可變剪接在植物免疫中的研究進(jìn)展

姜炎柯 路沖沖 尹梓屹 李洋 丁新華

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，泰安 271018）

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中會(huì)受到周圍生物的影響，這些相互作用可能會(huì)影響植物的繁殖力、產(chǎn)量和壽命［1］。植物需要快速有效地對(duì)各種外部脅迫（如病原菌和取食昆蟲）做出反應(yīng)，植物免疫系統(tǒng)已經(jīng)進(jìn)化出誘導(dǎo)型和結(jié)構(gòu)型免疫，過去的幾十年里，植物免疫的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子被廣泛研究。近年來，研究表明前體mRNA的可變剪接（alternative splicing，AS）是生物體免疫過程的重要參與者，它通過調(diào)節(jié)基因組序列產(chǎn)生特定轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組來響應(yīng)不同的外界條件［2-4］。因此，本文總結(jié)了近年來可變剪接在植物防御病害過程中的作用，并對(duì)未來的研究進(jìn)行了展望。

1 可變剪接

大多數(shù)真核生物的基因由外顯子和內(nèi)含子組成，不能連續(xù)翻譯。基因轉(zhuǎn)錄后的前體mRNA會(huì)進(jìn)行剪切，去除內(nèi)含子并保留外顯子，這是基因表達(dá)的關(guān)鍵一步。在真核細(xì)胞前體mRNA加工過程中，選擇單個(gè)基因中不同的剪切位點(diǎn)對(duì)前體mRNA進(jìn)行剪切，構(gòu)建多個(gè)成熟mRNA亞型的過程稱為可變剪接［5］?？勺兗艚邮且粋€(gè)重要的轉(zhuǎn)錄后過程，保守的剪切過程中剪切位點(diǎn)單一，僅能產(chǎn)生一組mRNA，可變剪接由于保留的內(nèi)含子或選擇的剪切位點(diǎn)不同可以產(chǎn)生多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，通過增加轉(zhuǎn)錄多樣性提高基因組的編碼能力［6］，豐富基因的多種轉(zhuǎn)錄亞型，從而增加基因組編碼的功能性蛋白數(shù)量，是動(dòng)植物轉(zhuǎn)錄組和蛋白組多樣化的重要因素。

前體mRNA剪切是一個(gè)復(fù)雜的過程。在剪切過程中，非編碼內(nèi)含子序列被剪切體（一種大型核糖體蛋白復(fù)合物）識(shí)別并從前體mRNA中去除。一個(gè)完整的核糖體蛋白復(fù)合體由5個(gè)高度保守的小核核糖核蛋白（small nuclear ribonucleoprotein，snRNPs：U1，U2，U4，U5和 U6） 和 300多 個(gè) 蛋 白 質(zhì) 組成［7］，例如富絲氨酸/精氨酸蛋白（serine/argininerich protein，SR）、異質(zhì)核核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNPs）、RNA結(jié)合蛋白（RNA binding protein，RBPs）［8］。除了 snRNPs之外，許多非snRNPs，如剪切因子SF1/mBBP和U2AF參與剪切體組裝前期3′位點(diǎn)的識(shí)別［9］。可變剪接的結(jié)果取決于幾個(gè)因素：（1）剪切位點(diǎn)的識(shí)別和選擇，剪切位點(diǎn)的選擇多變性取決于細(xì)胞類型、生長(zhǎng)時(shí)期和外界影響［10］；（2）前體mRNA順式調(diào)控序列刺激或抑制外顯子識(shí)別；（3）反式作用因子（如RNA結(jié)合蛋白R(shí)BPs和剪切因子SFs）的活躍度，以及這些反式作用因子的表達(dá)水平、穩(wěn)定性也能夠調(diào)節(jié)可變剪接［11］。

可變剪接共有5種形式：內(nèi)含子保留（intron retention，IR）、外顯子跳讀（exon skip，ES）、外顯子互斥（mutual exclusive exon，MXE）以及可變性3′剪切位點(diǎn)（alternative 3′ site，AA）和可變性5′剪切位點(diǎn)（alternative 5′ site，AD）。不同的剪切模式在不同物種中發(fā)生頻率不同。在動(dòng)物中，外顯子跳讀發(fā)生的頻率較高而內(nèi)含子保留發(fā)生的頻率低；相比之下，在擬南芥、玉米等植物中內(nèi)含子保留是最常見的形式，而外顯子跳讀只占很小一部分［12］。不同模式的可變剪接會(huì)導(dǎo)致蛋白功能的差異，外顯子跳讀、可變性5′剪切位點(diǎn)和可變性3′剪切位點(diǎn)編碼較復(fù)雜的功能蛋白質(zhì)，如改變氨基酸C端、在框架內(nèi)添加或去除功能單位。這些不同類型的可變剪接都可能對(duì)蛋白的亞細(xì)胞定位、結(jié)合性質(zhì)、活性和穩(wěn)定性產(chǎn)生影響［13-14］。

可變剪接主要發(fā)揮兩大分子功能。一方面，它可以產(chǎn)生兩種或兩種以上不同的蛋白質(zhì)亞型，這些亞型在某些情況下表現(xiàn)出完全不同的功能特性。另一方面，通過破壞基因的開放閱讀框（open reading frame，ORF）產(chǎn)生截?cái)嗟牡鞍踪|(zhì)亞型［15］或觸發(fā)無義介導(dǎo)的mRNA降解（nonsense-mediated decay，NMD）導(dǎo)致基因表達(dá)下調(diào)［16］。由于每個(gè)譜系中可變剪接類型的比例不同，動(dòng)物中與外顯子跳讀相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)具有更高的相關(guān)性，而在植物中，研究重點(diǎn)主要集中在通過保留含有無義介導(dǎo)的mRNA降解的內(nèi)含子來調(diào)控基因表達(dá)［17-19］。除少數(shù)特殊情況外，可變剪接的受體和配體對(duì)基因功能的影響在任何物種中都尚未得到徹底的研究［20-21］。

2 可變剪接在動(dòng)植物中的研究

在動(dòng)物中，95%基因的前體mRNA會(huì)進(jìn)行可變剪接產(chǎn)生多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，可變剪接在人類疾病上的研究十分廣泛，與許多生命活動(dòng)以及疾病相關(guān)聯(lián)，mRNA的剪切缺陷是人類疾病的主要原因，目前估計(jì)有高達(dá)60%的缺陷與前體mRNA剪切有關(guān)［22］。大量人類疾病的研究結(jié)果表明，可變剪接在生物學(xué)上的重要性由mRNA中順式作用元件和剪切機(jī)制的某些調(diào)節(jié)因子的突變決定［22］。除了單基因疾病，可變剪接的遺傳變異也是復(fù)雜疾病和癌癥的重要因素。大多數(shù)與疾病相關(guān)的剪切缺陷是單個(gè)基因的順性變異，如破壞剪切位點(diǎn)或位于內(nèi)含子或外顯子中的剪切調(diào)控元件。另外，無意義或沉默的外顯子突變也通常影響剪切。剪切因子、剪切體成分和剪切體裝配因子的突變通常會(huì)導(dǎo)致加工過程中存在缺陷的前體mRNA可變剪接頻率增加［23-24］。

與在動(dòng)物中的大量研究相比，在植物中可變剪接的流行、分子功能和調(diào)控的研究較少。多項(xiàng)研究表明，可變剪接在植物中普遍存在，在擬南芥［25］和水稻［26］中超過60%和48%的前體mRNA會(huì)發(fā)生可變剪接［27］，脅迫條件下可變剪接會(huì)出現(xiàn)更多新的剪切位點(diǎn)［28-30］，在環(huán)境中受到脅迫的植物可能存在更高的可變剪接頻率。這些比例高于果蠅（20%-37%［31］），但低于人類，人類幾乎每個(gè)多外顯子基因都是選擇性剪切的［32-33］。此外，近年來對(duì)植物系統(tǒng)中可變剪接的研究越來越多，但迄今為止大多數(shù)研究都集中在單個(gè)基因和可變剪接在特定環(huán)境條件下的調(diào)控，通常是對(duì)單個(gè)脅迫條件的響應(yīng)［34-35］，這與動(dòng)物形成了鮮明對(duì)比，大多數(shù)對(duì)動(dòng)物的研究都集中在組織特異性調(diào)控和疾病狀態(tài)［36-37］。這些在植物和動(dòng)物研究重點(diǎn)上的差異可能導(dǎo)致我們理解可變剪接在每個(gè)物種中的角色和屬性方面存在偏向。所以綜合研究可變剪接在植物應(yīng)激環(huán)境脅迫方面的信息仍然缺乏?？勺兗艚釉谥参锉姸嗌磉^程中起著重要作用。在微生物侵染植物的過程中，植物能夠快速有效地啟動(dòng)自身免疫來響應(yīng)病原菌的侵染，這其中包括調(diào)節(jié)大量抗病基因的表達(dá)，尤其是可變剪接在調(diào)控抗病基因過程中起著重要作用。

3 免疫受體基因可變剪接調(diào)控植物免疫反應(yīng)

為應(yīng)對(duì)環(huán)境中的病原物侵染，植物進(jìn)化出兩種防御信號(hào)路徑，即病原相關(guān)分子模式觸發(fā)的免疫（PAMP or MAMP-triggered immunity，PTI） 和效應(yīng)分子觸發(fā)的免疫（effector-triggered immunity，ETI），PTI由細(xì)胞模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRRs）識(shí)別［38］。植物表面模式受體經(jīng)可變剪接產(chǎn)生不同轉(zhuǎn)錄本，通過影響下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)響應(yīng)病原侵染。細(xì)菌鞭毛蛋白2（Flagellin-Sensing2，F(xiàn)LS2）是一個(gè)經(jīng)典的PRR受體蛋白，在植物感知外界細(xì)菌侵染時(shí)它可以檢測(cè)保守的細(xì)菌鞭毛蛋白flg22啟動(dòng)一系列的免疫響應(yīng)。研究表明，在9個(gè)科的雙子葉植物中，F(xiàn)LS2的第一個(gè)外顯子發(fā)生了可變剪接。剪切的位置和效率主要取決于FLS2的核苷酸序列。FLS2的外顯子通過內(nèi)含子介導(dǎo)的增強(qiáng)機(jī)制（intron mediated enhancement，IME）調(diào)控轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的積累，變換的轉(zhuǎn)錄本能夠編碼FLS2通路抑制子，影響FLS2介導(dǎo)的活性氧產(chǎn)生。該研究揭示了可變剪接精細(xì)調(diào)控模式識(shí)別受體從而影響下游抗病響應(yīng)［39］。

植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化中，與周圍環(huán)境中廣泛的微生物互作，當(dāng)植物遭受病原菌侵染時(shí)能夠阻斷病原菌進(jìn)一步侵染自身并傳遞一系列免疫信號(hào)，植物這一抵抗病原物侵染的能力叫做植物獲得系統(tǒng)性抗性（systemic acquired resistance，SAR）［40-43］。在植物體內(nèi)，SAR由水楊酸信號(hào)路徑調(diào)控。NPR1是擬南芥中水楊酸信號(hào)路徑的受體，也是多個(gè)抗性信號(hào)通路的交叉點(diǎn)。擬南芥NPR1功能缺失突變體npr1的PR基因表達(dá)降低并且SAR發(fā)生發(fā)展的能力喪失，回補(bǔ)npr1突變體得到snc（suppressor of npr1-1，constitutive）系列突變體能夠一定程度恢復(fù)這兩種能力［44］。董欣年、華健、李昕等實(shí)驗(yàn)室對(duì)SNCs進(jìn)行基因克隆并對(duì)其功能性狀進(jìn)行了研究，證明SNCs具有抗病功能，在植物防御生物脅迫時(shí)具有重要作用。之后，李欣團(tuán)隊(duì)克隆了SNCs的修飾因子 MOS（MODIFIER OF SNC1），MOS參與抗病基因和抗病調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄本的剪切過程，其中，MOS2和MOS14是SNC1轉(zhuǎn)錄本正確剪切所必需，MOS12編碼一個(gè)與人類細(xì)胞周期蛋白L同源的富精氨酸蛋白，MOS12-1缺失導(dǎo)致SNC1和RPS4剪切模式改變，這表明，R基因RPS4的正確剪切需要MOS12。MOS12能與MOS4所在復(fù)合物（MAC）結(jié)合，而大多數(shù)MAC核心缺失突變體能夠改變SNC1和RPS4的剪切模式。該研究強(qiáng)調(diào)了MOS12和MAC在R基因選擇性剪切中的貢獻(xiàn)，揭示了可變剪接在植物免疫中如何精準(zhǔn)調(diào)控R基因表達(dá)。研究說明MAC復(fù)合體控制SNCs或PAMP受體基因轉(zhuǎn)錄本可變剪接，從而調(diào)控PTI和ETI信號(hào)傳導(dǎo)［45］。

植物免疫相關(guān)受體屬于受體類蛋白激酶（receptor-like kinase，RLK）家族，在識(shí)別微生物病原體和激活下游防御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。擬南芥突變體SNC4-1D包含一個(gè)RLK SNC4（NPR1-1的抑制因子，CONSTITUTIVE4）的功能獲得突變，它導(dǎo)致防御反應(yīng)的組成型激活。通過對(duì)snc4-1D突變體的分析，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)保守的剪切因子SUA（ABI3-5抑制基因）和RSN2（SNC4-1D必需基因），它們是SNC4-1D構(gòu)建防御反應(yīng)所必需的。在sua和rsn2突變體中，SNC4剪切發(fā)生改變，使SNC4轉(zhuǎn)錄本數(shù)量減少。進(jìn)一步的分析表明，SUA和RSN2是剪切CERK1（PAMP的重要受體幾丁質(zhì)誘導(dǎo)子受體激酶1）所必需的重要剪切因子，前體mRNA剪切在受體類蛋白激酶 SNC4和CERK1介導(dǎo)的植物免疫調(diào)節(jié)中起著重要作用［46］。

4 R基因可變剪接精確調(diào)控植物免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

針對(duì)病原體的效應(yīng)因子，植物會(huì)產(chǎn)生R蛋白識(shí)別部分效應(yīng)因子（無毒蛋白，avr-R）來產(chǎn)生一系列防御效應(yīng)。效應(yīng)蛋白通常具有核苷酸結(jié)合位點(diǎn)-富含亮氨酸重復(fù)序列（nucleotide binding site-leucine rich repeat，NBS-LRR）結(jié)構(gòu)域，引起第二層防御效應(yīng)分子觸發(fā)的免疫ETI［47］。ETI由胞內(nèi)R蛋白感知特異病原物效應(yīng)子觸發(fā)，R蛋白由R基因調(diào)控。R基因包括三個(gè)主要元件：一個(gè)N端結(jié)構(gòu)域，類似于果蠅Toll防御基因和人類白細(xì)胞介素-1受體基因TIR編碼的蜷曲結(jié)構(gòu)域、一個(gè)包含核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（nucleotide binding domain，NB）的中心區(qū)域、一個(gè)包含富亮氨酸重復(fù)序列的C端結(jié)構(gòu)域。R蛋白的不同結(jié)構(gòu)域與不同的病原物效應(yīng)因子直接或間接互作［48］。R基因激發(fā)的免疫反應(yīng)在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后都必須受到嚴(yán)格的控制。許多植物抗病R基因具有可變剪接，并且一些R基因需要選擇性剪切轉(zhuǎn)錄本來產(chǎn)生特異性識(shí)別病原體入侵的R蛋白。R蛋白激活的過程中，可變剪接產(chǎn)生的截?cái)鄟喰涂赡芡ㄟ^抑制免疫啟動(dòng)的負(fù)調(diào)控或直接調(diào)控效應(yīng)因子觸發(fā)信號(hào)參與植物抗病。截?cái)嗟牡鞍踪|(zhì)可能通過減輕完整蛋白的自我抑制來促進(jìn)R基因功能，或者截?cái)嗟牡鞍踪|(zhì)可能干擾下游信號(hào)傳導(dǎo)［49-50］。

許多物種的R基因經(jīng)過可變剪接形成不同的異構(gòu)轉(zhuǎn)錄本，如煙草 N［51］、亞麻 L6 和 M［52］、擬南芥 SNC1、RPS4、RPS6、RPP5 和 RAC1［53-57］、 番茄 Bs4［58］、馬鈴薯 Y-1［59］和苜蓿 RCT1［60］。但可變剪接對(duì)R基因產(chǎn)生功能影響的并不多，包括擬南芥RPS4、煙草N和苜蓿RCT1。擬南芥RPS4能夠感知表達(dá)AvrRps4的菌株P(guān)st.DC3000并對(duì)其產(chǎn)生抗性，RPS4經(jīng)過可變剪接產(chǎn)生6個(gè)不同轉(zhuǎn)錄本。在侵染后，完整轉(zhuǎn)錄本的RPS4表達(dá)上調(diào)，而克隆不完整轉(zhuǎn)錄本不能回補(bǔ)缺失RPS4植株對(duì)Pst.DC3000的抗性，這表明只有完整的RPS4轉(zhuǎn)錄本才能對(duì)Pst.DC3000產(chǎn)生抗性［51］。在煙草中，N基因特異地識(shí)別煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）的一個(gè)50 kD解旋酶蛋白（p50），并選擇性地剪切N基因［61-62］。除了主要的亞型（NRT），另一種亞型（NAT）是通過內(nèi)含子3中的一個(gè)包含終止密碼子的外顯子生成的。與RPS4類似，在TMV感染期間也觀察到NRT與NAT的動(dòng)態(tài)變化［50］。雖然NRT在感染前占優(yōu)勢(shì)，但在TMV接種6 h后NAT亞型更為豐富，接種9 h后NAT再次高度表達(dá)。干擾NRT與NAT的比例會(huì)導(dǎo)致煙草對(duì)TMV抗性下降。NAT轉(zhuǎn)錄本比例的增加可能是NRT和p50相互作用導(dǎo)致的信號(hào)級(jí)聯(lián)引起的。由于剪切變異不斷積累，誘導(dǎo)可變剪接可能通過反饋抑制調(diào)節(jié)N基因的功能。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，僅表達(dá)NRT的煙草轉(zhuǎn)化體表現(xiàn)出HR延遲的不完全抗性［63］，這表明N基因介導(dǎo)的抗性需要NAT。

另一個(gè)例子是苜蓿（Medicago truncatula）的RCT1基因，它能抵抗真菌病原菌Colletotrichum trifoliio18的多個(gè)小種。RCT1是完整基因4號(hào)內(nèi)含子保留的一種形態(tài)，另一種亞型（RCT1AT）可能編碼一個(gè)截?cái)嗟牡鞍踪|(zhì)，缺少正常RCT1蛋白（RCT1RT）的C端結(jié)構(gòu)域。雖然RCT1轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)是穩(wěn)定的，并且不受病原體感染的影響，但是研究發(fā)現(xiàn)RCT1AT的一個(gè)特定的表達(dá)閾值是有效抗性的關(guān)鍵［64］。目前已知NB-LRR型的R基因在不同的位點(diǎn)發(fā)生剪切［65］，但其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。圍繞R基因可變剪接的功能研究將需要更多的創(chuàng)新技術(shù)。

最新研究發(fā)現(xiàn)，小麥白粉病小種特異性抗病基因Pm4發(fā)生可變剪接產(chǎn)生兩種不同結(jié)構(gòu)的蛋白異構(gòu)體，這兩種異構(gòu)體都對(duì)小麥抵抗白粉病的侵染起著重要作用。Pm4基因編碼擁有色氨酸/蘇氨酸的激酶類蛋白，Pm4b基因存在多個(gè)假定可變剪切位點(diǎn)，該基因的第6和第7個(gè)外顯子不兼容可變剪切，產(chǎn)生兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本編碼C端結(jié)構(gòu)域差異的嵌合蛋白。進(jìn)一步分析顯示，在白粉病侵染過程中Pm4b基因兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本被抑制，隨后將Pm4b穩(wěn)定轉(zhuǎn)化到感病品種中發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本共存是感病品種獲得抗性所必需。在白粉病菌入侵時(shí)，Pm4與病原菌分泌到宿主細(xì)胞內(nèi)的AvrPm4形成復(fù)合體，改變其構(gòu)象，激活激酶活性和強(qiáng)烈的抗病反應(yīng)，并引發(fā)植物過敏反應(yīng)（hypersensitive response，HR），這種小種特異受體賦予了種族特異性免疫［66］，而作物寄主抗性對(duì)控制病害發(fā)生和減少農(nóng)藥污染十分重要［67］。

5 激素信號(hào)路徑關(guān)鍵基因的可變剪接調(diào)節(jié)植物免疫反應(yīng)

植物激素是植物適應(yīng)外界環(huán)境的關(guān)鍵因子。復(fù)雜的激素信號(hào)網(wǎng)絡(luò)及其相互影響使其成為調(diào)節(jié)防御反應(yīng)的中心節(jié)點(diǎn)［68］。許多研究證明，水楊酸（salicylicacid，SA）、茉莉酸素（jastonates，JA）、乙烯（ethylene，ET）3種激素在誘導(dǎo)防御信號(hào)路徑中具有重要的信號(hào)傳導(dǎo)作用［69-71］。其他激素如脫落酸（abscisicacid，ABA）、油菜素甾體素（brassinosteroids，BL）、赤霉素（gibberellins，GA）、生長(zhǎng)素（auxins）、細(xì)胞激動(dòng)素（cytokinins，CK）也在植物對(duì)病原防御中起作用［72-76］。當(dāng)病原菌入侵時(shí)，植物體感知外界侵染或刺激在體內(nèi)合成多種類型激素，激素在植物體內(nèi)不斷積累達(dá)到信號(hào)平衡，調(diào)節(jié)各種防御反應(yīng)的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)［77］?？勺兗艚右泊嬖谟谥参锛に匦盘?hào)路徑中，如激素合成基因、激素路徑中的重要調(diào)控因子會(huì)發(fā)生可變剪接，剪接形成的不同轉(zhuǎn)錄本在相應(yīng)的外界環(huán)境脅迫下發(fā)生轉(zhuǎn)換，使激素信號(hào)穩(wěn)態(tài)的重建來誘導(dǎo)植物防御。

植物激素茉莉酸不僅在植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控中起著重要作用，而且在生物脅迫響應(yīng)中也起著重要作用［78］。在茉莉酸信號(hào)通路中，其中一個(gè)主要調(diào)控機(jī)制是茉莉酸基因的轉(zhuǎn)錄抑制因子JAZ（jasmonate ZIM-domain，JAZ）剪接變體使 JA信號(hào)通路的失活［79］。轉(zhuǎn)錄抑制子能夠調(diào)控防御基因的表達(dá)，研究表明，大多數(shù)植物的JAZ基因都有一個(gè)保守的內(nèi)含子，可以將JAZ基因分成兩部分。在擬南芥JAZ家族中，大多數(shù)JAZ都保留內(nèi)含子［80］。然而，一些JAZs含有N端MYC相互作用域，但不招募SCFCOI1（COI1與多種蛋白形成的泛素連接酶復(fù)合體）［81］。JAZ10產(chǎn)生3種C端不同的剪切體，在JA存在的情況下，它與COI1結(jié)合強(qiáng)，而截?cái)嗟霓D(zhuǎn)錄本與COI1相互作用弱或不互作。因此，這3種亞型都保留了結(jié)合MYC TF和抑制MYC靶基因表達(dá)的能力，但都部分或完全抵抗JA誘導(dǎo)的降解［82-84］。由于這些JAZs變異可以在JA存在時(shí)積累，它們能夠抑制MYC TFs導(dǎo)致JA脫敏和信號(hào)穩(wěn)態(tài)的重建。雖然JAZ可以產(chǎn)生多種剪接變體來響應(yīng)JA信號(hào)，但植物如何調(diào)控產(chǎn)生適量水平的JAZ剪接變體從而避免過多或者難以平衡的JA信號(hào)仍然尚不清楚。最近有研究發(fā)現(xiàn)JAZ的各類剪切體依賴于亞基MED25，并且MED25可以招募剪切因子PRP39a和PRP40a從而降低JAZ剪切體的表達(dá)水平。MED25-PRP39a/PRP40a功能模塊可以通過促進(jìn)JAZ內(nèi)含子的完全剪切從而抑制茉莉酸信號(hào)的過度失活，調(diào)控茉莉酸信號(hào)通路的MYC2轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，進(jìn)而控制該信號(hào)通路的強(qiáng)度［85］。

另一種參與響應(yīng)生物脅迫的關(guān)鍵激素是SA，它對(duì)植物建立系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）至關(guān)重要［86］。最近的一項(xiàng)研究中，在蘋果基因組中發(fā)現(xiàn)了8個(gè)NPR1同源物，并通過RT-PCR克隆了12個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄本，證明了可變剪接事件的存在［87］。MdNPR1基因被發(fā)現(xiàn)與AtNPR1高度同源，MdNPR1產(chǎn)生兩種亞型MdNPR1a和b，這兩種亞型的相對(duì)豐度可以調(diào)節(jié)SA信號(hào)。但MdNPR1a只能在敏感的太平洋玫瑰品種中檢測(cè)到［88］，因此需要進(jìn)一步的研究來評(píng)估SA信號(hào)成分的可變剪接是否在其他作物和植物物種中廣泛存在。

油菜素內(nèi)酯（BRs）是一類類固醇植物激素，它控制植物內(nèi)部的多種發(fā)育過程［89］，也作為植物先天免疫的負(fù)調(diào)節(jié)因子。最近的一項(xiàng)研究表明，在BRs信號(hào)成分中，BES1和BRZ1轉(zhuǎn)錄因子是參與BRs信號(hào)基因調(diào)控的主要因子［90］。BES1在flg22刺激時(shí)磷酸化，是PTI過程中MPK6的直接靶點(diǎn)。BES1的失活導(dǎo)致BRs信號(hào)傳遞受損，可導(dǎo)致植物對(duì)丁香假單胞菌的抗性下降［91］。另一項(xiàng)研究表明，BES1可以產(chǎn)生兩種亞型，BES1- S和BES1- L，在其N端有一個(gè)額外的NLS結(jié)構(gòu)域。BES1-L只能在擬南芥種檢測(cè)到，表明這種可變剪接可能只存在于擬南芥中［92］，BES1- L亞型在生物脅迫應(yīng)答中的作用以及BES1剪切變異是否在其他物種中也存在還需要進(jìn)一步研究。作為JA、SA和BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的特定調(diào)節(jié)劑，可變剪接通過影響該網(wǎng)絡(luò)調(diào)控植物免疫。

6 剪切因子調(diào)控植物免疫

在生物體內(nèi)，不同剪切位點(diǎn)的選擇是由剪切體和其他蛋白質(zhì)相互作用決定的，這些蛋白質(zhì)被統(tǒng)稱為剪切因子（splicing factors，SFs），它們決定剪切體的成分，引導(dǎo)剪切體到達(dá)特定的剪切位點(diǎn)［93］。對(duì)酵母和人剪切體進(jìn)行體外研究發(fā)現(xiàn)剪切體相關(guān)蛋白種類十分龐大，例如，酵母剪切體含有超過300種蛋白，在動(dòng)物和植物中，許多SFs/RNA結(jié)合蛋白和一些核心剪切體成分通過可變剪接響應(yīng)信號(hào)，甚至通過可變剪接控制自身和其他SFs的水平［94-95］。此外，SFs可以通過翻譯后修飾來調(diào)節(jié)外界環(huán)境響應(yīng)［96］，剪切因子對(duì)植物抗病的調(diào)控是通過宿主免疫信號(hào)通路影響多個(gè)下游靶基因的可變剪接或影響網(wǎng)絡(luò)傳遞信號(hào)從而改變基因表達(dá)。

在植物中，大多剪切相關(guān)蛋白是磷酸化信號(hào)傳遞的靶標(biāo)［97］，一些剪切相關(guān)蛋白能夠在體外被絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）磷酸化［98-99］。某些SFs攜帶能夠被鈣依賴蛋白激酶（calcium-dependent protein kinases，CDPKs）和MAPKs磷酸化的位點(diǎn)，在PAMPs的作用下能夠被磷酸化［100］。最近有研究表明，磷酸化的SFs可以是MAPKs的直接靶標(biāo)。最近，擬南芥對(duì)可變剪接響應(yīng)flg22的全基因組分析顯示，可變剪接通過相關(guān)剪切因子修飾重要的PTI調(diào)控蛋白，證明了可變剪接調(diào)控在PTI中的重要性。例如有研究發(fā)現(xiàn)了一種免疫調(diào)節(jié)的植物核糖體結(jié)合蛋白IRR（immunoregulatory RNA-binding protein，IRR）通過感知植物激發(fā)多肽受體（plant elicitor peptide receptor，PEPR）以及植物免疫關(guān)鍵受體BIK1、BAK1的磷酸化信號(hào)激活磷酸酶活性使IRR去磷酸化，IRR去磷酸化修飾能夠使它介導(dǎo)的CPK28產(chǎn)生截?cái)嗟霓D(zhuǎn)錄本，從而使胞內(nèi)鈣離子改變，進(jìn)而影響B(tài)IK1的泛素化降解，使BIK1受體傳遞的免疫信號(hào)被不斷地放大［101］。該研究表明剪切相關(guān)蛋白對(duì)特定基因的作用可能對(duì)植物免疫調(diào)節(jié)至關(guān)重要。比較基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)擬南芥鑒定出的剪切調(diào)節(jié)因子的數(shù)量是人類的兩倍［102-103］，這也暗示剪切相關(guān)蛋白可能在植物生理過程中存在著巨大作用還未被發(fā)現(xiàn)。

PTI由MAPK和大多數(shù)受MPK3、MPK4和MPK6調(diào)控的PTI防御基因調(diào)控［104］。其中MPK4調(diào)控剪切因子的可變剪接，MPK4靶向剪接因子SCL30中的幾個(gè)磷酸化位點(diǎn)［105］。MPK4通過影響剪切因子數(shù)量來調(diào)控可變剪接參與免疫的重要蛋白激酶。這些共同的證據(jù)指向可變剪接在PTI信號(hào)觸發(fā)的蛋白磷酸化介導(dǎo)的植物免疫中起著重要作用。

一些SFs直接通過效應(yīng)因子對(duì)前體mRNA進(jìn)行剪切。研究發(fā)現(xiàn)，病原效應(yīng)子可以重編程寄主前體mRNA剪切來破壞植物免疫，例如，大豆疫霉菌無毒性效應(yīng)體PsAvr3c能夠結(jié)合含有植物剪切體成分的復(fù)合物相結(jié)合的新蛋白GmSKRPs阻止蛋白酶體降解，并且過表達(dá)GmSKRP1和PsAvr3c能夠使大量包括防御相關(guān)基因在內(nèi)的基因可變剪接進(jìn)程改變［100］。實(shí)驗(yàn)證明，植物病原菌效應(yīng)物可以重編程宿主前體mRNA剪切來促進(jìn)病原物的發(fā)生發(fā)展，這種病原菌擊敗宿主的免疫系統(tǒng)的策略可能是病原菌長(zhǎng)期進(jìn)化而來。這種機(jī)制在一個(gè)完全不同的病理系統(tǒng)中得到了證實(shí)，ProbiAvh89是疫霉菌的PsAvr3c同源物，能夠以類似于PsAvr3c的模式進(jìn)行調(diào)節(jié)［106-107］。包囊線蟲利用效應(yīng)蛋白操縱宿主的細(xì)胞以建立其寄生所需的取食點(diǎn)，在異源沙氏菌感染過程中，效應(yīng)蛋白30D08被運(yùn)送到植物細(xì)胞，并在植物細(xì)胞核與輔助剪切體蛋白SMU2相互作用［86］。30D08和SMU2都被證明是寄生建立的必要條件，30D08在SMU2啟動(dòng)子下的異位表達(dá)導(dǎo)致剪切變化，影響幾個(gè)與取食位點(diǎn)形成相關(guān)的參與重要的細(xì)胞過程的功能基因的表達(dá)［108］。

另一個(gè)例子是丁香假單胞桿菌侵染植物抑制植物免疫的機(jī)制，三型效應(yīng)因子HopU1編碼一個(gè)ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶，該酶在植物體內(nèi)靶向植物核糖體結(jié)合蛋白［109-110］。例如GRP7影響5′端剪切位點(diǎn)的選擇并通過直接與靶標(biāo)mRNA結(jié)合影響某個(gè)轉(zhuǎn)錄本的剪切來降低植物免疫［111］。進(jìn)一步的研究表明，GRP7過表達(dá)可增強(qiáng)對(duì)Pst.DC3000的抗性，并改變與水楊酸和茉莉酸相關(guān)防御基因轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)［112］。在有利的情況下植物與微生物的相互作用（如根瘤菌或AM真菌）也可以發(fā)生類似的過程［113-115］。這些證據(jù)表明，病原物剪切寄主植物的mRNA來影響免疫信號(hào)和抗病能力，病原操縱寄主可變剪接破壞寄主免疫的進(jìn)化策略在植物免疫響應(yīng)過程中有著重要作用，但侵染過程中植物全基因組可變剪接的變化和病原改變寄主可變剪接來獲得致病力的機(jī)制仍然未被發(fā)現(xiàn)。

7 總結(jié)與展望

植物免疫反應(yīng)是一個(gè)精準(zhǔn)調(diào)控的動(dòng)態(tài)機(jī)制。植物免疫進(jìn)化出PTI和ETI兩條免疫路徑，在病原菌入侵時(shí)，植物體受體啟動(dòng)信號(hào)級(jí)聯(lián)，調(diào)控大量防御基因的表達(dá)，這種動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后、翻譯和不需從頭轉(zhuǎn)錄的翻譯后調(diào)節(jié)［116-122］。植物防御基因的前體mRNA的剪接需要剪接復(fù)合體，剪接因子如SRs可以調(diào)節(jié)剪接體的特異性［123］，從而產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)錄本，很多關(guān)鍵防御基因由于轉(zhuǎn)錄本被改變產(chǎn)生了不同的蛋白亞型，如免疫受體基因、R基因、激素信號(hào)路徑關(guān)鍵基因以及一些轉(zhuǎn)錄因子，這個(gè)轉(zhuǎn)錄后的變化參與了植物轉(zhuǎn)錄組的動(dòng)態(tài)重編程使植物能夠快速啟動(dòng)防御響應(yīng)（圖1）。

圖1 可變剪接調(diào)控植物免疫模式圖Fig.1 Pattern figure of alternative splicing regulating plant immunity

盡管可變剪接在植物抗病性中的研究在過去的十幾年中取得了很大的進(jìn)展，但可變剪接在植物免疫領(lǐng)域仍還有很多問題未被解析，此外，隨著病原-寄主的進(jìn)化，病原進(jìn)化出針對(duì)操縱寄主可變剪接機(jī)制破壞寄主免疫的進(jìn)化策略，可變剪接參與R-Avr相互作用的機(jī)制及該機(jī)制是否廣泛存在于多個(gè)物種以及不同微生物與植物互作的抗病系統(tǒng)中還未被完全解釋清楚。未來還需深入研究R蛋白的功能機(jī)制、亞細(xì)胞定位、與靶蛋白無毒蛋白Avr的相互作用，擴(kuò)展對(duì)植物基因?qū)蚩剐缘恼J(rèn)識(shí)。

可變剪接引發(fā)的無義介導(dǎo)的mRNA降解在真核生物中廣泛存在，是一種質(zhì)量控制機(jī)制［124-125］。NMD與可變剪接結(jié)合，通過特異性降解具有提前終止密碼子轉(zhuǎn)錄本來調(diào)控功能性轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平［126］。然而，目前還不清楚來自R基因的潛在NMD目標(biāo)是如何避免被破壞的。雖然NMD的功能作用還不清楚，但是NMD在抗病中的調(diào)控已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。nmd突變體表現(xiàn)出發(fā)育不良的表型和卷曲的葉片，類似于具有組成型防御反應(yīng)的突變體，并且nmd突變體中富集的大部分轉(zhuǎn)錄本與防御相關(guān)［127］。最初認(rèn)為NMD活性在病原菌侵染過程中受到抑制，導(dǎo)致R基因轉(zhuǎn)錄本的積累［128］，這與RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)擬南芥的NMD活性較弱一致［129］。目前需要更多的證據(jù)來闡明抑制R基因選擇性剪切轉(zhuǎn)錄的NMD的分子機(jī)制。

一些SFs對(duì)轉(zhuǎn)錄的影響主要是在正常生長(zhǎng)條件下進(jìn)行的［130-131］。未來，系統(tǒng)地識(shí)別SFs及其基因靶標(biāo)，以及了解可變剪接在應(yīng)激過程中的動(dòng)態(tài)變化對(duì)短期反應(yīng)和長(zhǎng)期適應(yīng)的影響將是非常重要的。擬南芥編碼34 212個(gè)基因的82 190個(gè)非冗余轉(zhuǎn)錄本［132］，這表明在進(jìn)化過程中存在著基因組復(fù)制和基因組重排的現(xiàn)象。不同的植物SFs是否存在冗余或在進(jìn)化過程中獲得新的功能還未被研究［133］。目前除了SNC1和RPS4之外，對(duì)R基因剪切的剪切因子和RNA結(jié)合蛋白還未知。這些因素的突變可能導(dǎo)致不明顯的表型。此外，即使防御信號(hào)需要R基因，突變體也可能在沒有表達(dá)同源基因的情況下正常生長(zhǎng)。基因組學(xué)、生物信息學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，將有助于探索R基因的生成并闡明植物免疫的新途徑。今后對(duì)可變剪接的研究將進(jìn)一步加深我們對(duì)植物免疫調(diào)控的認(rèn)識(shí)，這對(duì)于作物抗病育種保障國家糧食與食品安全問題具有重要意義。