高鹽鹽湖可分離嗜鹽耐鹽菌的種群多樣性及四氫嘧啶產(chǎn)量評價

張?zhí)锾?李永臻 沈國平 王嶸 朱德銳 邢江娃

（青海大學醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究中心，西寧 810016）

柴達木盆地位于青藏高原東北部（90°00′-98°20′E，35°55′-39°10′ N），海拔 2 675-3 350 m，隸屬高原大陸性干旱氣候［1-3］，盆地環(huán)境相對封閉，復雜的地質(zhì)條件和獨特的環(huán)境因素形成了地球上分布面積最大（2.0×106km2）、數(shù)量最多以及鹽堿湖集中的特色高原鹽湖群［4-5］。該區(qū)域內(nèi)湖泊類型多樣化，其總鹽度（或離子組成）、水質(zhì)營養(yǎng)（總碳、氮或磷）以及pH等環(huán)境因子存在顯著差異。根據(jù)礦化度含量，鹽湖可分為淡水湖（礦化度≤1.0 g/L）、微咸水湖（礦化度1.0-35.0 g/L）、咸水湖（礦化度35.0-50.0 g/L）和高鹽鹽湖（礦化度＞50.0 g/L）4種類型［6］；根據(jù)化學成分不同，又可分為碳酸鹽型、硫酸鹽型和氯化物型3種類型，其中碳酸鹽湖又分為高碳酸鹽型（＞29.0%）、中碳酸鹽型（8%-29.0%）和弱碳酸鹽型（0.1%-8.0%）3個亞型，而硫酸鹽型鹽湖又分為硫酸鈉亞型和硫酸鎂亞型［7］。

鹽湖微生物是湖泊生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，其微生物多樣性、群落結(jié)構(gòu)組成和環(huán)境互作受到鹽湖各類水化學因素的制約，如水化學類型、地理位置間距、總鹽度、水質(zhì)營養(yǎng)（總碳、氮或磷）、溫度和pH等［8］。根據(jù)微生物對鹽濃度的不同需求，可將其分為7類［9］：非嗜鹽微生物（non-halophile，0-1.0 mol/L）、弱嗜鹽微生物（slight halophile，0.2-2.0 mol/L）、中度嗜鹽微生物（moderate halophile，0.4-3.5 mol/L）、邊界極端嗜鹽微生物（borderline extreme halophile，1.4-4.0 mol/L）、極端嗜鹽微生物（extreme halophile，2.0-5.2 mol/L）、耐鹽微生物（halotolerant，0-＞1.0 mol/L）和萬能耐鹽微生物（haloversatile，0-＞3.0 mol/L）。在應對高鹽環(huán)境脅迫時，嗜鹽微生物胞內(nèi)可積聚多種代謝產(chǎn)物，如嗜鹽菌素、抗生素、胞外多糖、相容溶質(zhì)四氫嘧啶（ectoine）和甜菜堿等，這些特殊代謝物可廣泛應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)［10］、食品加工［11］、環(huán)境治理［12-15］以及生物醫(yī)藥等方面［16-19］。國內(nèi)學者曾以達布遜鹽湖、青海湖、托素湖、尕海、茶卡鹽湖、柯柯鹽湖、察爾汗鹽湖和小柴旦鹽湖等為研究對象，通過高通量測序等手段發(fā)現(xiàn)大量的芽孢桿菌（Bacillus）、鹽單胞菌（Halomonas）、大洋芽胞桿菌屬（Oceanobacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、乳球菌屬（Lactococcus）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）等菌株資源廣泛存在［2-3，20-22］。然而，目前自然環(huán)境中僅有1%左右的微生物獲得純培養(yǎng)，甚至更低［23］。本研究以茶卡鹽湖、柯柯鹽湖和小柴旦鹽湖等三大硫酸鎂亞型高鹽鹽湖為研究對象，采用RM培養(yǎng)基篩選分離可培養(yǎng)嗜鹽和耐鹽菌，分析其群落結(jié)構(gòu)多樣性及其與環(huán)境因子之間的關(guān)系，了解優(yōu)勢菌屬的嗜鹽特性和系統(tǒng)發(fā)育，并采用HPLC篩選四氫嘧啶高產(chǎn)野生菌株，為鹽湖微生物資源的開發(fā)與利用提供重要的理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 2018年7月采集茶卡鹽湖（99°4′41.67′E，36°45′0.05′N）、柯柯鹽湖（98°15′3.4′E，36°58′19.97′N）和小柴旦鹽湖（95°32′58.38″E，37°28′0.65″N）的水泥混合樣本共計12個，渾濁狀態(tài)，水樣采集深度10-25 cm，采樣溫度20-27.7℃，各樣點間距大于100 m。樣本儲存于4℃車載冰箱，運回實驗室備用。

1.1.2 培養(yǎng)基制備 菌種分離和富集培養(yǎng)采用RM固體與液體培養(yǎng)基［1］：NaCl 50 g或 100 g，MgSO4·7H2O 9.7 g，KCl 2.0 g，檸檬酸鈉3.0 g，無水氯化鈣0.2 g，酵母抽提物2.0 g，蛋白胨10.0 g，加入蒸餾水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH 7.5。固體培養(yǎng)基加瓊脂16.0 g，1×105Pa滅菌1 h，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 菌株分離與耐鹽實驗 取適量水樣100 μL直接涂布固體培養(yǎng)基平板，置入37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)18-24 h后取出。依據(jù)菌落的形態(tài)進行單一菌落挑選，重復劃線純化培養(yǎng)3-4次，最后-20℃保藏菌種（菌液含15%甘油）。耐鹽度試驗以1%接種量（V/V，1∶100）接種于不同NaCl濃度梯度的RM液體培養(yǎng)基中（0-3.0 mol/L，梯度0.5），3組平行，37℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)12、18和24 h。采用722分光光度計測定培養(yǎng)液光密度值（OD600），取其平均值，根據(jù)生長曲線計算最適鹽度。

1.2.2 細菌DNA的提取、PCR擴增與測序 基因組DNA提取按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明進行。細菌16S rRNA基因PCR擴增和測序采用通用引物 27F（5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′） 和 1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進行。PCR 反應體系（25 μL）：10×Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1 μL，正、反向引物（濃度為 10 μmol/L）各 0.5 μL，DreamTaq-TM DNA聚合酶 0.2 μL，DNA模板（20-50 ng/μL）0.5 μL，ddH2O 補充至 25 μL。PCR 反應條件：94℃ 4 min，94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 60 s，30 個循環(huán)，最后72℃修復延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳觀察和純化回收后用PCR引物直接測序，獲得待測菌株的16S rRNA序列。

1.2.3 菌種鑒定與優(yōu)勢菌株系統(tǒng)發(fā)育分析 將測序得到的分離菌株16S rRNA基因序列在EzBioCloud（http：//www.ezbiocloud.net/identify）和 NCBI GenBank（http：// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi）數(shù)據(jù)庫進行比對分析，確定分離菌株的分類學地位，兩個數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果不同時，以相似度較高的結(jié)果為準（相似度≥98%）。通過NCBI數(shù)據(jù)庫獲取與菌株相似性較高的近緣物種參考基因序列，利用MEGA 7.0軟件進行相似性比對，采用鄰接法（neighbor joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（bootstrap為1 000）［24-25］，以此分析優(yōu)勢分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位。

1.2.4 四氫嘧啶的提取和細胞干重測定 將培養(yǎng)12 h的菌液擴大培養(yǎng)到100 mL錐形瓶中，放入搖床過夜培養(yǎng)24 h后測OD600，然后抽取10 mL于離心管中，12 000 r/min離心5 min，棄上清；加入純水10 mL，用超聲細胞破碎儀破碎7 min，12 000 r/min離心5 min，取其上清經(jīng)0.22 μm水系微孔過濾器過濾，即四氫嘧啶提取液［26］。將剩余90 mL發(fā)酵液4℃12 000 r/min離心5 min，棄上清，再加10 mL的生理鹽水快速洗滌，9 000 r/min 離心5 min，棄上清，將沉淀放于60℃烘干箱至恒重，冷卻后稱量，計算細胞干重（CDW g/L）。

1.2.5 高效液相色譜（HPLC）檢測四氫嘧啶含量 配制1.0 mg/mL的四氫嘧啶標準品母液，HPLC檢測四氫嘧啶濃度，并建立標準曲線（峰面積與濃度）。HPLC檢測條件：流動相為水∶乙腈（V/V，20∶80），檢測波長210 nm，流速為1.0 mL/min，柱壓 3.486-4.761 MPa，柱溫 30℃，上樣量 15 μL［27］.

1.2.6 環(huán)境因子相關(guān)性分析 基于三大鹽湖的水質(zhì)離子特征數(shù)據(jù)和分離菌株菌種鑒定結(jié)果，采用多元直接梯度回歸法分析菌群與環(huán)境因子之間的相關(guān)性。采用R語言Vegan包進行典范對應分析（canonical correlation analyses，CCA）和作圖，通過bioenv函數(shù)判斷環(huán)境因子與樣本群落分布差異的最大Pearson相關(guān)系數(shù)，通過permutest分析判斷CCA分析的顯著性。

1.2.7 NCBI數(shù)據(jù)提交 本研究所得序列均提交NC BI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫，細菌登錄 號 MT982223-MT982264；MT982266- MT982321；MT982324- MT982326；MT982332-MT982343。

2 結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng)細菌的分子鑒定與統(tǒng)計

本研究篩選獲得茶卡鹽湖、柯柯鹽湖和小柴旦鹽湖的可培養(yǎng)細菌共計113株（表1）。其中，RM中鹽培養(yǎng)基（5% NaCl）共篩出菌株70株，高鹽培養(yǎng)基（10% NaCl）共篩選出菌株43株。統(tǒng)計分析表明：所有分離菌株來自厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）2個門（表2）。中鹽培養(yǎng)基篩選出的優(yōu)勢菌屬為Firmicute門Bacillus屬（32株）；高鹽培養(yǎng)基篩選出的菌株主要分布在Firmicutes門的Staphylococcus屬（15株）和Bacillus屬（10株），以及Proteobacteria門的Halomonas屬（15株）。其中，茶卡鹽湖共分離獲得47株可培養(yǎng)細菌，優(yōu)勢菌株為Bacillus屬（20株，約占42.6%）和Halomonas屬（10株，約占21.3%）；柯柯鹽湖共分離獲得40株可培養(yǎng)細菌，優(yōu)勢菌株為Staphylococcus屬（17株，約占42.5%）和Bacillus屬（16株，約占40%）；小柴旦鹽湖共分離獲得26株可培養(yǎng)細菌，優(yōu)勢菌株為Halomonas屬（13株，約占50%）。

表1 分離菌株數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 1 Statistics of isolated strains

表2 柴達木盆地典型鹽湖分離細菌的分子鑒定與豐度統(tǒng)計Table 2 Molecular identification and abundance statistics of the isolated bacteria from typical salt lakes in Qaidam Basin

2.2 環(huán)境因子CCA分析

茶卡鹽湖、柯柯鹽湖和小柴旦鹽湖為柴達木盆地典型的硫酸鎂亞型高鹽鹽湖，總鹽度均值分別為 292.64 g/L、256.95 g/L和 110.82 g/L，以 Na+、Mg2+、Cl-、SO42-離子為主［2，22，28］。CCA 分析結(jié)果顯示（圖1）：由于3個鹽湖的理化性質(zhì)相似，各環(huán)境因子對樣本的影響程度基本相當，沒有顯著的環(huán)境影響因子。各環(huán)境因子之間總鹽度（TS）、有機碳（TOC）、有機氮（TN）與 Na+、Cl-、K+、Mg2+、CO32-離子成正相關(guān)，與pH、Ca2+和SO42-離子成負相關(guān)。優(yōu)勢菌屬Bacillus的豐度主要與Mg2+和K+成正相關(guān)，Staphylococcus主要與TN和CO32-成正相關(guān)，Halomonas主要與pH和SO42-離子成正相關(guān)。

圖1 三大鹽湖分離細菌環(huán)境因子CCA分析Fig. 1 CCA analysis between environmental factors and bacteria isolated from the three salt lakes

2.3 優(yōu)勢菌株菌落形態(tài)、嗜鹽特性與分類統(tǒng)計

分離的Bacillus屬菌株（42株）多為圓形或橢圓形，形態(tài)大小稍有差異，菌落顏色多呈白色或乳白色，部分呈乳黃色或土黃色，極少數(shù)呈粉色（如菌株C43、C18和X20）和淺褐色（如菌株C37和C10）。在生長鹽度范圍上，大多數(shù)菌株在0-3.0 mol/L范圍都可以生長，僅個別菌株在0-2.0 mol/L或更低的鹽度下才能生長（表3）。參考Kushner的分類標準［9］，21株Bacillus屬菌株為中度嗜鹽菌，約占50%；16株為耐鹽菌，約占38.1%；5株為弱嗜鹽菌，約占11.9%。Halomonas屬菌株（26株）多為圓形或橢圓形，菌落顏色呈白色或乳白色，少量呈現(xiàn)褐色（如菌株C9）和黃色（如C39、C40和C44）。大多數(shù)Halomonas菌株的生長鹽度范圍為0-3.0 mol/L，生長范圍寬泛且最適鹽度較高，易于培養(yǎng)。其中，24株隸屬中度嗜鹽菌，約占92.3%，2株隸屬耐鹽菌范疇，約占7.7%。

ulation ）Ectoine accum mg·g -1 C DW/（147.75 10ND 18.20 32.26 30.81 18.50 77.60 100.35 135.84 23.88 ND 10.91 ND ND 70.09 19.82 23.99 ND ND ND 125.18 53.98 41.80 100.39 369.10 239.51 296.56 41.37 65.23 57.615 99.6 208.566 41.2 es ted from salt lak Classification of hile hile hile halophiles Moderate halophile Moderate halophile Moderate halophile Moderate halophile Slight halop Slight halop Moderate halophile Slight halop Moderate halophile Moderate halophile Moderate halophile Halotolerant alophile Moderate h Halotolerant Halotolerant alophile Moderate h alophile Moderate h Slight halophile Halotolerant Halotolerant Halotolerant Moderate halophile Moderate halophile Moderate halophile Moderate halophile Moderate halophile Moderate halophile Moderate halophile alophile Moderate h alophile Moderate h alophile Moderate h alophile Moderate h alophile Moderate h alophile Moderate h積t strains iso la聚L-1）mol·量Optimal salinity/（1.51.01.50.50.50.51.00.51.01.50.500.5001.00.50.50001.01.00.51.01.01.51.01.50.50.51.01.00.5啶an ge Salinity ranL-1）嘧in mol·/（0-0.5-2.5氫om 2.52.5 0-0-0-0-0-0-0-0-0-0-0-0-0-0.5-2.5 2.52.01.52.52.02.02.52.53.03.03.03.03.0 2.02.02.53.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.03.0四0-0-0-0-0-0-0-0-0-0-0-0-0-0-0-0-0-0-和度 適ulatio n of d鹽最Strain code K15 K17 K26 K27 K28 K29 K30 K31 K32 K37 K39 K40 K41 K42 K48 X5X10 X11 X20 X22 X33 X4X6X9X21 X26 X27 X28 X31 X32 X34 X35 X36 X39度、鹽mg·g -1CD e accum ulation e accum W）長in株生ecto 8菌/（80226432ND ity and Ectoin.00.56.474.69.8.66.71勢ND ND ND.93 3180ND ND ND ND 50.95 ND 65.46 133.33 ND ND5.205 2730ND2.38 121815ND.25 1132.35 21.82 ND 9.98 96.81 46.30優(yōu)體水湖al salin hile alophile alophile alophile alophile alophile alophile alophile alophile Not detected 3 鹽ptim D：salinity，o Classification of halophiles Moderate halophile Moderate halophile檢Salt L Moderate halophile Moderate halophile表Slight halop Halotolerant Halotolerant Halotolerant halotolerant Moderate halophile halotolerant Moderate halophile Halotolerant Halotolerant Moderate h Halotolerant Moderate h Moderate h Halotolerant Halotolerant Moderate h Moderate halophile Moderate halophile Moderate halophile Moderate halophile Moderate halophile Halotolerant Moderate halophile Moderate halophile Moderate h halotolerant Moderate h Moderate h Moderate h測ake. N到ity 未1）th D：L-Grow timal salin；N湖iaochaidan Op /（0.5 mol·2.00.50.50.500001.001.0000.501.01.5001.50.51.50.50.50.502.00.52.500.51.50.5鹽：X旦Table 3 Salinity range L-1）柴ake. X小mol·/（0.5-2.02.5：3.0；X 3.03.0 e Salt L 0.5-1.5 0-0-0-1.5 0-1.5 0-2.0 0-2.5 0-3.02.0 0-0 -3.0 0-0-0-0-0-0.5-2.03.0 3.02.53.0 0.5-1.5 0-0-0-2.5 1.02.5 0-3.0 0-3.03.0 0-0.5-3.0 0-3.03.0 0-0.5-3.0 0-0-0-0-0-0-2.5 3.03.02.03.0湖ek鹽：K柯Strain 柯code C11 C158023456790372302：ake. K C12 C2 C1C2C2C2C2C2C2C2C3C3C3C4C4C5C5K11 C8C9C137490141 BacillusC10 C1C3C3C4C4C4C5K5K148 K3；K湖Classification 鹽of bacteria lomonas 卡茶：C haka Salt L：Ha ：C：C注Note

2.4 構(gòu)建優(yōu)勢菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示柴達木盆地極端鹽湖Bacillis屬主要有5個進化分支，屬于6個不同的種（圖2-A）。分離菌株 C10、C11、C15、C24、C25、C27、C29、C30、C33、C42、C43、C50、K11、K29、K30、X5、X11、X20和X22 與菌株B. zhangzhouensis（MG547767.1）聚類在同一進化分支，基因相似性為99.87%-99.93%，表明進化同源；菌株C37、K17、K26、K32、K37、K39和 K42與 菌 株B. pumilus（CP027116.1）聚類在同一進化分支，基因相似性為99.93%-100%，表明進化同源；菌株C12、C18、C20、C23、C52、K27、K28、K31、K40、K41、K48、X10和X33與菌株B. atrophaeus（NR024689.1）聚類在同一進化分支，基因相似性為99.93%-100%，表明進化同源；C22、C26和K15分別與菌株B. paralicheniformis、B. flexuss和B. subtili基因相似性為100%，表明進化同源。Halomonas屬主要有6個進化分支（圖2-B），屬于7個不同的種分類單元，此外3株菌株僅能鑒定到屬，進一步分類學地位尚需鑒定。菌株C9、C13、C34和X4與菌株H. zhaodongensis（NR 125612.1）基因相似性為98.79%-99.86%，表明進化同源；菌株K5和 K14與 菌 株 Halomonas sp. TC19（EU308353.1）基因相似性為100%，表明進化同源；菌株C8、K38、X6、X9、X21、X26、X31、X32、X34、X35與 X39與 H. alkaliphila（CP024811.1） 基 因 相 似度為99.73%-100%，表明進化同源；C39和C44分別與菌株H. arcis和H. salicampi基因相似性為99.22%和98.72%，表明進化同源；菌株 C17與H.gomseomensis 基因相似性為98.14%，但兩者并未聚類在一起，可能為潛在的新種；C40與H. lutescens的基因相似性為98.14%，但兩者并未聚類在一起，可能為潛在的新種；C51與H. zhaodongensis的基因相似性為98.16%，但兩者并未聚類在一起，可能為潛在的新種。

圖2 優(yōu)勢菌株系統(tǒng)發(fā)育進化樹（A：芽孢桿菌屬，B：鹽單胞菌屬）Fig. 2 Phylogenetic tree of dominant strains（A ：Bacillus. B ：Halomonas）

2.5 四氫嘧啶含量測定

硫酸鎂亞型三大高鹽鹽湖優(yōu)勢分離菌株之間的四氫嘧啶含量存在較大差異（如K5和X26）（表3）。其中，檢測到的Bacillus屬單位細胞干重四氫嘧啶積聚量低于50 mg/g的菌株共計10株；積聚量在50-100 mg/g的菌株共計7株；積聚量高于100 mg/g的菌株共計7株。Halomonas屬四氫嘧啶積聚量低于50 mg/g的菌株共計11株；積聚量在50-100 mg/g的菌株共計5株；積聚量高于100 mg/g的菌株共計7株。兩個屬中共有21株菌株未檢測到四氫嘧啶的積聚。Halomonas屬 的 X26、X28、X27和 X36與 Bacillus屬的C15、K11和C11等7株菌株的四氫嘧啶積聚量顯著高于其他菌株（大于200 mg/g），具有高效積聚生產(chǎn)四氫嘧啶的潛力。

3 討論

高鹽鹽湖環(huán)境中廣泛存在不同的嗜鹽微生物［28］。諸多研究表明：高鹽鹽湖的細菌優(yōu)勢屬群主要有假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、希瓦式菌屬（Shewanella）、鹽單胞菌屬（Halomonas）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、梭狀芽孢桿菌（Clostridium）、泛菌屬（Pantoea）、分枝桿菌屬（Mycobacterium）、交替單胞菌屬（Alteromonas）、嗜鹽桿菌屬（Halobacterium）、海桿 菌 屬（Marinobacter）、 腸 球 菌（Enterococcus）、鹽紅菌屬（Halorubrum）、嗜鹽堿單胞菌屬（Natronomonas）、極嗜鹽菌屬（Haloferax）、紅球菌屬（Rhodococcus）、硝化細菌（Nitrobacter）、深海彎曲菌屬（Thalassolituus）、棲蘇打菌屬（Nitrincola）、鹽桿菌屬（Salinibacter）、海莖狀菌屬（Maricaulis）、羅丹桿菌屬（Rhodanobacter）、玫瑰桿菌（Roseobacter）和脫硫桿菌屬（Desulfobacterium）等，并因各鹽湖水化學特征和環(huán)境因子的不同而存在明顯差異［29-35］。柴達木盆地鹽湖眾多，細菌類型豐富，優(yōu)勢物種組成多樣化。沈碩［1］采用16S rRNA基因測序分析察爾汗鹽湖（310.01-332.82 g/L）的細菌多樣性，結(jié)果顯示優(yōu)勢菌屬以Bacillus（33%）、Oceanobacillus（25%）和 Halomonas（17%）為主；趙婉雨等［20］采用高通量測序與傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合的方法分析達布遜湖（371 g/L）微生物多樣性，表明優(yōu)勢菌屬以Pseudomonas和Bacillus為主；課題組前期基于16S rRNA基因高通量測序分析發(fā)現(xiàn)硫酸鎂型高鹽鹽湖茶卡鹽湖［22］、柯柯鹽湖［2］和小柴旦鹽湖［28］的優(yōu)勢細菌屬群主要是Bacillus（8.24%-58.3%），次為Pseudomonas（1.4%-10.5%）、Oceanobacillus（1.5%-10.3%）、Lactococcus（1.1%-10.5%） 和 Halomonas（0-7.4%）等。本研究采用RM中鹽和高鹽培養(yǎng)基分離出茶卡鹽湖、柯柯鹽湖和小柴旦鹽湖的可培養(yǎng)嗜鹽耐鹽菌共計113株，優(yōu)勢菌屬為Bacillus屬（42株）、Staphylococcus屬（31株）和Halomonas屬（26株），其中Bacillus和Halomonas的豐度與鹽湖類型呈明顯的正相關(guān)。分離出的優(yōu)勢細菌菌屬與前期的高通量測序分析結(jié)果大體一致，表明選用的RM中鹽和高鹽培養(yǎng)基比較適合這兩類優(yōu)勢菌群的篩選和分離培養(yǎng)，且Bacillus和Halomonas很可能是硫酸鎂亞型高鹽鹽湖的典型優(yōu)勢菌群。前期高通量測序得到的優(yōu)勢菌屬Pseudomonas、Oceanobacillus和Lactococcus在本研究中尚未分離到，需要后期優(yōu)化相應的菌株分離和篩選培養(yǎng)基的類型。同時，本研究中分離到的嗜鹽菌主要為中度嗜鹽菌，并未分離到極端嗜鹽菌，可能與分離培養(yǎng)基中NaCl最高鹽度設(shè)置偏低有關(guān)。

優(yōu)勢分離菌屬Bacillus屬分類學定位于芽孢桿菌綱芽孢桿菌科，是一類產(chǎn)芽孢的好氧、或兼性厭氧性革蘭氏陽性細菌［36］，廣泛存在于鹽湖、沙漠、海洋或火山谷等特殊環(huán)境之中［37］。截止2020年，LPSN數(shù)據(jù)庫（http：//www.bacterio.net/）已收錄的Bacillus屬共計95個種，代表性菌株如B. atrophaeus、B. mycoides和B. cereus等。本研究共計獲得優(yōu)勢純培養(yǎng)Bacillus屬菌株42株，主要有萎縮芽孢桿菌（B. atrophaeus）、短小芽孢桿菌（B. pumilus）、張州芽孢桿菌（B. zhangzhouensis）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、彎曲芽孢桿菌（B. flexus）和地衣芽孢桿菌（B. paralicheniformis）等，細菌分類以中度嗜鹽菌（約占50%）和耐鹽菌（約占38.1%）為主。優(yōu)勢分離菌屬Halomonas屬分類學定位于γ-變形菌綱鹽單胞菌科，能在含有0-5.1 mol/L NaCl環(huán)境中生長，是一類需氧、桿狀革蘭氏陰性細菌，廣泛分布于鹽湖、鹽場或海洋等極端鹽環(huán)境［38］。截止2020年，LPSN數(shù)據(jù)庫已收錄Halomonas屬菌株共計108個種。Halomonas屬是嗜鹽微生物重要的代表菌群，也是鹽環(huán)境優(yōu)勢屬群之一［39］，代表菌株如H. elongata、H. alkaliphile和H. marina等。本研究中，共計獲得純培養(yǎng)Halomonas屬菌株26株（其中3株菌種分類未確定），主要有嗜堿性鹽單胞菌（H. alkaliphile）、尖頂鹽單胞菌（H. arcis）以及肇東鹽單胞菌（H. zhaodongensis）等，細菌分類以中度嗜鹽菌（約占92.3%）為主。沈碩［1］通過可培養(yǎng)方法發(fā)現(xiàn)察爾汗鹽湖Bacillus種屬主要為：甲基營養(yǎng)芽孢桿菌（B. methylotrophicus）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、短小芽孢桿菌（B. pumilus）、暹羅芽孢桿菌（B. siamensis）和萎縮芽孢桿菌（B. atrophaeus）等，Halomonas種屬主要為：尖頂鹽單胞菌（H.arcis）、H. zhaodongensis和泰坦尼克號鹽單胞菌（H.titanicae）等。李坤珺等［40］通過可培養(yǎng)方法發(fā)現(xiàn)運城鹽湖Bacillus種屬主要為：甲基營養(yǎng)芽孢桿菌（B.methylotrophicus）、沙地芽孢桿菌（B. aquimaris）、花津灘芽孢桿菌（B. hwajinpoensis）和鹽芽胞桿菌（B.salarius）等，Halomonas種屬主要為：尖頂鹽單胞菌（H. arcis）、硫化物單胞菌（H. sulfidaeris）、艾丁湖鹽單胞菌（H. aidingensis）、脫氮芽孢桿菌（H.denitrificans）和韓國芽孢桿菌（H. koreensis）等。與以上鹽湖菌株多樣性相比，本研究分離得到的優(yōu)勢菌屬同為Bacillus和Halomonas屬，但具體的菌種略有不同，可能與各鹽湖環(huán)境與理化性質(zhì)的差異有關(guān)。

嗜鹽微生物因具有特殊的嗜鹽和耐鹽機制而具有廣泛的應用。為了在高鹽環(huán)境下適應生存，嗜鹽或耐鹽微生物能夠合成并積累大量的相容物質(zhì)，如甜菜堿、四氫嘧啶、羥基四氫嘧啶、谷氨酰胺、海藻糖和蔗糖等，以此維持細胞內(nèi)外的滲透平衡［41］。四氫嘧啶是一種環(huán)狀氨基酸衍生物，具有親水性和兩性離子特征，是典型的微生物相容溶質(zhì)之一。研究證明四氫嘧啶具有強大的生物大分子（胞外多糖、酶、DNA和抗體等）和細胞穩(wěn)定作用，能夠保護細胞免受高滲透壓及高溫等極端環(huán)境的影響［42］，因此在精細化工、環(huán)境治理、農(nóng)業(yè)生物技術(shù)和生物醫(yī)學等領(lǐng)域具有良好的應用潛力［10，43-47］。在鹽激條件下，不同種屬的嗜鹽菌能生物合成四氫嘧啶，如 Marinococcus sp. M AR 2［48］、Stenotrophomonas sp. WMA-LM19［49］、 芽 孢 桿 菌 B. clausii NIOTDSB04［50］、鹽單胞菌 H. salina［51］、H. hydrothermalis Y2［52］和 H. elongata［53］等。艾麗等［54］通過高效液相色譜-質(zhì)譜法（HPLC-MS）測定Chromohalobacter S2在最適鹽濃度下的合成量為238. 201 mg/g，姚倩倩等［55］通過HPLC測定Halomonas W2在高鹽度下四氫嘧啶合成量為161 mg/g，王慧敏等［16］通過HPLC-MS測定Halomonas sp. Y在最適生長鹽濃度下其四氫嘧啶合成量為175.5 mg/g。本研究采用普通搖瓶發(fā)酵初步測定柴達木盆地優(yōu)勢菌株的四氫嘧啶積聚量，發(fā)現(xiàn)X26、C15、X28、K11、X27、C11和X36等菌株四氫嘧啶積聚量明顯高于其他菌株，其 含 量 分 別 為 369.10、324.69、296.56、275.20、239.51、220.56和208.56 mg/g。與以上菌株相比，本研究所篩選出的高產(chǎn)菌株四氫嘧啶積聚量相對較高，具有后續(xù)應用生產(chǎn)四氫嘧啶的潛力。

4 結(jié)論

本研究通過RM中鹽和高鹽培養(yǎng)基從三大硫酸鎂亞型高鹽鹽湖中篩選分離獲得嗜鹽耐鹽菌113株，16S rRNA基因測序顯示優(yōu)勢種屬為Bacillus、Staphylococcus和Halomonas?；贖PLC測定優(yōu)勢細菌胞內(nèi)的四氫嘧啶積聚量發(fā)現(xiàn)菌株X26、X28、X27、X36、C15、K11和C11等菌株具有高效積聚生產(chǎn)四氫嘧啶的潛力，可用于四氫嘧啶的發(fā)酵模式菌株。本研究為柴達木盆地高鹽鹽湖微生物資源的開發(fā)和利用提供了一定的參考依據(jù)。