普洱地區(qū)桉樹林根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性研究

郭 潔，樊竹青，趙利坤，李沂韋

普洱學(xué)院 云南省高校亞熱帶藥用食用生物資源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 普洱 665000

桉樹是桃金娘科（Myrtaceae）桉屬（Eucalyptus）植物的統(tǒng)稱，常綠高大喬木，具有藥用、經(jīng)濟(jì)等多種價(jià)值。桉樹的種植對(duì)我國(guó)很多地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展做出了貢獻(xiàn)，同時(shí)對(duì)周邊生態(tài)環(huán)境也帶來很大負(fù)面影響。桉樹被稱為土壤的“抽水機(jī)”和“抽肥機(jī)”，長(zhǎng)期種植會(huì)造成土壤貧瘠、生態(tài)物種單一、威脅其他的生物生長(zhǎng)，降低了生物多樣性。桉樹人工林取代次生林降低了植物物種豐富度和表面覆蓋率，顯著降低了土壤微生物群落功能[1]。

土壤根際微生物物種多樣性是評(píng)價(jià)土壤生態(tài)系統(tǒng)健康程度的重要指標(biāo)，土壤微生物物種越豐富，生態(tài)系統(tǒng)對(duì)外界破壞的抵抗能力和自我修復(fù)能力就越強(qiáng)，生態(tài)系統(tǒng)就越穩(wěn)定。據(jù)相關(guān)調(diào)查顯示，覃玉球[2]在《桉樹產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響分析》一文中提到大規(guī)模種植桉樹之后，桉樹林生態(tài)系統(tǒng)中很多生物的種類均有下降。我國(guó)學(xué)者對(duì)廣西地區(qū)桉樹林中的植物分布進(jìn)行了調(diào)查，其結(jié)果表明桉樹林中草本植物和蕨類植物的種類和數(shù)量都隨著桉樹林樹齡的增加呈緩慢下降的趨勢(shì)。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于桉樹的研究比較系統(tǒng)全面，主要研究方向集中在桉樹的栽培繁殖技術(shù)、病蟲害管理防治、土壤的理化性質(zhì)、生態(tài)及生物多樣性等，對(duì)于桉樹根際土壤真菌多樣性的研究不多見[3]。本研究以云南景谷地區(qū)不同海拔人工桉樹林地根際土壤作為研究對(duì)象，采用高通量測(cè)序方法，對(duì)土壤樣品進(jìn)行DNA提取、擴(kuò)增、測(cè)序及數(shù)據(jù)處理，分析不同海拔桉樹林根際土壤真菌群落多樣性、群落組成和豐富度情況，以期為景谷當(dāng)?shù)亻L(zhǎng)期種植桉樹造成的生態(tài)效應(yīng)修復(fù)提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 研究地概況

本次研究樣地位于云南普洱景谷縣（東經(jīng)100°02′～101°07′、北緯22°49′`23°52′）。景谷縣位于回歸線附近，屬于南亞熱帶地區(qū)，地勢(shì)以山地高原為主，海拔在600m～2 920m之間，年降水量為1 354mm、平均雨日數(shù)164.1d、平均氣溫22.1℃，年平均日照時(shí)數(shù)2 065.3h。景谷縣林業(yè)用地有874.9萬畝，占總面積的77.5%，桉樹就是景谷地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)林。

1.2 樣品采集及處理

樣品采于2022年1月，在研究樣地內(nèi)，土壤樣品采自景谷縣內(nèi)的人工桉樹林根際土壤，在向陽坡面設(shè)置兩個(gè)不同海拔梯度，A1（1 056m），A2（1 156m），在每個(gè)海拔隨機(jī)選取5個(gè)25m×25m樣方，每個(gè)樣方內(nèi)選用“五點(diǎn)”采樣法采樣，去除表層土壤，取5-10cm深的桉樹根際土樣，將五個(gè)小點(diǎn)的土樣混合為一個(gè)土樣，最后將5個(gè)樣方的土樣混合，按四分法土樣作為實(shí)驗(yàn)樣品，總共取得2個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品，分別封入無菌塑封袋并置于4℃冰盒中，立即將樣品送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步處理[4]。

1.3 土壤真菌DNA提取和測(cè)序

1.3.1 土壤真菌DNA提取PCR擴(kuò)增16srRNA基因

根據(jù)E.Z.N.a.土壤DNA試劑盒（Omega，美國(guó)）進(jìn)行土壤微生物總基因組DNA提取，為了確保提取過程中得到足夠數(shù)量和高質(zhì)量的基因組DNA，使用Quabit 2.0（美國(guó)life）測(cè)量DNA濃度。對(duì)微生物ITS1-ITS2高變區(qū)進(jìn)行itsS rRNA基因的提取，PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增子PCR正向引物為：CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA；反向引物為：GCTGCGTTCTTCATCGATGC。提取的DNA2ul（10ng/μl），擴(kuò)增子正反向引物各1ul（10uM），進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)征程序如下：95℃三分鐘變性1個(gè)周期，95℃30秒變性5個(gè)周期，45℃下退火30S，72℃下延伸30S，95℃下變性20個(gè)周期30S，55℃下退火30S，72℃下延伸30S，72℃下最終延伸5分鐘。在TBE緩沖液中，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物，用溴化乙錠（EB）染色，在紫外光下觀察[5-6]。

1.3.2 ITS基因文庫的構(gòu)建、量化和測(cè)序

該階段由生工生物公司（上海）完成。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將測(cè)序得到的PE reads先根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，區(qū)分樣本后對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾，然后進(jìn)行OTU聚類（ASV去噪）分析和物種分類學(xué)分析?；贠TU聚類（ASV去噪）分析結(jié)果，對(duì)OTU（ASV)進(jìn)行多樣性指數(shù)分析，在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 桉樹根際土壤真菌測(cè)序結(jié)果

對(duì)采集的兩個(gè)不同海拔人工桉樹林根際土壤樣品進(jìn)行測(cè)序，按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列（不含單序列）進(jìn)行OTU聚類，將所有優(yōu)化序列比對(duì)至OTU代表序列，選出與代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格，結(jié)果見表1。

表1 不同海拔人工桉樹林根際土壤真菌OTU測(cè)序結(jié)果

2.2 桉樹根際土壤真菌OTU結(jié)果分析

以O(shè)TU水平為例對(duì)兩個(gè)樣品進(jìn)行處理后，繪制Venn圖（圖1），共統(tǒng)計(jì)出人工桉樹林下兩個(gè)土壤樣品共有761個(gè)OTUs，由圖1可知兩個(gè)樣品包含的OTU數(shù)目分別為A1樣品465個(gè)，A2樣品553個(gè)，A2樣品OTUs數(shù)目相對(duì)多。257個(gè)OTUs為兩個(gè)樣品共有，每個(gè)樣品都有接近50%的OTUs相同，樣品1和2的真菌群落組成和重疊量有一半相同。

圖1 不同海拔人工桉樹林根際土壤真菌OTU韋恩圖

2.3 桉樹根際土壤真菌相對(duì)豐富度分析

為了研究桉樹林下土壤中真菌的物種組成和多樣性，進(jìn)行OTU聚類分析，根據(jù)OTU聚類分析，使用統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析方法，以縱坐標(biāo)為桉樹根際真菌相對(duì)豐度值，測(cè)A1、A2樣本在不同分類水平上的群落結(jié)構(gòu)和所占比例得出相應(yīng)數(shù)據(jù)和圖表（圖2、表2）。由圖2可知，兩個(gè)樣品經(jīng)測(cè)序后共統(tǒng)計(jì)得到3個(gè)門類的真菌群落，不包含其他未統(tǒng)計(jì)的門類（樣本中豐度占比均小于一定比例1%的物種歸為其他）。林忠鑫[5]等人從不同連載代次桉樹人工林土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性研究中共統(tǒng)計(jì)得到真菌門類為11門，物種差距可能是由于樣品采集季節(jié)和數(shù)量不一樣導(dǎo)致。A2樣品物種和數(shù)量較A1相對(duì)均衡。根據(jù)表2可知，A1樣品的優(yōu)勢(shì)門類真菌為子囊菌門，占整個(gè)A1樣品中總真菌群落豐富度的86.2%，A2樣品的子囊菌門占33.7%，A1樣品顯著高于A2樣品。A2樣品的優(yōu)勢(shì)門類真菌為擔(dān)子菌門，占A2樣品總真菌群落豐富度的37.96%，而A1樣品擔(dān)子菌門占比為12.25%，A2樣品的擔(dān)子菌門顯著高于A1樣品。通過以上數(shù)據(jù)得知，子囊菌門和擔(dān)子菌門為人工桉樹林根際土壤真菌群落的優(yōu)勢(shì)物種。不同的海拔梯度，其優(yōu)勢(shì)物種的數(shù)量和豐富度不一樣。

圖2 不同海拔梯度桉樹林下土壤真菌相對(duì)豐度柱狀圖

表2 不同海拔梯度桉樹林下土壤真菌主要菌門相對(duì)豐度統(tǒng)計(jì)表

2.4 不同海拔梯度桉樹林下根際土壤真菌系統(tǒng)組成樹狀圖

根據(jù)兩個(gè)樣本的分類學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，對(duì)優(yōu)勢(shì)門類進(jìn)行分類，對(duì)優(yōu)勢(shì)真菌群落進(jìn)行進(jìn)化關(guān)系和豐富度差異分析，構(gòu)建真菌系統(tǒng)組成樹狀圖，具體結(jié)果見圖3、圖4。由圖可知，A2樣品的親緣分類較A1樣品更豐富，A2樣品第一親緣關(guān)系有三個(gè)分支，三個(gè)分支的均勻度相對(duì)平均，A1樣品為兩個(gè)分支，兩個(gè)分支均勻度不一，由此可知，A2樣品的真菌群落較A1樣品的真菌群落豐富度和物種較平均。

圖3 海拔1056m樣品A1真菌群落組成樹狀圖

圖4 海拔1156m樣品A2真菌群落組成樹狀圖

2.5 不同海拔梯度桉樹林下根際土壤Alpha多樣性

不同的海拔梯度模式會(huì)顯著影響桉樹人工林根際土壤真菌群落的多樣性和豐富度（P＜0.01，表3）。Chao指數(shù)和Ace指數(shù)均為A2樣品高于A1樣品，說明海拔越高土壤中真菌豐富度越高（表3）。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映土壤微生物的群落物種分布多樣性，A2樣品的Shannon指數(shù)為3.83，高于A1樣品的1.60，A2樣品的Simpson指數(shù)為0.07低于A1樣品0.54，兩個(gè)指數(shù)表現(xiàn)有差異。

表3 不同海拔梯度桉樹林下根際土壤真菌各樣本多樣性指數(shù)結(jié)果

3 討論

通過對(duì)云南景谷地區(qū)不同海拔梯度人工桉樹林下根際土壤進(jìn)行高通量測(cè)序和相關(guān)性分析，對(duì)兩份土樣的微生物真菌群落結(jié)構(gòu)和數(shù)量特征進(jìn)行分析，土壤微生物數(shù)量和種類作為土壤生態(tài)環(huán)境健康程度的重要指標(biāo)，對(duì)土壤生態(tài)環(huán)境有很重要的影響。

本研究結(jié)果顯示，海拔高度1 156m（A2樣品）的物種較海拔高度1 056m（A1樣品）豐富且生物量相對(duì)均衡；海拔高度1 056m（A1樣品）的物種較海拔高度1 156m（A2樣品）生物量較高，主要集中在子囊菌門，造成此結(jié)果的原因可能是因?yàn)楹０胃?，溫度較低，桉樹林下有機(jī)物質(zhì)分解速率慢，養(yǎng)分代謝活動(dòng)相對(duì)慢，保存的土壤養(yǎng)分較低海拔的豐富，能滿足更多的微生物生長(zhǎng)需要。而海拔相對(duì)較低的樣地，溫度相對(duì)較高，土壤生物活動(dòng)活躍，土壤有機(jī)質(zhì)代謝頻繁，長(zhǎng)期可能造成土壤里的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)降低，導(dǎo)致土壤貧瘠。桉樹人工林長(zhǎng)期種植后，會(huì)改變土壤理化性質(zhì)，影響土壤水分和養(yǎng)分，使土壤微生物種類和數(shù)量特征發(fā)生變化[7-8]，海拔相對(duì)不是很高，溫差不大時(shí)，海拔高的桉樹林根際土壤養(yǎng)分更高[9]。另外，低海拔地區(qū)的人工桉樹林人為活動(dòng)頻繁，日常的生產(chǎn)生活干擾較多，而高海拔地區(qū)的人工桉樹林人為干擾較少，導(dǎo)致了高海拔地區(qū)的微生物和生物量比低海拔地區(qū)的豐富。

研究結(jié)果顯示，人工桉樹林土壤根際真菌物種多樣性不豐富，與其他非桉樹林土壤微生物多樣性差別較大[10]。土壤微生物的多樣性指數(shù)與土壤的理化性質(zhì)息息相關(guān)，微生物是土壤養(yǎng)分的核心成員，長(zhǎng)期的桉樹種植對(duì)土壤破壞很大，桉樹快速生長(zhǎng)的同時(shí)大量吸取了周圍土壤的水分和養(yǎng)料，對(duì)生態(tài)環(huán)境造成了一定的影響，會(huì)抑制桉樹林下層的植物，造成植物種類的減少，從而影響生物的種類。

4 結(jié)論

景谷地區(qū)因長(zhǎng)期種植經(jīng)濟(jì)樹種桉樹，由于桉樹的化感作用和快速生長(zhǎng)的同時(shí)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成了很大的影響，本研究通過對(duì)人工桉樹林下根際土壤真菌進(jìn)行多樣性分析，得出以下結(jié)論：景谷地區(qū)桉樹林下土壤真菌門類單一，生物量不豐富。