近海淺海海水弗朗西斯菌的分離培養(yǎng)和鑒定

陳富 李敏 馮俊慧 羅海敏 李良慧 廖煥蘭 屈平華 李松

1廣州市番禺區(qū)健康管理中心，廣州 511490；2中山大學(xué)腫瘤防治中心，廣州 510006；3廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510006；4廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 廣東省中醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，廣州 510006

弗朗西斯菌是一類革蘭染色陰性、營(yíng)養(yǎng)要求苛刻、專性需氧的球桿菌。其廣泛存在于海洋、淡水、人工水、土壤等自然生境中，可通過接觸病畜、食入污染的食物、吸入污染空氣等多種方式傳播給人類，且臨床感染遍布全球，僅蜃樓弗朗西斯菌的臨床感染報(bào)道就有幾十例［1］，目前在我國也有相應(yīng)的感染報(bào)道的案例［2］。弗朗西斯菌多數(shù)都是存在近海淺海海水中，而我國近海漁作業(yè)非常發(fā)達(dá)，作業(yè)人數(shù)眾多，有一定的感染風(fēng)險(xiǎn)，因我們對(duì)這方面的了解極少，為加深對(duì)這一方面的認(rèn)識(shí)和探索，本課題組就廣東近海淺海中海水的弗朗西斯菌和鄰近兼性胞內(nèi)寄生菌的進(jìn)行分離培養(yǎng)和多樣性研究，以了解近海淺海海水的弗朗西斯菌和鄰近兼性胞內(nèi)寄生菌的分布情況。

材料與方法

1、材料

1.1、儀器和試劑 （1）主要儀器：分析精密電子天平T-114（美國丹佛儀器公司），高壓蒸汽滅菌器（以色列騰氏公司），漩渦混合器Vortex（上海醫(yī)大儀器廠），5% CO2恒溫孵育箱（北京東方精瑞科技發(fā)展有限公司），恒溫金屬浴SH2-82（廣州譽(yù)維生物科技儀器有限公司），冷凍離心機(jī)Eppendorf 5804R（德國Eppendorf 公司），微量離心機(jī)（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司），Veriti 96 well PCR 儀（美國ABI公司），凝膠電泳儀DYY-7C（北京六一儀器廠），全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)（英國Syngene 公司）。（2）主要試劑：BHI 瓊脂基礎(chǔ)，軍團(tuán)菌CYE 瓊脂基礎(chǔ)，GVPC 選擇性添加試劑（均購自英國OXOID 公司）；軍團(tuán)菌BCYE 添加劑：ACES 顆粒、氫氧化鉀、α-酮戊二酸、焦磷酸鐵、L-半胱氨酸（均購自上海生工生物工程有限公司）；2216E 液體基礎(chǔ)（購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司）；革蘭染色、氧化酶及觸酶試劑（均購自法國生物梅里埃中國有限公司），Ezup 柱式細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑，Premix EX Taq Version 2.0，DL 2000 Marker（均購自上海生工生物工程有限公司），細(xì)菌16S rRNA 基因通用引物27F 和1492R（購自上海英駿公司），Goldview 核酸染料（購自廣州翔博生物科技有限公司）。

1.2、培養(yǎng)基的制備 BCYEα-2216E 培養(yǎng)基：CYE 瓊脂基礎(chǔ)12 g，ACES 顆粒5 g，氫氧化鉀1.4 g，α-酮戊二酸0.5 g，焦磷酸鐵0.125 g，L-半胱氨酸0.2 g，瓊脂粉1 g，2216E 基礎(chǔ)18.7 g，去離子水500 ml。BCYEα-2216E-GVPC 培養(yǎng)基：CYE 瓊脂基礎(chǔ)12 g，ACES 顆粒5 g，氫氧化鉀1.4 g，α-酮戊二酸0.5 g，焦磷酸鐵0.125 g，L-半胱氨酸0.2 g，瓊脂粉1 g，2216E 基礎(chǔ)18.7 g，甘氨酸1.5 g、萬古霉素0.000 5 g、放線菌酮0.04 g 和多粘菌素B 40 000 U，去離子水500 ml。BHI-2216E-GVPC 培 養(yǎng) 基：BHI 瓊 脂 基 礎(chǔ)12.5 g，氯 化 鐵0.162 5 g，L-半胱氨酸0.2 g，瓊脂粉2.5 g，2216E基礎(chǔ)18.7 g，甘氨酸1.5 g、萬古霉素0.000 5 g、放線菌酮0.04 g 和多粘菌素B 40 000 U，去離子水500 ml。

2、方法

2.1、水樣采集 于2019年10月4日茂名市電白區(qū)水東灣進(jìn)行多位點(diǎn)采集水樣19份；于2019年8月12日惠州市兩大灣（巽寮灣、雙月灣）進(jìn)行多位點(diǎn)采集水樣29份。

2.2、水樣處理及培養(yǎng) 將采集的海水充分搖勻后，取100 ml 使用孔徑為0.2 μm 的纖維素濾膜過濾濃縮，取濾膜對(duì)折剪碎后，置于新的5 ml EP 管中，加入3 ml原海水，在震蕩儀上充分震蕩，然后從中取1 ml，按1∶1 的比例加入1 ml KCl-HC（l18∶1）進(jìn)行酸處理，震蕩搖勻后靜置5 min。將50 μl上述處理后的海水密集涂布于BHI-2216E-GVPC、BCYEα-2216E-GVPC兩種培養(yǎng)基上，在25 ℃的5%CO2恒溫孵育箱中培養(yǎng)3～7 d。

2.3、菌株鑒定

2.3.1、菌株形態(tài)和生理生化鑒定 定期觀察培養(yǎng)基上菌落的生長(zhǎng)情況，觀察菌落特征并進(jìn)行革蘭染色觀察，鑒定方法參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，挑選表面及邊緣光滑、濕潤(rùn)、扁平、圓形、灰白色、半透明的疑似目標(biāo)菌落進(jìn)行觸酶、氧化酶的生理生化檢測(cè)，其傳代培養(yǎng)和純化均于BCYEα-2216E培養(yǎng)基上完成，培養(yǎng)條件與2.2一致。

2.3.2、16S rRNA基因測(cè)序 在BCYEα-2216E培養(yǎng)基上挑取3～4個(gè)實(shí)驗(yàn)菌株典型的菌落置于100 μl的DNA抽提試劑，并均勻研磨，充分混勻后置入恒溫金屬?。?05 ℃，10 min），在12 000 r/min的條件下離心3 min（離心半徑為9.5 cm），吸取含DNA 的上清液，備用。引物序列正向：27F 5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’，反向：1492R 5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行測(cè)試。DNA marker 取5 μl，每個(gè)樣品取5 μl，電泳條件參數(shù)：120 V，25 min。電泳結(jié)束后將凝膠放進(jìn)成像儀進(jìn)行掃描成像觀察條帶：16S rDAN 條帶應(yīng)于1 400 bp 附近。取條帶陽性、擴(kuò)增良好的樣品送廣州艾基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行單向測(cè)序。

2.3.3、16S rRNA 基因序列比對(duì) 使用chromas 軟件查看序列峰圖，判斷所得序列是否符合長(zhǎng)度和質(zhì)量的要求，然后將合格的序列使用DNAMAN 軟件進(jìn)行拼接，并在NCBI Blast數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行相似度搜索并分析比對(duì)結(jié)果。

結(jié) 果

1、分離培養(yǎng)結(jié)果

水東地區(qū)采取的19 份水樣，其中14 份（陽性率73.7%）水樣培養(yǎng)出目標(biāo)菌菌株共60 株，惠州地區(qū)采取的29 份水樣，其中17 份（陽性率58.6%）水樣培養(yǎng)出目標(biāo)菌菌株共79 株。處理后的海水在BHI-2216E-GVPC 培養(yǎng)基和BCYEα-2216E-GVPC 培養(yǎng)基上于35 ℃培養(yǎng)3 d 后，可見灰白色，有光澤，濕潤(rùn)，有明顯邊界的大小1.5～3.0 mm 左右的目標(biāo)菌落（圖1），將目標(biāo)菌落于血平板和BHI-2216E 培養(yǎng)基上進(jìn)行生長(zhǎng)試驗(yàn)，可見培養(yǎng)3 d后目標(biāo)菌在血平板上菌落細(xì)小，明顯生長(zhǎng)不良或生長(zhǎng)緩慢，而BHI-2216E培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。

圖1 各分離培養(yǎng)基上目標(biāo)菌的生長(zhǎng)情況。A為BHI-2216E-GVPC 培養(yǎng)基；B為BCYEα-2216E-GVPC 培養(yǎng)基；C為BCYEα-2216E培養(yǎng)基；D為在BCYEα-2216E上分純

2、目標(biāo)菌株及生理生化特征

挑取目標(biāo)菌落涂片并進(jìn)行革蘭染色。革蘭染色陰性，淡染，呈細(xì)砂狀，多形態(tài)性，表現(xiàn)為豆形、球形、桿狀或絲狀等形態(tài)，無鞭毛無動(dòng)力，無芽胞（圖2）。常規(guī)生理生化反應(yīng)結(jié)果：觸酶弱陽性，氧化酶陽性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陰性，脲酶陰性。

圖2 目標(biāo)菌革蘭染色顯微圖。A為低倍鏡下目標(biāo)菌的形態(tài)圖（10×10）；B為油鏡下目標(biāo)菌的形態(tài)圖（40×10）

3、16S rRNA分子鑒定結(jié)果

挑選目標(biāo)菌的單個(gè)菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，對(duì)純培養(yǎng)轉(zhuǎn)代后的菌進(jìn)行保存，選用弗朗西斯菌通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物送公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在gen-bank 上進(jìn)行比對(duì)。水東地區(qū)采取的19 份水樣，其中14 份（陽性率73.7%）水樣培養(yǎng)出目標(biāo)菌菌株共60 株，其中弗朗西斯菌屬（有潛在新種）12 株（20.0%），嗜半胱氨酸菌屬45 株（75.0%），方氏菌屬1株（1.7%），其他臨近屬（潛在新科）2株（3.3%）；惠州地區(qū)采取的29 份水樣，其中17 份（陽性率58.6%）水樣培養(yǎng)出目標(biāo)菌菌株共79 株，其中弗朗西斯菌屬（有潛在新種）22 株（27.8%），嗜半胱氨酸菌屬35 株（44.3%），方氏菌屬4 株（5.1%），其他臨近屬（潛在新科）18株（22.8%）。具體見表1。

表1 不同采樣地點(diǎn)16S rRNA基因序列比對(duì)結(jié)果

討 論

弗朗西斯菌是一種寄養(yǎng)的，兼性細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭陰性桿菌，廣泛存在于土壤、海洋、沼澤或小型哺乳動(dòng)物、海洋魚類、貝殼類等自然宿主體內(nèi)?？赏ㄟ^空氣中的氣溶膠、接觸疫水、創(chuàng)傷性傷口和接觸弗朗西斯菌的自然宿主等方式感染人類［3］。最引起我們關(guān)注的是，

土拉弗朗西斯菌引起的人畜共患的土拉熱病，隨著各地都有爆發(fā)的土拉熱病的報(bào)道，感染后具有發(fā)病率高、毒性大、傳播性強(qiáng)等特點(diǎn)，而且日本、德國等都有對(duì)其作為生物戰(zhàn)劑研究，所以美國以此作為長(zhǎng)期防生化恐怖的重點(diǎn)監(jiān)測(cè)目標(biāo)。之前報(bào)道的土拉弗朗西斯菌感染途徑主要是小哺乳動(dòng)物宿主、節(jié)肢動(dòng)物的叮咬等直接接觸的傳播途徑，而1997 年西班牙爆發(fā)了水源性污染的土拉熱病，土耳其也爆發(fā)了3 次的水源性污染的土拉熱病，全球范圍內(nèi)也有多例的蜃樓弗朗西斯菌，且主要都是存在于近海淺海的海水里或咸水源中，對(duì)病原菌的分離培養(yǎng)和鑒定以了解其分布特點(diǎn)的重要性［4］。因此，海水或咸水也是弗朗西斯菌存在的重要地方，水源性的感染傳播途徑不容忽視，本文就近海淺海的海水中弗朗西斯菌的分離培養(yǎng)作為研究報(bào)道。

從我們分離軍團(tuán)菌屬和弗朗西斯菌科細(xì)菌的經(jīng)驗(yàn)來看，采樣地點(diǎn)的選擇、樣本前處理策略以及培養(yǎng)基的選擇和優(yōu)化等，會(huì)大幅度提高其分離培養(yǎng)效果，并增加其相關(guān)類群的物種多樣性描述。本項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)在2011 年至2015 年間對(duì)1 288 份淡水進(jìn)行弗朗西斯菌培養(yǎng)，但由于受到方法學(xué)上局限以及水樣的選擇不同上，僅檢出3 份陽性水樣，陽性率不足1%；而在2016年至2018年間，我們通過采樣地點(diǎn)的選擇以及采用熱孵育和酸處理等釋放原蟲宿主內(nèi)細(xì)菌和抑制其他雜菌生長(zhǎng)的方法，分離的陽性率得以大幅度提高，在181 份海水和鹽水湖標(biāo)本中檢出49 份陽性樣品，并分離和描述了另弗朗西斯菌［5］、假弗朗西斯菌屬［6］、嗜半胱氨酸菌［7］、苛養(yǎng)桿菌屬［8］、易生桿菌屬［9］和慶義軍團(tuán)菌［10］等5 個(gè)屬10 余種。本文在進(jìn)一步改良的模擬海水環(huán)境的CHABBHI-2216E-GVPC 培養(yǎng)基和增加廣東地區(qū)近海淺海不同采樣地點(diǎn)上多點(diǎn)采樣，培養(yǎng)溫度的控制，并根據(jù)細(xì)菌生長(zhǎng)的適宜溫度與海水溫度之間差異的改變而嘗試不同溫度進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在20～25 ℃之間適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，更能有機(jī)會(huì)發(fā)現(xiàn)目標(biāo)菌。而我們?cè)?8 份海水中分離到31 份陽性水樣，陽性率明顯提高，對(duì)目標(biāo)菌和相近菌種的獲取概率也大大提高。

在進(jìn)一步在近海淺海的分離鑒定中，不同地點(diǎn)的海水有著不同的溫度、不同的鹽度、不同的流動(dòng)方向和速度等，都存在著不同的生態(tài)微環(huán)境，這也是導(dǎo)致菌群不一致的主要原因。而從本研究不同地點(diǎn)采集的水樣分離結(jié)果來看，菌屬的檢出和比例都明顯不同，水東地區(qū)的陽性水樣中的目標(biāo)菌大部分鑒定為嗜半胱氨酸菌屬，占比高達(dá)75.0%，與惠州的嗜半胱氨酸菌屬（44.3%）相差甚遠(yuǎn)。兩個(gè)地方一共分離到弗朗西斯菌34 株，部分菌株的測(cè)序結(jié)果的對(duì)比相似度小于98.75%，根據(jù)最新的細(xì)菌分類指南里面對(duì)新種測(cè)序結(jié)果的要求，這些菌株存在新種的可能，后續(xù)我們會(huì)對(duì)潛在的新種按照新種確認(rèn)的最低要求進(jìn)行相關(guān)的檢測(cè)。同時(shí)將對(duì)分離出的20株疑似新科的細(xì)菌進(jìn)行后續(xù)確認(rèn)檢測(cè)工作。

通過分離培養(yǎng)條件的改進(jìn)后，這次分離培養(yǎng)的陽性率明顯提高，而且分離到多株弗朗西斯菌，且可能存在弗朗西斯菌的新種，還有多株接近于弗朗西斯菌的潛在新科新屬等。同時(shí)了解到廣東地區(qū)近海淺海海水中弗朗西斯菌種非常豐富，且存在不同的新種以及可能存在鄰近菌屬。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突