LINC01836是一種新的結(jié)直腸癌診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物

趙文鎮(zhèn) 林宇寧

1福建省廈門醫(yī)學(xué)院，廈門 361023；2福建醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)B門弘愛醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，廈門 361009

結(jié)直腸癌包括結(jié)腸腺癌和直腸腺癌。結(jié)直腸癌的發(fā)病率排名第3（占總病例的10.2%），是全世界癌癥相關(guān)死亡的第2 大原因（占所有病例的9.2%）［1］。在過去幾十年中，全球結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率穩(wěn)步下降；然而，結(jié)直腸癌仍然是最常見的胃腸道惡性腫瘤和第2 大癌癥相關(guān)疾病的死亡原因［2］。目前，結(jié)直腸癌的唯一治療方法是手術(shù)切除，而化療只能維持一定的生存率［3］?；熀褪中g(shù)切除治療惡性結(jié)直腸癌的手段正在增加，但這些治療的效果沒有明顯改善。大約一半的結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)，患者在5 年內(nèi)死亡［3-4］。結(jié)腸腺癌被認(rèn)為是由遺傳和表觀遺傳變化引起的，這些變化啟動(dòng)了癌癥的發(fā)展并促進(jìn)了癌癥的進(jìn)展。癌基因作為腫瘤治療的靶點(diǎn)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，已被廣泛認(rèn)識(shí)［5］。生物標(biāo)志物可作為預(yù)后指標(biāo)、分子預(yù)測(cè)因子和靶向治療的決定因素［6-7］。許多預(yù)后標(biāo)志物已在結(jié)直腸癌中被評(píng)估。然而，大多數(shù)是實(shí)驗(yàn)性的，或者不是前瞻性的驗(yàn)證［8］。

lncRNAs 是≥長(zhǎng)度為200 個(gè)核苷酸，調(diào)節(jié)一系列細(xì)胞生物學(xué)過程，包括染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)［9］。lncRNAs 最為公認(rèn)的分子機(jī)制是充當(dāng)miRNA“海綿”來調(diào)節(jié)下游靶基因［10］。lncRNAs 在各種類型的癌細(xì)胞中異常表達(dá)，并在幾種常見的癌癥標(biāo)志物中發(fā)揮重要作用［11］。

本研究旨在尋找和結(jié)直腸癌發(fā)展進(jìn)程相關(guān)的lncRNAs，研究其作為結(jié)直腸癌患者診斷和預(yù)后的新型生物標(biāo)志物的可能性。

資料與方法

1、RNA測(cè)序數(shù)據(jù)與生物信息學(xué)分析

筆者從癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下載2020 年4月7日發(fā)布的V23.0版本的結(jié)直腸癌患者基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)中698 例level 3 HTSeq-FPKM 格式的RNAseq 數(shù)據(jù)和臨床信息，包括50 例配對(duì)的結(jié)直腸癌旁正常組織。然后將FPKM 格式的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為TPM 格式用于后續(xù)分析。筆者還在TCGA 和基因型組織表達(dá)（Genotype Tissue Expression，GTEx）數(shù) 據(jù) 庫（https：//xenabrowser.net/datapages/）中 下 載TPM 格式的RNA 序列數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)庫由UCSC Xena 的Toil過程統(tǒng)一處理［12］。本研究中執(zhí)行的所有程序均符合《赫爾辛基宣言》（2013年修訂）。

2、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有統(tǒng)計(jì)分析均采用R（v.3.6.3）進(jìn)行。不同組織中的LINC01836 表達(dá)的差異采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)，臨床病理特征與LINC01836之間的關(guān)系采用卡方檢驗(yàn)、Fisher精確檢驗(yàn)和logistic 回歸分析。采用Kaplan-Meier 方法計(jì)算TCGA中的結(jié)直腸癌患者的總生存率。P＜0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1、LINC01836在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)

為了確定結(jié)直腸癌和正常組織中LINC01836 表達(dá)的差異，筆者分析了698 個(gè)結(jié)直腸癌組織和51 個(gè)癌旁正常組織中LINC01836 的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)LINC01836 在結(jié)直腸癌組織 中高表達(dá)（P＜0.001，圖1A）。同時(shí)，筆者還 分 析 了LINC01836在50例結(jié)直腸癌組織及其配對(duì)癌旁正常組織中的表達(dá)情況，結(jié)果同樣表明結(jié)直腸癌組織高表達(dá)LINC01836（P＜0.001，圖1B）。 此 外，筆 者 還 比 較 了TCGA_GTEx 中383 例TCGA 結(jié)直腸癌樣本和359 例對(duì)應(yīng)的正常結(jié)直腸組織LINC01836 的表達(dá)，結(jié)果表明LINC01836 在結(jié)直腸癌組織樣本中顯著高表達(dá)（P＜0.001，圖1C）。

圖1 LINC01836在結(jié)直腸癌組織、癌旁正常組織、正常組織中的差異表達(dá)。A：TCGA中LINC01836在結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織中的差異表達(dá)。B：TCGA 中LINC01836在結(jié)直腸癌組織和其配對(duì)癌旁正常組織的差異表達(dá)。C：TCGA_GTEx中LINC01836在結(jié)直腸癌組織和正常結(jié)直腸組織中的差異表達(dá)

2、LINC01836的診斷價(jià)值

使用ROC分析LINC01836表達(dá)水平對(duì)區(qū)分結(jié)直腸癌組織和非癌組織的有效性，結(jié)果顯示LINC01836 的曲線下面積（area under curve，AUC）為0.907（圖2A）。TCGA_GTEx中，納入了正常組織數(shù)據(jù)后分析，AUC 為0.899，表明LINC01836 可作為區(qū)分結(jié)直腸癌與正常組織的理想生物標(biāo)志物（圖2B）。

圖2 ROC 分析LINC01836對(duì)結(jié)直腸癌的診斷價(jià)值。A：ROC 顯示TCGA 中LINC01836 表達(dá)水平對(duì)區(qū)分結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織的有效性。B：ROC 顯示TCGA_GTEx 中LINC01836 表達(dá)水平對(duì)區(qū)分結(jié)直腸癌組織和正常結(jié)直腸組織的有效性

3、LINC01836與結(jié)直腸癌患者臨床特征的關(guān)系

患者臨床特征如表1所示，篩選得到644例同時(shí)具有臨床特征和基因表達(dá)數(shù)據(jù)，根據(jù)LINC01836 表達(dá)的中位數(shù)值，將結(jié)直腸癌患者分為高（322 例）和低（322 例）表達(dá)組。通過卡方檢驗(yàn)或Fisher檢驗(yàn)，結(jié)果顯示LINC01836表達(dá)在不同的N 分期、M 分期、病理分期、淋巴侵犯和結(jié)腸息肉差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。同時(shí)logistic 回歸分析結(jié)果表明：高表 達(dá) 的LINC01836 與N 分 期進(jìn) 展（OR=1.469，P=0.017）、M 分期進(jìn)展（OR=2.131，P=0.002）、病理分期進(jìn)展（OR=1.580，P=0.005）、淋巴侵犯（OR=1.826，P＜0.001）、結(jié)腸息肉相關(guān)（OR=0.576，P=0.025），見表2。

表1 LINC01836表達(dá)與結(jié)直腸癌的臨床病理特征的相關(guān)性

表2 LINC01836表達(dá)與臨床病理特征相關(guān)性分析（logistic回歸）

4、LINC01836表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良相關(guān)

根據(jù)中值將LINC01836 表達(dá)值分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。通過Kaplan-Meier 生存分析評(píng)估LINC01836 表達(dá)與結(jié)直腸癌患者總體生存率之間的相關(guān)性，結(jié)果表明LINC01836 高表達(dá)與結(jié)直腸癌患者總體生存率低相關(guān)（P=0.002）（圖3）。

圖3 Kaplan-Meier 生存分析評(píng)估LINC01836 對(duì)結(jié)直腸癌患者的預(yù)后價(jià)值

討 論

lncRNAs 在不同的基因表達(dá)水平發(fā)揮調(diào)節(jié)功能，包括染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后［13］。lncRNAs 可與染色質(zhì)重塑復(fù)合物相互作用，在特定基因組位點(diǎn)誘導(dǎo)異染色質(zhì)形成并降低基因表達(dá)。此外，lncRNAs 與RNA 結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)錄因子共激活劑相互作用，或通過調(diào)節(jié)其靶基因的主要啟動(dòng)子來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。作用機(jī)制方面，lncRNAs 可以與DNA、mRNAs、ncRNAs 和蛋白質(zhì)進(jìn)行通信，并發(fā)揮與癌癥相關(guān)的調(diào)節(jié)作用，如成為通信信號(hào)、誘導(dǎo)信號(hào)傳遞、協(xié)助基因轉(zhuǎn)移、成為信號(hào)傳遞支架和信號(hào)傳遞向?qū)У龋?4-15］。此外，lncRNAs通常參與大腸癌的不同階段，從癌前息肉到遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這可以被視為潛在的有效診斷生物標(biāo)志物［16-17］。

目前，結(jié)直腸癌的主要治療方法是手術(shù)切除，化療只能維持一定的生存率。有研究通過改變手術(shù)方式來改善結(jié)直腸癌的治療效果，如張銳江等［18］研究指出，腹腔鏡結(jié)直腸癌根治術(shù)的治療對(duì)患者胃腸功能恢復(fù)、減少出血量有幫助。免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICI）也是結(jié)直腸癌的治療手段之一，目前研究較多，療效較好［19］。

LINC01836是一種新的lncRNAs，目前研究較少。本研究主要發(fā)現(xiàn)了LINC01836 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)量高于鄰近非癌組織，與此同時(shí)，LINC01836 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)也高于正常人群的結(jié)直腸組織，并初步證明LINC01836 具有一定的結(jié)直腸癌診斷價(jià)值。本研究還綜合分析了LINC01836 的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的臨床病理特征，發(fā)現(xiàn)LINC01836 與結(jié)直腸癌的N 分期進(jìn)展、M 分期進(jìn)展、病理分期進(jìn)展、淋巴侵犯和結(jié)腸息肉相關(guān)。通過Kaplan-Meier 生存分析發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌組織中，高表達(dá)的LINC01836 與患者預(yù)后較差相關(guān)，因此LINC01836 還存在一定的預(yù)后價(jià)值。

綜上所述，LINC01836 是一個(gè)新的lncRNAs，目前研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌組織中的高表達(dá)LINC01836 對(duì)結(jié)直腸癌的診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)有一定的價(jià)值。但本研究也存在一定的不足之處，在本研究中，并未將LINC01836 的表達(dá)與腫瘤免疫微環(huán)境進(jìn)行聚類分析，因此，LINC01836 是否有望成為免疫抑制劑治療結(jié)直腸癌新的靶點(diǎn)仍需討論，在后續(xù)的研究中，可以針對(duì)LINC01836 與免疫細(xì)胞的關(guān)系設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)并加以驗(yàn)證。