虎杖苷相關(guān)AMPK信號通路對非酒精性脂肪肝病小鼠肝臟脂質(zhì)沉積的作用研究

趙東波 王昊 黃櫻 鞏萱 盧浩

1珠海市人民醫(yī)院（暨南大學附屬珠海醫(yī)院）內(nèi)分泌代謝科，珠海 519000；2暨南大學第一臨床醫(yī)學院重癥醫(yī)學科，廣州 510000

非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）是臨床常見疾病，患者以脂肪變性和肝實質(zhì)細胞脂質(zhì)過量累積為主要臨床特征［1］。流行病學研究發(fā)現(xiàn)，全球成人NAFLD 發(fā)病率超過24%，國內(nèi)患病率15%～40%［2］。肝臟脂肪代謝功能障礙誘發(fā)肝臟脂質(zhì)沉積被證實是NAFLD 發(fā)生及病情進行性發(fā)展的重要病理機制，其中三酰甘油（TG）在肝細胞內(nèi)的過表達是NAFLD 的重要基礎(chǔ)病理。然而，現(xiàn)階段NAFLD 具體分子機制尚未完全闡明，現(xiàn)代醫(yī)學仍缺乏特異性治療手段。故進一步探尋疾病潛在病理機制和靶向干預(yù)方法意義重大。單磷酸腺苷激活蛋白激酶（AMPK）是與機體糖脂代謝密切相關(guān)的蛋白激酶。多項證據(jù)表明，AMPK 信號通路的異常表達是NAFLD 肝臟脂質(zhì)沉積的重要潛在靶點［3］?；⒄溶眨≒D）是非黃酮、多酚類植物抗毒素，已被證實在抗心血管疾病、誘導(dǎo)細胞凋亡、抗氧化和抗炎中扮演重要角色。新近研究證實，PD 可通過靶向介導(dǎo)AMPK 信號通路的激活改善胰島素HepG2 細胞的脂質(zhì)代謝［4］。然而，PD 是否可通過靶向介導(dǎo)AMPK 信號通路的表達改善NAFLD 患者肝臟脂質(zhì)沉積仍未見系統(tǒng)報道?；诖吮尘?，2021 年1 月至6 月，本次研究通過構(gòu)建小鼠模型以期明確PD 對NAFLD 的潛在作用及其機制，旨在為后續(xù)臨床轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

資料與方法

1、動物

SPF 級昆明雄性小鼠（4～6 周齡，15～19 g）40 只，均購置于常州卡文斯實驗動物有限公司。

2、試劑及儀器

聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）儀：深圳市源博芯電子有限公司；TE2000-倒置熒光顯微鏡：上海光密儀器有限公司；TS100 倒置顯微鏡：北京普瑞賽司儀器有限公司；Gene Genius 凝膠分析系統(tǒng)：濟南來寶醫(yī)療器械有限公司；Gellogic 200 凝膠成像分析系統(tǒng)：廣州光儀生物科技有限公司；激光共聚焦顯微鏡AIR+9：南京伊若達儀器設(shè)備有限公司；膽酸鈉、果糖、膽固醇購置于武漢興起點生物科技有限公司；多聚甲醛、中性樹脂購置于濟南騰博化工有限公司；瓊脂糖粉：上海易佰聚經(jīng)貿(mào)有限公司；總RNA 提取試劑盒：上海語純生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：上海研尊生物科技有限公司；酶聯(lián)免疫吸附試劑盒：上海研尊生物科技有限公司。

3、分組及給藥

隨機將40 只小鼠分為5 組，即高劑量組（HFD+100PD組，8只）、中劑量組（HFD+100PD組，8只）、低劑量組（HFD+50PD 組，8 只）、模型組（8 只）和NC 組（8 只）。NC 組采用普通飼料（能量比：脂肪20%，蛋白質(zhì)60%，碳水化合物20%）喂養(yǎng)；高劑量組、中劑量組、低劑量組、模型組均采用高脂飼料喂養(yǎng)（編號D12492，能量比：脂肪60%，蛋白質(zhì)20%，碳水化合物20%）+高糖飲水（55%果糖+45%葡萄糖，配制成42 g/L 糖水），并在12 周后各取1 只小鼠觀察建模情況。確定建模成功后進行后續(xù)研究，既NC組和模型組采用1 ml/100 g生理鹽水灌胃4周，HFD+50PD 組給予高脂飼料+高糖飲水（55%果糖+45%葡萄糖，配制成42 g/L 糖水）+PD 50 mg/（kg·d）灌胃干預(yù)；HFD+100PD 組給予高脂飼料+高糖飲水（比例同上）+PD 100 mg/（kg·d）灌胃干預(yù)；HFD+100PD組給予高脂飼料+高糖飲水（比例同上）+PD 200 mg/（kg·d）灌胃干預(yù)。

4、觀察指標

4.1、常規(guī)指標 每周稱量小鼠體質(zhì)量，尾靜脈取血檢測空腹血糖；藥物干預(yù)結(jié)束后，麻醉處死動物，留取血清、肝臟組織標本，并計算肝臟指數(shù)（liver index，LI）=［肝質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%］。

4.2、血清生化指標的檢測 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清及肝臟組織TG、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。

4.3、小鼠肝組織蘇木素-伊紅（HE）和油紅O染色（脂質(zhì)沉積） 處死小鼠后取右葉肝臟組織，并進行固定（固定采用4%多聚甲醛溶液），脫水后進行常規(guī)封蠟操作，隨后進行HE 染色，并在正置顯微鏡下觀察肝臟組織形態(tài)和膨脹情況。

4.4、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR） 采用TRIzol Reagent提取肝組織中總的RNA，并在98 ℃、50 ℃和37 ℃條件下進行逆轉(zhuǎn)錄操作，操作嚴格按照試劑盒說明書進行，待逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后進行RT-PCR 擴增。反應(yīng)條件為：反應(yīng)共進行40 個循環(huán)，其中65 ℃1 min，95 ℃15 s，95 ℃10 min。均采用GAPDH 作為內(nèi)參，參考2-△△CT檢測SREBP-1c、Akt、ACC、FAS的mRNA相對表達水平。

4.5、蛋白質(zhì)印跡法 取200 mg 肝組織，滴入裂解液后提取總蛋白，采用BCA法進行蛋白濃度測定，并常規(guī)進行電泳分離等操作，完成后采用凝膠成像儀分析系統(tǒng)，以GAPDH 作為內(nèi)參進行肝臟AMPK（AMPK/pAMPK）的蛋白相對表達水平的半定量分析。

5、統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，兩兩組間比較采用LSD-t檢驗，多組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1、各組小鼠HE染色結(jié)果

本實驗結(jié)果顯示，正常的肝組織以中央靜脈為中心，肝細胞排列緊密，肝血竇與肝板排列形態(tài)規(guī)則，呈放射狀，而模型組肝細胞形態(tài)不規(guī)則，且出現(xiàn)膨脹的狀態(tài)，同時肝組織中存在較多脂肪空泡；結(jié)果顯示，HFD+200PD 組肝組織排列緊密和脂肪空泡情況均優(yōu)于HFD+100PD 組、HFD+50PD組、模型組，且HFD+100PD 組顯著優(yōu)于HFD+50PD 和模型組。

2、各組小鼠AMPK通路表達情況

HFD+200PD 組P-AMPK、AMPK 蛋白相對表達量顯著高于HFD+100PD 組、HFD+50PD 組和模型組（均P＜0.05），且HFD+100PD 組顯著高于HFD+50PD 組和模型組，但4 組均顯著低于NC組（均P＜0.05），見表1。

表1 各組SPF級昆明雄性小鼠AMPK通路表達情況（± s，n=8）

表1 各組SPF級昆明雄性小鼠AMPK通路表達情況（± s，n=8）

注：NC 組采用普通飼料（能量比：脂肪20%，蛋白質(zhì)60%，碳水化合物20%）喂養(yǎng)；高劑量組、中劑量組、低劑量組、模型組均采用高脂飼料喂養(yǎng)（編號D12492，能量比：脂肪60%，蛋白質(zhì)20%，碳水化合物20%）+高糖飲水（55%果糖+45%葡萄糖，配制成42 g/L 糖水），并在12 周后各取1 只小鼠觀察建模情況；確定建模成功后進行后續(xù)研究，既NC 組和模型組采用1 ml/100 g 生理鹽水灌胃4 周，HFD+50PD 組給予高脂飼料+高糖飲水（55%果糖+45%葡萄糖，配制成42 g/L 糖水）+PD 50 mg/（kg·d）灌胃 干預(yù)；HFD+100PD 組給予高脂飼料+高糖飲水（比例同上）+PD 100 mg/（kg·d）灌胃干預(yù)；HFD+100PD 組給予高脂飼料+高糖飲水（比例同上）+PD 200 mg/（kg·d）灌 胃 干 預(yù)。PD 為 虎 杖 苷。與NC 組 比 較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與HFD+50PD 組比較，cP＜0.05；與HFD+100PD組比較，dP＜0.05

組別HFD+200PD組HFD+100PD組HFD+50PD組模型組NC組F值P值P-AMPK 0.89±0.02abcd 0.78±0.02abc 0.68±0.03a 0.53±0.12a 1.03±0.12 10.57＜0.01 AMPK 0.84±0.02abcd 0.67±0.03abc 0.58±0.04a 0.47±0.06a 1.10±0.10 8.44＜0.01

3、各組小鼠肝臟組織中脂質(zhì)合成相關(guān)基因表達情況

HFD+200PD 組SREBP-1c、ACC、FAS mRNA 相對表達量顯著低于HFD+100PD 組、HFD+50PD 組和模型組，而Akt mRNA顯著高于HFD+100PD組、HFD+50PD組和模型組（均P＜0.05），見表2。

表2 各組SPF級昆明雄性小鼠肝臟組織中脂質(zhì)合成相關(guān)基因表達情況（± s，n=8）

表2 各組SPF級昆明雄性小鼠肝臟組織中脂質(zhì)合成相關(guān)基因表達情況（± s，n=8）

注：NC 組采用普通飼料（能量比：脂肪20%，蛋白質(zhì)60%，碳水化合物20%）喂養(yǎng)；高劑量組、中劑量組、低劑量組、模型組均采用高脂飼料喂養(yǎng)（編號D12492，能量比：脂肪60%，蛋白質(zhì)20%，碳水化合物20%）+高糖飲水（55%果糖+45%葡萄糖，配制成42 g/L 糖水），并在12 周后各取1只小鼠觀察建模情況；確定建模成功后進行后續(xù)研究，既NC 組和模型組采用1 ml/100 g 生理鹽水灌胃4 周，HFD+50PD 組給予高脂飼料+高糖飲水（55%果糖+45%葡萄糖，配制成42 g/L 糖水）+PD 50 mg/（kg·d）灌胃干預(yù)；HFD+100PD 組給予高脂飼料+高糖飲水（比例同上）+PD 100 mg/（kg·d）灌胃干預(yù)；HFD+100PD 組給予高脂飼料+高糖飲水（比例同上）+PD 200 mg/（kg·d）灌胃干預(yù)。PD 為虎杖苷。與NC組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與HFD+50PD組比較，cP＜0.05；與HFD+100PD組比較，dP＜0.05

組別HFD+200PD組HFD+100PD組HFD+50PD組模型組NC組F值P值SREBP-1c mRNA 1.23±0.10abcd 1.45±0.08abc 1.67±0.11ab 2.21±0.14a 1.01±0.12 11.23＜0.01 Akt mRNA 0.82±0.03abcd 0.68±0.03abc 0.51±0.02ab 0.32±0.06a 0.98±0.17 9.57＜0.01 ACC mRNA 1.43±0.21abcd 1.79±0.18abc 2.28±0.13ab 2.87±0.18a 1.03±0.21 12.21＜0.01 FAS mRNA 1.58±0.06abcd 1.95±0.08abc 2.25±0.11ab 2.91±0.11a 1.08±0.17 8.54＜0.01

4、各組小鼠血清生化指標表達情況

HFD+200PD 組TC、TG 和LDL-C 表 達 量 顯 著 低 于HFD+100PD、HFD+50PD 和模型組（均P＜0.05），且HFD+100PD組顯著低于HFD+50PD和模型組，但4組均顯著高于NC組（均P＜0.05），見表3。

表3 各組SPF級昆明雄性小鼠血清生化指標表達情況（mmol/L，± s，n=8）

表3 各組SPF級昆明雄性小鼠血清生化指標表達情況（mmol/L，± s，n=8）

注：NC 組采用普通飼料（能量比：脂肪20%，蛋白質(zhì)60%，碳水化合物20%）喂養(yǎng)；高劑量組、中劑量組、低劑量組、模型組均采用高脂飼料喂養(yǎng)（編號D12492，能量比：脂肪60%，蛋白質(zhì)20%，碳水化合物20%）+高糖飲水（55%果糖+45%葡萄糖，配制成42 g/L 糖水），并在12 周后各取1 只小鼠觀察建模情況；確定建模成功后進行后續(xù)研究，既NC 組和模型組采用1 ml/100 g 生理鹽水灌胃4 周，HFD+50PD 組給予高脂飼料+高糖飲水（55%果糖+45%葡萄糖，配制成42 g/L 糖水）+PD 50 mg/（kg·d）灌胃干預(yù)；HFD+100PD 組給予高脂飼料+高糖飲水（比例同上）+PD 100 mg/（kg·d）灌胃干預(yù)；HFD+100PD 組給予高脂飼料+高糖飲水（比例同上）+PD 200 mg/（kg·d）灌胃干預(yù)。PD 為虎杖苷。與NC 組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與HFD+50PD 組比較，cP＜0.05；與HFD+100PD組比較，dP＜0.05

組別HFD+200PD組HFD+100PD組HFD+50PD組模型組NC組F值P值TC 5.24±0.17abcd 6.98±0.13abc 8.54±0.21ab 11.87±1.54a 3.89±0.12 8.67＜0.01 TG 0.78±0.05abcd 1.10±0.01abc 1.35±0.11ab 1.87±0.21a 0.21±0.03 11.54＜0.01 LDL-C 2.57±0.12abcd 2.67±0.12abc 2.98±0.21ab 4.65±0.45a 1.97±0.21 9.54＜0.01

討 論

祖國醫(yī)學典籍中未見脂肪肝之名，依據(jù)疾病特點可歸屬于“肥氣”“痞滿”“痰濁”“脅痛”“積聚”等范疇［6］?！鹅`樞·百病始生》有載：“濕氣不行，凝血蘊里而不散”；《素問·五常政大論》有載：“飲食自倍，腸胃乃傷”；《醫(yī)學入門》有載：“善食厚味者生痰”；《臨證指南醫(yī)案·濕》有載：“陰之五宮，傷在五味”；痰瘀互結(jié)、濕熱內(nèi)蘊、痰濁內(nèi)阻、腎氣虧虛、肝失疏泄和脾失健運是本病的主要病機，而過食肥甘厚味致使肝臟脂肪沉積是本病的核心病因［7］。虎杖具有利濕、破瘀、清熱等功效，典籍記載其在脅痛、黃疸和肥胖等疾病的治療中效果卓越［8］?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，其主要活性成分PD 在保肝、降血脂方面具顯著功效［9］。但其在NAFLD 患者肝臟脂質(zhì)沉淀中的作用機制仍未被系統(tǒng)報道。

本實驗結(jié)果顯示：高脂飲食飼養(yǎng)16 周后，模型組、HFD+200PD 組、HFD+100PD 組、HFD+50PD 組血清TG、TC、LDL-C 水平均顯著高于NC 組，提示NAFLD 小鼠模型構(gòu)建成功。AMPK 信號通路是維持細胞能量穩(wěn)態(tài)和調(diào)控肝臟脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的核心樞紐。AMPK 是由γ 亞基（38 kDa）、β 亞基（38 kDa）和α 亞基（63 kDa）組成的異源三聚體，其中β、γ為調(diào)節(jié)亞基，α 為催化亞基。研究證實，當機體出現(xiàn)熱休克、缺血、缺氧、低血糖等應(yīng)激并引起細胞供能不足后AMP 的表達隨之上調(diào)，而過表達的可通過與γ亞基結(jié)合激活A(yù)MPK的表達。脂質(zhì)沉積相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，AMPK 信號通路的激活可緩解高脂飲食引起的脂質(zhì)沉積，如靶向調(diào)節(jié)AMPK 的磷酸化可抑制脂質(zhì)沉積［10］、熊果酸可通過介導(dǎo)AMPK 信號通路的表達改善肝細胞的脂肪沉積［11］。本實驗結(jié)果顯示：HFD+200PD組P-AMPKα、AMPK蛋白表達水平均顯著高于HFD+100PD 組、HFD+50PD 組和模型組，且HFD+100PD 組顯著高于HFD+50PD 組模型組，但均低于NC 組，提示NAFLD 模型采用PD 干預(yù)后可靶向調(diào)節(jié)AMPK 信號通路的表達。SREBP-1c、Akt、ACC、FAS是參與調(diào)控機體脂質(zhì)合成的重要基因。Kim 等［12］證實，SREBP-1c 的表達上調(diào)與脂肪肝發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。朱艷萍等［13］證實，Akt 的磷酸化水平降低可繼發(fā)調(diào)控下游信號分子表達，進而促進脂質(zhì)沉積。戴江東等［14］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AS 通路是參與介導(dǎo)NAFLD 脂質(zhì)平衡代謝紊亂的重要信號源。龔美蓉等［15］發(fā)現(xiàn)，抑制ACC 的表達后可顯著改善肥胖大鼠脂質(zhì)沉淀現(xiàn)象。本次實驗結(jié)果顯示：HFD+200PD組SREBP-1c、FAS、ACC的mRNA 相對表達水平顯著低于HFD+100PD 組、HFD+50PD 組和模型組，且HFD+100PD 組顯著低于HFD+50PD 組和模型組，但均顯著高于NC 組，而HFD+200PD 組Akt mRNA 水平顯著高于HFD+100PD 組、HFD+50PD 組和模型組，提示PD 可通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達改善NAFLD 小鼠肝臟脂質(zhì)沉積情況。進一步分析肝組織HE 染色結(jié)果顯示，HFD+200PD 組肝組織排列緊密和脂肪空泡情況均優(yōu)于HFD+100PD組、HFD+50PD組和模型組，且HFD+100PD組顯著優(yōu)于HFD+50PD組和模型組，證實PD治療可顯著改善NAFLD小鼠的肝臟脂質(zhì)沉積，且藥效呈現(xiàn)劑量依賴性，即給予小鼠較大劑量灌胃可顯著增加療效。

綜上所述，非酒精性脂肪肝采用PD 治療后可顯著改善肝臟脂質(zhì)沉積現(xiàn)象，且增加服藥劑量可顯著提升療效，其機制可能與靶向調(diào)節(jié)AMPK 信號通路的激活和抑制相關(guān)脂質(zhì)合成因子表達有關(guān)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突