磷水平與叢枝菌根真菌對(duì)桔梗生長(zhǎng)及品質(zhì)的影響

李楠海 孫卓 楊利民

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長(zhǎng)春 130118）

桔 梗［Platycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC.］為桔?？贫嗄晟荼局参铮涓案o入藥［1］，性苦、辛，平，歸肺經(jīng)，有宣肺、利咽、祛痰、排膿的功效［2］。叢枝菌根（arbuscular mycorrhizal，AM）真菌作為一種綠色有效的生物肥料廣泛應(yīng)用于作物栽培領(lǐng)域，然而土壤磷水平會(huì)在某種程度上制約菌根共生體的生長(zhǎng)［3］，高磷或低磷均不利于AM真菌侵染宿主植物，甚至?xí)种扑拗髦参锷L(zhǎng)［4］。對(duì)于藥食同源的桔梗而言，如何提高桔梗產(chǎn)量的同時(shí)提高其藥用成分含量一直是重要的研究課題。近年來(lái)，AM真菌對(duì)植物的促生效應(yīng)越來(lái)越受到重視，但關(guān)于AM真菌與桔梗共生效應(yīng)的研究較少，不同土壤磷水平下AM真菌與桔梗的共生關(guān)系尚不明確。因此，本研究通過(guò)對(duì)盆栽桔梗試驗(yàn)，分析不同土壤磷水平條件下不同AM真菌對(duì)桔梗產(chǎn)量及質(zhì)量的影響，確定AM真菌和磷水平的最佳組合，為科學(xué)使用AM真菌提高桔梗品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試桔梗種子采收自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用植物園，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)楊利民教授鑒定為桔梗科植物桔梗［Platycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC.］的種子。供試AM真菌菌種：摩西斗管囊霉（Funneliformis mosseae，F(xiàn)M）、 根 內(nèi) 根 孢 囊 霉（Rhizophagus intraradices，RI）和象牙白多樣孢囊霉（Diversispora eburnea，DE）均購(gòu)于北京市農(nóng)林科學(xué)院植物資源與營(yíng)養(yǎng)研究所（BGC編號(hào)和國(guó)家微生物資源平臺(tái)編號(hào)分別為BGC BJ01，1511C0001BGCAM0010；BGC BJ09，1511C0001BGCAM0042；BGC XJ06B），接種劑為經(jīng)三葉草和高粱擴(kuò)繁后獲得的含有孢子、菌絲、侵染根段的沙子、沸石混合物，測(cè)定各菌劑接種勢(shì)［5］分 別 為 913.68（IP/g）、1 994.21（IP/g）、1 251.61（IP/g）。供試肥料為磷酸二氫鈉。供試土壤pH值6.76；速效磷20.75 mg/kg，堿解氮23.80 mg/kg；速效鉀222.81 mg/kg；有機(jī)質(zhì)含量2.71%。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室中進(jìn)行。共設(shè) 4個(gè)磷水平，P0（20 mg/kg）、P1（50 mg/kg）、P2（80 mg/kg）、P3（140 mg/kg）；同一磷水平4個(gè)處理，接種摩西斗管囊霉（FM）、根內(nèi)根孢囊霉（RI）、象牙白多樣孢囊霉（DE）及不接種處理（CK）。試驗(yàn)盆隨機(jī)排列，2019年將桔梗種子直播于塑料盆中，每盆裝土5 kg，F(xiàn)M、RI、DE處理組分別層施接種劑100 g、47 g、73 g，接種勢(shì)約為91 368（IP/g），不足100 g的菌劑加入滅菌菌劑補(bǔ)足。CK處理組加入相同質(zhì)量的滅菌菌劑以保持微生物區(qū)系一致。生長(zhǎng)期間，常規(guī)管理，于2020年收獲。

桔梗樣品取回后用清水沖洗干凈，并用濾紙吸干水分。選取細(xì)嫩，堅(jiān)韌的根，剪成1 cm左右的根段，放入FAA固定液中固定，用于菌根侵染率率的測(cè)定；將桔梗葉片組織分裝于凍存管，液氮冷凍貯存于-80℃冰箱，用于保護(hù)酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及丙二醛含量的測(cè)定，稱取桔梗根鮮重，使用游標(biāo)卡尺量取桔梗株高、莖粗、根粗等指標(biāo)并記錄。將桔梗根置于烘箱中低溫烘干至恒重后，測(cè)定桔梗樣品根干重，將樣品粉碎后保存，用于桔梗皂苷測(cè)定。

1.2.2 侵染率測(cè)定 菌根侵染率測(cè)定參考Vierheilig等［6］方法：從固定液中取出根段，用水沖洗干凈，放入試管中，加入10% KOH浸沒(méi)根段，在水浴90℃煮1 h，然后倒出KOH，并以清水洗凈。再向試管中加入墨水醋染色劑，煮開(kāi)10 min，倒出染色劑，并以清水清洗干凈，制片觀察。

1.2.3 保護(hù)酶及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)測(cè)定 超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛（MDA）和脯氨酸（PRO）的測(cè)定采用南京建成生物工程研究所的試劑盒。

1.2.4 桔梗皂苷測(cè)定 桔梗皂苷采用超聲波提取法，測(cè)定參考岳虹等［7］方法：稱取桔梗粉末2 g，準(zhǔn)確加入80%甲醇30 mL，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，離心并過(guò)濾，重復(fù)3次，合并濾液，最后定容至2 mL容量瓶備用。提取液過(guò)0.22 μL微孔濾膜，采用HPLC-ELSD法測(cè)定桔梗根中桔梗皂苷含量，色譜柱：C18分析柱（250 mm×4.6 mm），DAD檢測(cè)器，流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；ELSD檢測(cè)器，漂移管溫度為75℃，霧化管溫度75℃，載氣（N2）流量為2.5 L/min；進(jìn)樣量：12 μL，流動(dòng)相：乙腈（A）和0.2%甲酸（B）。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算各桔梗皂苷含量。

1.2.5 桔梗總皂苷測(cè)定 桔?？傇碥諟y(cè)定采用香草醛—硫酸比色法，參考張堅(jiān)等［8］方法：精確稱取3.8 mg桔梗皂苷D置10 mL容量瓶中，甲醇定容得對(duì)照品溶液。稱取對(duì)照品溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL置10 mL具塞試管中，水浴干燥后加入10%香草醛試液0.5 mL，60%硫酸4.5 mL，于60℃水浴加熱15 min，冰水浴中冷卻3 min，以不加皂苷的樣品為空白對(duì)照，檢測(cè)波長(zhǎng)470 nm，得回歸方程Y =0.0007X-0.0263，R2=0.999 6，計(jì)算桔?？傇碥蘸?。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析與整理，以 SPSS 20.0 和 DPS 19.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用Orign 2018 64bit軟件制圖。

2 結(jié)果

2.1 不同磷水平AM真菌對(duì)桔梗侵染效果分析

2.1.1 不同磷水平AM真菌對(duì)桔梗侵染率、侵染強(qiáng)度的探究 從圖1中可以看出，在同一磷水平時(shí)，接種FM、RI和DE的處理侵染率均顯著高于未接種處理（P＜0.05）。土著菌對(duì)未接種植株也具有一定侵染率，且各處理侵染率均隨著磷水平的升高而升高，且在P2水平達(dá)到最大值（RI除外），分別為57.7%、38.3%、41.7%。侵染強(qiáng)度的變化與侵染率的變化大體趨勢(shì)一致，在同一磷水平，接種3種AM真菌的處理侵染強(qiáng)度均顯著高于未接種處理（P＜0.05），隨著磷水平的升高而升高，且在P2水平達(dá)到最大值，3種處理侵染強(qiáng)度分別為50%、30%、25%。在同一水平下，接種FM真菌的處理侵染率和侵染強(qiáng)度均高于RI和DE處理，說(shuō)明FM與植物的親和力大于RI和DE。由此可見(jiàn)適量的磷能促進(jìn)菌根的侵染，而過(guò)量磷反而抑制其侵染。

圖1 AM真菌和磷水平對(duì)桔梗侵染率、侵染強(qiáng)度的影響Fig.1 Effects of AMF and phosphorus level on the infection rate and infection intensity of P. grandiflorum

2.1.2 不同磷水平土壤中AM真菌的孢子量的探究 由圖2可知，未接種處理中也發(fā)現(xiàn)了真菌孢子，應(yīng)該為土壤中土著菌產(chǎn)生。在同一磷水平下接種FM處理組顯著高于其他處理組（P＜0.05），無(wú)論在何種磷水平時(shí)，接種3種AM真菌的處理土壤AM真菌孢子數(shù)均顯著高于未接種處理（P＜0.05）。接種處理與未接種處理的土壤AM真菌孢子數(shù)隨著磷水平的升高而升高，且在P2水平達(dá)到最大值，分別為215個(gè)/克土、205個(gè)/克土、133個(gè)/克土。

圖2 AM真菌和磷水平對(duì)土壤AM真菌孢子數(shù)的影響Fig. 2 Effects of AMF and phosphorus level on the spore number of AMF in soil

2.2 不同磷水平AM真菌對(duì)桔梗生物量的影響

由表1可知，接種FM、RI和DE后，桔梗株高、根干重、根鮮重、根粗、根長(zhǎng)均有不同程度的提高，且隨著磷水平的升高呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)，在P2水平時(shí)達(dá)到最大值。在P2水平下，與未接種對(duì)照相比，桔梗株高差異不顯著；桔梗根干重分別增加43%、31%、7%；桔梗根鮮重分別增加114%、62%、90%；桔梗根粗分別增加26%、25%、24%。雙因素方差分析結(jié)果（表2）表明，磷水平對(duì)桔梗株高、根干重、根鮮重、根粗、根長(zhǎng)有顯著影響（P＜0.05）；AM真菌對(duì)桔梗株高、根干重、根鮮重、根粗、根長(zhǎng)有顯著影響（P＜0.05）；且二者對(duì)桔梗株高、根干重、根鮮重有顯著交互作用（P＜0.05）。

表1 AM真菌和施磷量對(duì)桔梗生物量的影響Table 1 Effects of AMF and phosphorus application rate on P. grandiflorum biomass

表2 磷水平和AM真菌對(duì)桔梗生長(zhǎng)指標(biāo)的雙因素方差分析Table 2 Two-way ANOVA of phosphorus level and AMF on the growth indexes of P. grandiflorum

2.3 不同磷水平AM真菌對(duì)桔?？鼓嫘缘挠绊?/h3>

2.3.1 不同磷水平AM真菌對(duì)桔梗保護(hù)酶活性的影響 根據(jù)圖3可知，接種AM真菌后的植株其SOD、POD活性較未接種植株有明顯提高（P＜0.05），隨著磷水平的升高，無(wú)論是接種植株還是未接種植株其SOD活性均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，且在P2水平時(shí)達(dá)到最大值分別為720.25 U/g、655.78 U/g、623.88 U/g，較CK組分別提高了25%、14%、8%。在同一磷水平下，3種接種AM真菌處理的POD活性大小分別為，F(xiàn)M＞RI＞DE，且在P2水平達(dá)到最大值分別為156 U/g、150.67 U/g、136 U/g，較CK組分別提高了25%、21%、9%。

圖3 不同處理桔梗葉中保護(hù)酶活性變化Fig. 3 Variations of protective enzyme activities in P.grandiflorum leaves under different treatments

2.3.2 不同磷水平AM真菌對(duì)桔梗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和丙二醛含量的影響 由圖4可知，在同一磷水平下，接種FM、RI和DE后，其可溶性糖和可溶性蛋白含量均顯著高于未接種植株（P＜0.05）。隨著磷水平的不斷升高，可溶性糖和可溶性蛋白均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，且在P2水平時(shí)達(dá)到最大值。在P2水平時(shí)，與未接種處理相比，可溶性糖分別提高71%、70%、38%；可溶性蛋白分別提高75%、52%、16%。根據(jù)圖4可知，在同一磷水平下，接種AM真菌后的植株二者含量均顯著低于未接種植株（P＜0.05），說(shuō)明接種AM真菌可在一定程度上降低脯氨酸和丙二醛含量，從而緩解植株遭受的環(huán)境脅迫，增強(qiáng)植株抗逆性。

圖4 不同處理桔梗葉中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及丙二醛含量變化Fig. 4 Changes of osmotic adjustment substance and malondialdehyde content in P.grandiflorum leave under different treatments

雙因素方差分析結(jié)果（表3）表明，磷水平和AM真菌均對(duì)桔梗葉片SOD、POD、可溶性糖、可溶性蛋白、MDA、PRO有顯著影響（P＜0.05）；且二者對(duì)桔梗桔梗葉片SOD、POD、可溶性糖、可溶性蛋白、MDA、PRO有顯著交互作用（P＜0.05）。

表3 磷水平和AM真菌對(duì)桔梗抗性指標(biāo)的雙因素方差分析Table 3 Two-way ANOVA of phosphorus level and AMF on resistance index of P.grandiflorum

2.4 不同磷水平AM真菌對(duì)桔梗皂苷積累的影響

由圖5可知，在同一磷水平下，接種后的植株桔梗皂苷含量均顯著高于未接種植株（P＜0.05）。接種FM、RI和DE后，桔梗皂苷含量隨著磷水平的升高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，且在P2水平達(dá)到最大值。在P2水平下，與未接種對(duì)照相比，桔梗皂苷D含量分別增加20%、18%、16%；桔梗皂苷D3含量分別增加29%、11%、22%；去芹糖桔梗皂苷D含量分別增加22%、5%、8%；去芹糖桔梗皂苷D3含量分別增加21%、11%、17%；總皂苷含量分別增加19%、7%、11%。

圖5 各處理間桔梗皂苷含量變化Fig. 5 Variations of platycodin content in different treatments

雙因素方差分析結(jié)果（表4）表明，磷水平和AM真菌均對(duì)桔梗皂苷D、桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、去芹糖桔梗皂苷D3、總皂苷有顯著影響（P＜0.05）；且二者對(duì)桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、去芹糖桔梗皂苷D3、總皂苷有顯著交互作用（P＜0.05），對(duì)桔梗皂苷D無(wú)顯著交互作用（P＞0.05）。

表4 磷水平和AM真菌對(duì)桔梗皂苷的雙因素方差分析Table 4 Two-way ANOVA of phosphorus level and AMF on platycodin

3 討論

AM真菌能否在植物根系成功定殖是其與植物共生的基礎(chǔ)，因此侵染率成為衡量植物根系與真菌共生情況的一個(gè)重要指標(biāo)［9］。本研究表明，土著AM真菌對(duì)桔梗也存在一定程度的侵染，其侵染率最高可達(dá)21.3%。接種AM真菌后，在P2水平時(shí)，菌根侵染率、侵染強(qiáng)度、孢子數(shù)比P0水平時(shí)顯著增加，當(dāng)達(dá)到P3水平時(shí)菌根侵染率降低，由此表明，適宜磷水平可以促進(jìn)AM真菌侵染植物根系，過(guò)高或過(guò)低磷水平均不利于AM真菌侵染。研究證實(shí)，當(dāng)土壤速效磷含量較高時(shí)，植物體內(nèi)的磷含量也會(huì)變高，使得其根部細(xì)胞膜的滲透性降低，導(dǎo)致根系分泌物減少，而這會(huì)使AM真菌大大減少與根系形成二次侵入的機(jī)會(huì)，進(jìn)而降低了AM真菌侵染率［10］，當(dāng)土壤速效磷含量較低時(shí)，一方面桔梗生長(zhǎng)發(fā)育需要磷，另一方面AM真菌的生長(zhǎng)發(fā)育也需要一部分磷。當(dāng)土壤磷含量無(wú)法同時(shí)滿足兩方面的需求時(shí)，AM真

菌的生長(zhǎng)就受到一定水平的抑制，導(dǎo)致其侵染率較低。此外，在同一磷水平時(shí)，F(xiàn)M侵染率、侵染強(qiáng)度、孢子數(shù)均高于另外兩個(gè)菌種，表明其在栽培桔梗中比另外兩個(gè)菌種更具應(yīng)用潛力。因此要將AM真菌的接種效應(yīng)發(fā)揮到最大化，應(yīng)該篩選適合宿主植物的AM真菌種類，并確定其最適磷水平，以確保菌根共生體生長(zhǎng)狀況達(dá)到最優(yōu)，更大程度地提高AM真菌的促生作用。

植物在遭受某些逆境脅迫時(shí)，會(huì)使SOD、POD等保護(hù)酶的活性大幅升高，迅速清除活性氧［11］。本研究表明，在P0和P3水平時(shí)，接種植株SOD、POD活性顯著高于未接種植株，說(shuō)明植物在低磷和高磷條件時(shí)，會(huì)增加體內(nèi)保護(hù)酶來(lái)抵抗不良環(huán)境的影響，而接種AM真菌可以提高保護(hù)酶的活性，保護(hù)植物免受傷害，這與楊國(guó)等［12］研究結(jié)果一致。此外，在同一磷水平下，F(xiàn)M、DE及RI三種菌種均可提高SOD、POD活性，且FM提升效果優(yōu)于DE和RI。在適宜磷水平時(shí)，接種AM真菌后能顯著提高桔梗SOD、POD活性，說(shuō)明接種AM真菌可以提高桔梗抵抗逆境的能力，這可能是AM真菌提高桔?；钚匝跚宄芰Γ涌烨宄踝杂苫慕Y(jié)果。此外，植物還可通過(guò)滲透調(diào)節(jié)來(lái)增強(qiáng)自身抗逆性［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，P0和P3水平時(shí)，接種與未接種植株可溶性糖、可溶性蛋白含量降低，而脯氨酸和丙二醛含量升高，這與滕華容等［14］研究結(jié)果相似。接種AM真菌后，桔梗植株可溶性糖、可溶性蛋白的含量顯著高于未接種植株，脯氨酸含量顯著低于未接種植株，說(shuō)明接種AM真菌通過(guò)增強(qiáng)植物對(duì)水分的吸收，緩解植物受到不良環(huán)境的脅迫，進(jìn)而增強(qiáng)植物抗逆性，與趙金莉等［15］研究結(jié)果一致，AM真菌可以通過(guò)調(diào)控植物體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，進(jìn)而幫助機(jī)體抵御逆境，增強(qiáng)其環(huán)境適應(yīng)性。本試驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為FM比RI和DE更有利于桔?？扇苄缘鞍缀涂扇苄蕴堑奶岣撸R國(guó)輝等［16］認(rèn)為RI比FM更有利于植株可溶性蛋白的形成，這可能是因?yàn)锳M真菌對(duì)宿主植物某些指標(biāo)的促進(jìn)作用并不只受菌種的影響，還與宿主植物的種類、管理?xiàng)l件、培養(yǎng)基質(zhì)等條件有關(guān)。

在不同土壤磷水平下，接種 AM 真菌能緩解磷限制并促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)［17］。本研究結(jié)果表明，接種同一菌種后，P1、P2、P3水平的根鮮重顯著高于P0水平，且P2水平時(shí)達(dá)到最高。在同一磷水平接種3種AM真菌后的根鮮重顯著高于未接種桔梗，3種AM真菌的根鮮重差異不顯著。說(shuō)明在適宜磷水平接種AM真菌可以促進(jìn)桔梗生長(zhǎng)提高其生物量。AM真菌可通過(guò)與植物共生引起的代謝變化來(lái)影響藥用植物有效成分含量［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，接種FM后的植株桔梗皂苷含量顯著高于接種RI、DE及未接種植株，說(shuō)明FM菌種較RI和DE菌種更具優(yōu)勢(shì)。有學(xué)者認(rèn)為［19］，植物次生代謝產(chǎn)物是植物面對(duì)外界環(huán)境刺激時(shí)做出的防御性反應(yīng)。接種AM真菌后桔梗皂苷含量顯著提升，推測(cè)可能是桔梗將AM真菌作為外界環(huán)境的刺激而產(chǎn)生的系統(tǒng)防御應(yīng)答，這與前人的研究結(jié)果一致［20］。同時(shí)，各處理在P2水平下，桔梗皂苷含量達(dá)到最高，說(shuō)明磷水平過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響桔梗皂苷含量。磷水平過(guò)低，不能滿足桔梗和AM真菌的生長(zhǎng)需求，使菌根共生體生長(zhǎng)受到極大限制；當(dāng)磷水平過(guò)高時(shí)，桔梗自身吸收的養(yǎng)分足以維持自身各種代謝，AM真菌的效果就不顯著［21］，另一方面過(guò)高的磷水平使AM真菌的生長(zhǎng)和代謝活性下降，導(dǎo)致菌根共生體吸收養(yǎng)分受到一定的限制［19］，進(jìn)而使桔梗皂苷合成受阻。適宜磷水平接種AM真菌可以誘導(dǎo)桔梗次生代謝過(guò)程的變化，更有利于桔梗皂苷的積累。

4 結(jié)論

FM、RI和DE均可與桔梗共生，不同磷水平接種不同AM真菌在促進(jìn)桔梗生長(zhǎng)、增強(qiáng)桔?？鼓嫘?、提高桔梗皂苷積累等方面存在不同程度的差異，綜合分析在80 mg/kg磷水平時(shí)，接種AM真菌效果最好，且FM優(yōu)于RI和DE。