(yīng)體系Table 1 The reaction system of Real-Time PCR

表2 熒光定量PCR引物Table 2 Primers developed in this study

1.3 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用Excel整理數(shù)據(jù)，制作相關(guān)圖表；采用SPSS 19.0 軟件對所測數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計和分析；苜蓿根瘤菌cDNA進(jìn)行Real-Time PCR擴(kuò)增數(shù)據(jù)分析采用SDS2.3(美國Applied Biosystem公司)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源赤霉素對苜蓿-根瘤菌共生體系結(jié)瘤效果的影響

2.1.1根瘤數(shù)的變化 植株根瘤數(shù)隨著生長時間的增加均呈現(xiàn)增加的趨勢，在同一時間(天)內(nèi)，隨著赤霉素濃度的降低，植株結(jié)瘤數(shù)呈現(xiàn)出先增大后降低的變化趨勢(P<0.05，表3)。當(dāng)外源赤霉素的稀釋濃度為10-9mol·L-1時，苜蓿根瘤數(shù)最多，顯著大于對照根瘤數(shù)(P<0.05)；稀釋濃度為10-10mol·L-1時，苜蓿根瘤數(shù)降低，與對照無顯著性差異；外源赤霉素濃度為10-6～10-2mol·L-1時的根瘤數(shù)顯著少于對照(P<0.05)。稀釋濃度10-7mol·L-1和10-8mol·L-1時，植株結(jié)瘤數(shù)與對照無顯著性差異。

表3 不同濃度GA3對根瘤數(shù)的影響Tabel 3 Effects of different concentrations of GA3 on nodule number

2.1.2干鮮重的變化 植物的生長與氮素的吸收和利用密切相關(guān)，干鮮重是描述苜蓿產(chǎn)量的重要指標(biāo)。圖1顯示，隨著外源赤霉素稀釋濃度的降低，植株干重和鮮重的變化趨勢一致，都呈現(xiàn)出先增大后降低的變化趨勢(P<0.05)。當(dāng)外源赤霉素的濃度為10-9mol·L-1時，植株干重和鮮重最大，顯著大于對照(P<0.05)；當(dāng)外源赤霉素的稀釋濃度增大到10-10mol·L-1時，植株干重和鮮重降低，與對照無顯著性差異，顯著小于10-9mol·L-1(P<0.05)。外源赤霉素濃度為10-6～10-2mol·L-1時，植株干重與鮮重顯著小于對照(P<0.05)。10-7mol·L-1和10-8mol·L-1赤霉素處理的植株干鮮重與對照無顯著差異。

圖1 不同濃度GA3處理對幼苗干重(A)、鮮重(B)的影響Fig.1 Effects of different concentrations of GA3 on plant dry (A) and fresh weight(B)

2.1.3外源赤霉素對苜蓿-根瘤菌共生體系幼苗根長和莖長的影響 赤霉素可以刺激莖的節(jié)間伸長，促進(jìn)細(xì)胞分裂和細(xì)胞伸長。隨著外源赤霉素濃度的逐漸降低，植株根長(圖2 A)表現(xiàn)為先升高后降低的變化趨勢(P<0.05)，莖長(圖2 B)表現(xiàn)為逐漸降低的變化趨勢。外源赤霉素的稀釋濃度為10-2mol·L-1和10-3mol·L-1時，苜蓿-根瘤菌共生體系莖長顯著大于對照(P<0.05)，濃度10-2mol·L-1和10-3mol·L-1間無顯著性差異；當(dāng)外源赤霉素的濃度為10-9mol·L-1時，苜蓿-根瘤菌共生體系根長顯著大于10-2mol·L-1和10-3mol·L-1時的根長(P<0.05)，但與對照無顯著性差異。

圖2 不同濃度GA3處理對幼苗根長(A)、莖長(B)的影響Fig.2 Effects of different concentrations of GA3 on plant shoot(A) and root length(B)

2.2 外源赤霉素對根瘤原基和根毛卷曲的影響

根瘤原基數(shù)量隨著赤霉素濃度發(fā)生變化(圖3)，10-9mol·L-1GA3處理下，根瘤原基數(shù)量顯著多于對照(P<0.05)，10-5mol·L-1GA3處理下根瘤原基數(shù)量雖然減少，但是與對照相比差異不顯著。

圖3 不同濃度的GA3對根瘤原基的影響Fig.3 The effect of different concentrations of GA3on nodule primordium

由染色切片結(jié)果可以看出，接種72 h后，10-9mol·L-1GA3處理下，根部皮層位置區(qū)域有藍(lán)色細(xì)胞核的聚集，細(xì)胞分裂活躍，且聚集數(shù)量較多(圖4)；10-5mol·L-1GA3處理下，并無明顯的藍(lán)色細(xì)胞核聚集，細(xì)胞分裂不活躍。

圖4 用10-5與10-9 mol·L-1 GA3處理根瘤原基情況(接種后72 h)Fig.4 Root hairs treated with 10-5,10-9 mol·L-1 GA3(Analysis was preformed 72 h after inoculation)

與對照相比，10-5mol·L-1的GA3處理植株根系后，根毛卷曲率顯著降低(P<0.01)，10-9mol·L-1GA3處理后，與對照差異性不顯著。10-5mol·L-1的GA3處理植株根毛卷曲率與對照相比下降93.47%，10-9mol·L-1GA3處理根毛卷曲率下降14.71%(圖5，圖6)。

圖5 不同濃度的GA3對根毛卷曲的影響Fig.5 The effect of different concentrations of GA3on root hair deformation

圖6 用10-5和10-9 mol·L-1 GA3處理后根毛卷曲情況(接種后48 h后分析顯微鏡20倍鏡下觀察結(jié)果)Fig.6 Root hairs treated with 10-5,10-9 mol·L-1 GA3(Analysis was preformed 48 h after inoculation)

2.3 外源赤霉素對根系分泌木犀草素的影響

在接種根瘤菌后，隨著時間的增加，植株根系分泌木犀草素的含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，在第36 h左右達(dá)到最大。與對照相比，10-9mol·L-1GA3處理下木犀草素含量顯著增高(P<0.05)，10-5mol·L-1GA3處理下木犀草素含量與對照相比差異不顯著(表4)。

表4 不同濃度GA3處理對苜蓿根部木犀草素含量的影響Table 4 Effect of shoot-applied GA3 on the component of luteolin in afalfa roots 單位：μg·g-1

2.4 外源赤霉素對苜蓿根瘤菌生長的影響

2.4.1根瘤菌數(shù)量的變化 如圖7所示，培養(yǎng)24 h后，當(dāng)培養(yǎng)基中添加10-9mol·L-1GA3時，苜蓿根瘤菌的數(shù)量與對照相比無顯著差異，然而10-5mol·L-1GA3處理的苜蓿根瘤菌的數(shù)量顯著下降(P<0.05)。培養(yǎng)72 h后，外源添加GA3處理的苜蓿根瘤菌數(shù)量均高于對照(P<0.05)，10-5mol·L-1GA3處理下的苜蓿根瘤菌OD值達(dá)到0.96，而10-9mol·L-1GA3處理下的苜蓿根瘤菌OD值為1.16。

圖7 不同濃度的GA3對苜蓿根瘤菌OD值的影響Fig.7 Effects of different concentrations of GA3 on the OD value of rhizobium alfalfa

2.4.2根瘤菌pH的變化 如圖8所示，在培養(yǎng)的72 h內(nèi)，經(jīng)GA3處理的苜蓿根瘤菌pH始終低于對照。然而，10-5mol·L-1GA3處理下，雖然在培養(yǎng)過程中的pH維持在6～7之間，但是該處理的pH下降速度也快于低濃度10-9mol·L-1GA3處理下的pH降低速度，且兩種處理下在第36 h下降的最快。

圖8 不同濃度的GA3對苜蓿根瘤菌pH值的影響Fig.8 Changes in pH value during the process of sinorhizobium meliloti culturing in different concentration of GA3

2.4.3根瘤菌固氮酶活的變化 未經(jīng)GA3處理的苜蓿根瘤菌固氮酶活性平均值為0.21 μL·mL-1·d-1。而在培養(yǎng)基中添加10-9mol·L-1GA3處理的苜蓿根瘤菌固氮酶活性平均值上升至0.24 μL·mL-1·d-1，上升了14.3%，達(dá)到顯著水平(P<0.05)，而10-5mol·L-1GA3處理下與對照相比差異不顯著(圖9)。

圖9 不同濃度的GA3對苜蓿根瘤菌固氮酶活性的調(diào)控Fig.9 Effect of GA3 on nitrogenase activity of alfalfa rhizobium

2.5 外源赤霉素對苜蓿根瘤菌相關(guān)基因的影響

經(jīng)10-9mol·L-1GA3處理的苜蓿根瘤菌的nodA，nodD，nifA，nifH，fixA，fixK基因相對表達(dá)量均上調(diào)，且與對照相比有顯著性差異(P<0.05)，而經(jīng)10-5M GA3處理的苜蓿根瘤菌的nodA，nodD，nifA，nifH，fixA，fixK基因相對表達(dá)量與對照相比無顯著性差異，說明適當(dāng)濃度的GA3可以刺激根瘤菌基因的表達(dá)(圖10)。

圖10 苜蓿根瘤菌nod A，nod D，nif A，nif H，fix A，fix K基因熒光定量PCR相對表達(dá)量Fig.10 Relative expression of quantitive-time PCR for nod A，nod D，nif A，nif H，fix A，fix K from Sinorhizobium meliloti

3 討論

3.1 外源赤霉素添加對紫花苜蓿結(jié)瘤過程的影響

根毛是根系特異表皮細(xì)胞外伸形成的管狀突出物，位于根尖且具有結(jié)瘤活性的植物根毛可以識別根瘤菌分泌的nod因子，引發(fā)鈣離子振蕩，使細(xì)胞骨架發(fā)生改變，最終引起根毛卷曲[10]，本研究發(fā)現(xiàn)10-5mol·L-1GA3的赤霉素能夠抑制根毛卷曲，這與Maekawa研究結(jié)果一致[5]，但10-9mol·L-1GA3的赤霉素并沒有促進(jìn)根毛卷曲的發(fā)生。植物根毛識別結(jié)瘤因子后，位于G0/G1期的內(nèi)皮層細(xì)胞隨即開始分裂，形成根瘤的起始原基，隨后，植株根系中皮層細(xì)胞分裂分化，形成根瘤原基[11-12]。本研究結(jié)果表現(xiàn)為10-9mol·L-1GA3促進(jìn)根瘤原基的形成，10-5mol·L-1GA3對根瘤原基的形成并無影響，Maekawa研究發(fā)現(xiàn)高濃度10-6mol·L-1GA3處理抑制百脈根根瘤原基的形成[5]。這可能是因?yàn)椴煌鲱愋蛯Σ煌瑵舛鹊腉A3響應(yīng)不一樣，苜蓿形成的為無限根瘤，而百脈根形成有限根瘤，赤霉素在兩種類型根瘤形成中扮演著相反的作用。

類黃酮物質(zhì)是誘導(dǎo)根瘤菌結(jié)瘤因子表達(dá)的主要物質(zhì)，其含量的增加能在一定程度上促進(jìn)根瘤菌結(jié)瘤因子的表達(dá)，進(jìn)而引起一系列結(jié)瘤相關(guān)的生理生化反應(yīng)，促進(jìn)結(jié)瘤發(fā)生[13-14]。當(dāng)固氮調(diào)控基因與寄主分泌的誘導(dǎo)物質(zhì)類黃酮化合物木犀草素反應(yīng)結(jié)合后，結(jié)瘤基因才能表達(dá)，結(jié)瘤基因的表達(dá)產(chǎn)物能夠合成一種稱為結(jié)瘤因子的物質(zhì)，它能誘導(dǎo)植物根毛發(fā)生一系列的形態(tài)和生理方面的變化，最終促進(jìn)根瘤的形成[15-16]。本研究結(jié)果表明在10-9mol·L-1GA3處理下，木犀草素含量顯著性增加，然而10-5mol·L-1GA3處理下，能夠抑制木犀草素的分泌。隨著GA3處理時間的增加，10-9mol·L-1GA3處理組的木犀草素合成量逐漸增加，而且比對照組高，這與馮思瓊研究結(jié)果一致[17]，表明10-9mol·L-1GA3處理能促進(jìn)植物根部次級代謝物異黃酮的分泌。

影響和決定根瘤菌共生固氮效率的因素來自土壤生態(tài)環(huán)境、宿主植物和根瘤菌三個方面。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)外源添加10-9mol·L-1GA3可提高根瘤菌的固氮酶活性，對苜蓿根瘤固氮酶活性產(chǎn)生直接影響。10-5mol·L-1GA3處理下的苜蓿根瘤菌在其培養(yǎng)過程中伴隨著pH的迅速下降，根瘤菌的生長速率表現(xiàn)出下降和減慢的趨勢，我們分析這可能是GA3培養(yǎng)基pH動態(tài)下降導(dǎo)致生長速率下降，而且根瘤菌的發(fā)育受到添加到培養(yǎng)基中的GA3濃度的直接調(diào)控，這與周圣驕等的研究結(jié)果一致[18]，他發(fā)現(xiàn)適宜濃度GA3可使大豆根瘤菌在培養(yǎng)基的生長速率和數(shù)量顯著提高。豆科牧草的結(jié)瘤數(shù)量是決定固氮效率的關(guān)鍵因子，也是涉及到牧草產(chǎn)量和品質(zhì)的重要農(nóng)藝性狀，本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，從接種第10 d到第35 d的苜蓿根瘤數(shù)整體變化都呈現(xiàn)出先增大后降低的變化趨勢。接種第35 d后，10-9mol·L-1GA3處理顯著增加苜蓿根瘤數(shù)，10-5mol·L-1GA3處理根瘤數(shù)顯著減少，說明通過外源添加10-9mol·L-1GA3可促進(jìn)根瘤的形成。

3.2 外源赤霉素添加對苜蓿根瘤菌相關(guān)基因表達(dá)的影響

4 結(jié)論

10-9mol·L-1的外源赤霉素的添加可促進(jìn)nod基因的表達(dá)，增加植株根系黃酮類物質(zhì)的分泌量，誘導(dǎo)形成更多且活性更強(qiáng)的根瘤原基，提高苜蓿根瘤結(jié)瘤數(shù)。