甜瓜黑斑病菌的拮抗細菌篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化

施兆榮 孫述俊 張廣榮 梅大海 劉彥超 楊成德

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學植物保護學院/甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室，蘭州 730070；2.甘肅省白銀市農(nóng)業(yè)技術服務中心，白銀 730900）

甜瓜（Cucumis melo L.）果肉含有豐富的水分和維生素，市場需求量大且經(jīng)濟效益高，因此在世界各地均有栽培，我國甜瓜生產(chǎn)為華東、中南、西北主產(chǎn)區(qū)三足鼎立的布局。近年來，甜瓜連年種植，重茬面積越來越大，病原菌積累越來越多，導致甜瓜病害發(fā)生日趨嚴重，特別是甜瓜黑斑病更是普遍發(fā)生的病害之一［1-2］。甜瓜黑斑病是由鏈格孢屬（Alternaria spp.）真菌引起的嚴重病害，發(fā)病后多數(shù)葉片染病枯死，同時可危害成熟期果實。目前化學防治是最主要的防治措施，但長期使用化學農(nóng)藥極易使病原菌產(chǎn)生抗性，也會在果實上造成農(nóng)藥殘留污染環(huán)境。由于生物防治是利用生物的代謝產(chǎn)物或生物體本身來拮抗病原菌，對環(huán)境和人類安全無害，因此利用優(yōu)良拮抗細菌對甜瓜病害進行生物防治已成為目前研究的熱點之一，如李怡等［3］從甜瓜根際酸性土壤中分離篩選到1株耐鋁甜瓜枯萎病的拮抗菌 A2（Pseudomonas sp.），楊良等［4］從新疆甜瓜根際土壤中分離到1株甜瓜細菌性斑點病拮抗菌P-13（Streptomyces rochei），馬英元等［5］從高抗甜瓜品種內(nèi)分離出枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）Mg15，其對甜瓜白粉病具有顯著防治效果，劉建利等［6］報道烏拉爾甘草的8株內(nèi)生細菌對甜瓜采后病害抑制能力較強。但有關利用甜瓜內(nèi)生細菌防治其病害的報道未見報道。因此，本試驗通過平板稀釋分離法從健康甜瓜植株中分離內(nèi)生細菌，篩選甜瓜黑斑病菌的優(yōu)良拮抗菌，對其進行形態(tài)學和分子生物學鑒定，并進行發(fā)酵條件優(yōu)化，旨在為甜瓜黑斑病的生物防治提供菌種資源，也為內(nèi)生細菌資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 供試病原真菌：甜瓜黑斑病菌（Alternaria tenuissima）保存于甘肅農(nóng)業(yè)大學植物保護學院植物病理實驗室。

供試拮抗內(nèi)生細菌：分離自2020年6月采集的健康甜瓜植株。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 供試培養(yǎng)基A：馬鈴薯200 g，蛋白胨10 g，蔗糖20 g，水1 000 mL；B：NYD培養(yǎng)基；C：LB培養(yǎng)基；D：玉米淀粉3 g，（NH4）2SO410 g，KH2PO415 g，蔗糖 10 g，水 1 000 mL；E：BPY培養(yǎng)基；F：NA培養(yǎng)基；G：YPG培養(yǎng)基；參考文獻［7-9］配制。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生細菌的分離及拮抗菌株的篩選 將采集到的甜瓜根、莖、葉和果實采用平板稀釋法分離內(nèi)生細菌，為了檢驗分離材料表面是否還存在活微生物，先將表面殺菌消毒后最后一遍沖洗的無菌水涂布在培養(yǎng)基平板上，將培養(yǎng)皿放在與分離的內(nèi)生細菌相同溫度環(huán)境下的恒溫箱中培養(yǎng)3-5 d。若發(fā)現(xiàn)皿中無菌落出現(xiàn)，證明分離到的微生物是內(nèi)生菌，否則，該分離結果不能使用［10］。挑取不同形態(tài)的單菌落采用平板劃線法純化并編號保存?zhèn)溆谩?/p>

以甜瓜黑斑病菌為指示菌，采用平板對峙法［11］篩選拮抗內(nèi)生細菌。抑制率（%）=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/（對照組菌落-菌餅直徑）×100%。

采用離體甜瓜接種。在表皮光滑、健康的甜瓜果實上用接種針制造傷口，接種濃度為107CFU/mL的甜瓜黑斑病病原菌孢子懸浮液，36 h后接種初步篩選的拮抗細菌的菌液，并用接種清水作對照3次重復，7 d后測量病斑大小，計算防治效果。

(2) 任給O1,O2∈O(X),csO1,csO2∈τ,下證csO1∩csO2∈τ。由O1∩O2∈O(X),又只需證csO1∩csO2=cs(O1∩O2)即可。

防效（%）=（對照病斑直徑-處理病斑直徑）/對照病斑直徑×100%。

1.2.2 優(yōu)良拮抗細菌的鑒定 形態(tài)學鑒定：將純化后的優(yōu)良內(nèi)生拮抗細菌接于NA培養(yǎng)基，置28℃恒溫箱中培養(yǎng)3 d后，觀察描述菌落形態(tài)，18-24 h菌齡進行革蘭氏染色并在顯微鏡下觀察、拍照［12］。

分子生物學鑒定：利用TIANGEN細菌基因組DNA試劑盒按其說明方法提取內(nèi)生細菌的基因組DNA。使用通用引物 27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）/1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進行16S rDNA的PCR擴增。擴增體系為50 μL，反應體系 ：Mix 25 μL、DNA 2 μL、27F和 1492R 各 2 μL、ddH2O 19 μL；擴增程序為94℃預變性5 min；94℃變性1 min，48℃退火30 min，72℃延伸1 min，32個循環(huán)，最后72℃延伸8 min。使用gyrB基因引物：UP-1（5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′）/UP-2R（5′-AGCAGGGTAC GGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3′）進行gyrB序列擴增。50 μL反應體系與16S rDNA的反應體系相同；反應程序：94℃預變性4 min，94℃變性1 min，57℃退火1 min，72℃延伸70 s，35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。將PCR擴增產(chǎn)物送蘭州天啟基因公司測序，將測得的序列與GenBank中的相關數(shù)據(jù)進行Blast相似性分析，并與GenBank數(shù)據(jù)庫中已報道的相似序列用Mega（7.0）軟件的鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 優(yōu)良拮抗內(nèi)生細菌發(fā)酵條件優(yōu)化

1.2.3.1 種子液制備 將優(yōu)良拮抗內(nèi)生細菌接種于裝有50 mL NA培養(yǎng)基的150 mL錐形瓶中，在28℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)24 h，制得種子液備用。

1.2.3.2 基礎培養(yǎng)基的優(yōu)化 將1.1.2中的供試培養(yǎng)基A-G溶液裝入150 mL的錐形瓶中50 mL，3次重復，滅菌后接入2 mL種子液，在溫度28℃、轉速180 r/min的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)24 h，通過測定發(fā)酵菌液的OD600確定生物量，以確定最佳基礎培養(yǎng)基。

1.2.3.3 碳源、氮源和無機鹽優(yōu)化 分別以蔗糖、玉米淀粉、麥芽糖、甘露醇和D-果糖代替1.2.3.2優(yōu)化的基礎培養(yǎng)基中的碳源，以無碳源作對照；以尿素、（NH4）2SO4、KNO3、NH4Cl和硝酸鈉代替基礎培養(yǎng)基中的氮源，以無氮源作對照；以KH2PO4、CuSO4、CaCl2、NaCl、ZnSO4和 CaCO3代替培養(yǎng)基中的無機鹽，以不加無機鹽為對照。其他方法同1.2.3.2，優(yōu)化碳源、氮源和無機鹽。

1.2.3.4 正交試驗 將優(yōu)化的最佳碳、氮源和無機鹽分別設置為 0、5、10、15、20、25、30 g/L，其他方法同1.2.3.2，優(yōu)化碳、氮源和無機鹽最適濃度。

表1 L9（33）正交試驗設計Table 1 Design of L9（33）orthogonal experiment

1.2.3.5 培養(yǎng)條件優(yōu)化 采用優(yōu)化培養(yǎng)基組合，依次進行發(fā)酵條件優(yōu)化，并將優(yōu)化結果應用于下一條件優(yōu)化。設置轉速為 120、150、180、210 和 240 r/min，溫度為20、24、28、32和36℃，150 mL錐形瓶裝液量為10、30、50和70 mL，接種量為0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、1%、5%、10%、15%和20%，pH為4、5、6、7、8、9、10和自然條件下的pH7.5；每個處理重復3次，測定發(fā)酵液的吸光度（OD600），優(yōu)化培養(yǎng)條件。

1.2.3.6 最適發(fā)酵時間優(yōu)化 采用優(yōu)化最適培養(yǎng)基組合與最佳發(fā)酵條件，設置發(fā)酵時間為2、4、6、12、18、24、30、36、42、48、54、60 和 72 h， 每個處理重復3次，測定發(fā)酵液的吸光度（OD600），確定最適發(fā)酵時間。

2 結果

2.1 內(nèi)生細菌的分離及拮抗菌株的篩選

從采集到的健康甜瓜植株上共分離獲得50株內(nèi)生細菌，21株對甜瓜黑斑病菌具有拮抗作用（表2），其中G2的抑菌率最高，達76.41%（圖1）。

圖1 菌株G2對甜瓜黑斑病菌的拮抗效果Fig.1 Effect of strain G2 against melon black spot

表2 甜瓜黑斑病菌拮抗菌的篩選Table 2 Screening of antagonistic bacteria against melon black spot

拮抗菌株對甜瓜黑斑病的防效試驗結果表明（表3），菌株G2病斑大小明顯小于清水對照。處理7 d后，菌株G2對甜瓜黑斑病的防效達到44.90%。

表3 拮抗菌株對甜瓜黑斑病的防效Table 3 Control effects of antagonistic strains on melon black spot

2.2 拮抗菌株G2的鑒定

2.2.1 形態(tài)學鑒定 菌株G2在NA培養(yǎng)基上菌落呈白色近圓形，表面干燥，無光澤，邊緣不規(guī)則，不透明，菌落中間褶皺突起（圖2-A）；革蘭染色呈陽性，菌體呈桿狀，兩端鈍圓（圖2-B）。

圖2 菌株G2的單菌落（A）和革蘭氏染色（B）Fig.2 Colony（A）and Gram stain（B）of strain G2

2.2.2 基因序列分析鑒定 以菌株G2的DNA為模板，采用16S rDNA與gyrB序列對其進行擴增和測序，分別獲得1 444 bp和1 191 bp的基因片段（GenBank登錄號分別為MW467894、MW490569），對其進行BLAST分析比對并構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），結果顯示與16S rDNA基因序列與枯草芽孢桿菌同源性達到100%和99%，gyrB序列與枯草芽孢桿菌同源性達到97%和96%，且在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚在一起，結合形態(tài)特征將其鑒定為枯草芽孢桿菌。

圖3 菌株G2基于16S rDNA和gyrB序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain G2 based on 16S rDNA and gyrB sequence

2.3 拮抗內(nèi)生細菌發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 基礎培養(yǎng)基優(yōu)化 結果表明，菌株G2在G培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h時生物量最大，其OD600為2.219，顯著高于其它培養(yǎng)基（P＜0.05），說明G培養(yǎng)基為最適基礎培養(yǎng)基（圖4）。

圖4 基礎培養(yǎng)基對菌株G2生長的影響Fig.4 Effect of basal medium on the growth of strain G2

2.3.2 碳源、氮源和無機鹽優(yōu)化 單因素試驗結果表明，菌株G2在以玉米淀粉為碳源時OD600值最小為0.710，說明玉米淀粉不利于G2的生長，以蔗糖、D-果糖或葡萄糖為碳源時其生物量顯著高于其它碳源（P＜0.05），OD600分 別 為 2.223、2.239和 2.219，且三者間差異不顯著，但由于葡萄糖成本較低，性價比較高，因此選擇葡萄糖作為最佳碳源（圖5）；以硝酸鈉和蛋白胨為氮源時發(fā)酵菌液OD600值顯著高于其它氮源（P＜0.05），且兩者差異不顯著，由于硝酸鈉成本較低，因此選用硝酸鈉作為最佳氮源（圖6）；由于G培養(yǎng)基中沒有無機鹽的存在，參考其它含量配比將無機鹽的濃度統(tǒng)一設置為5 g/L，試驗結果表明以CuSO4、ZnSO4和CaCl2為無機鹽時顯著低于不加無機鹽時發(fā)酵菌液吸光值，說明其抑制G2的生長，以NaCl為無機鹽時OD600最大為2.233，且NaCl更加常見、易于儲存，所以選擇NaCl作為最佳無機鹽（圖7）。

圖5 碳源對菌株G2生長的影響Fig.5 Effects of carbon sources on the growth of strain G2

圖6 氮源對菌株G2生長的影響Fig.6 Effects of nitrogen sources on the growth of strain G2

圖7 無機鹽對菌株G2生長的影響Fig.7 Effects of inorganic salts on the growth of strain G2

2.3.3 正交試驗優(yōu)化 當葡萄糖濃度在20、25或30 g/L時發(fā)酵液吸光值顯著高于其它濃度（P＜0.05）（圖8）；當硝酸鈉在25 g/L時發(fā)酵液吸光值最大，其次為15 g/L和20 g/L（圖9）；當NaCl在0和5 g/L時發(fā)酵菌液吸光值較高，其次為15 g/L（圖10）。因此選擇葡萄糖的濃度為20、25或30 g/L，硝酸鈉的濃度為15、20或25 g/L，NaCl的濃度為0、5和15 g/L進行正交試驗。

圖8 葡萄糖濃度對菌株G2生長的影響Fig.8 Effects of glucose concentration on the growth of strain G2

圖9 NaNO3濃度對菌株G2生長的影響Fig.9 Effects of sodium nitrate on the growth of strain G2

圖10 NaCl濃度對菌株G2生長的影響Fig.10 Effects of sodium chloride on the growth of strain G2

正交試驗結果表明（表4），6號處理的生物量最高，OD600為2.586，高于最優(yōu)展望組合：葡萄糖20 g、硝酸鈉25 g、NaCl 10 g、酵母膏10 g和水1 000 mL的OD600值2.543，但與除1、9與CK外無顯著差異，由于處理6所需成本較低，故確定最適宜菌株G2生長的碳源、氮源和無機鹽的濃度配比為葡萄糖20 g、硝酸鈉30 g、酵母膏10 g和水1 000 mL。

表4 正交試驗優(yōu)化Table 4 Orthogonal experiment

2.3.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.3.4.1 轉速優(yōu)化 菌株G2在120-150 r/min均能生長，在轉速為120 r/min時，發(fā)酵液OD600值為1.779，顯著低于其它轉速（P＜0.05），菌株在轉速為150 r/min時，發(fā)酵液OD600值最大，為2.354（圖11），因此最佳轉速為150 r/min。

2.3.4.2 溫度優(yōu)化 在20℃時發(fā)酵液的OD600僅為0.114，顯著低于其它溫度（P＜0.05），在32℃時菌株生物量達到最大，OD600為2.652，之后生物量隨溫度的增加呈下降趨勢（圖12），因此菌株生長的最適溫度為32℃。

圖12 溫度對菌株G2生長的影響Fig.12 Effects of temperature on the growth of strain G2

2.3.4.3 裝液量和接種量優(yōu)化 當裝液量為30 mL或50 mL時其發(fā)酵液OD600值分別為2.655和2.693（圖 13），顯著高于其它條件（P＜0.05），但兩者之間差異不顯著，由于在裝液量為50 mL時更為經(jīng)濟，因此最佳裝液量為150 mL搖瓶中裝液50 mL。

圖11轉速對菌株G2生長的影響Fig.11 Effects of rotation speed on the growth of strain G2

圖13 裝液量對菌株G2生長的影響Fig.13 Effects of liquid volumes on the growth of strain G2

對接種量的優(yōu)化結果表明（圖14），當接種量超過0.5%后菌株的生物量隨著接種量的增加而逐漸減少，接種量在0.1%-0.5%之間差異不顯著，但在0.2%時OD600值最大，為2.758，因此確定最佳接種量為0.2%。

圖14 接種量對菌株G2生長的影響Fig.14 Effects of inoculation size onthe growth of strain G2

2.3.4.4 初始pH優(yōu)化 試驗結果表明（圖15），菌株G2在pH為5-10均能正常生長，當pH為5-9時生物量較大，顯著高于pH為4和10（P＜0.05），但各處理之間差異不顯著，其中由蒸餾水直接配制的培養(yǎng)基（對照）的pH值為7.5，其OD600最大為2.554，因此最適初始pH為7.5。

圖15 不同pH對菌株G2生長的影響Fig.15 Effects of different pH values on the growth of strain G2

2.3.5 最適發(fā)酵時間優(yōu)化 結果表明（圖16），菌株G2的延緩期為4 h，之后進入對數(shù)期，到18 h菌株的生物量逐漸趨于穩(wěn)定，此時OD600為2.654。因此菌株最佳發(fā)酵時間為18 h。

圖16 發(fā)酵時間對菌株G2生長的影響Fig.16 Effects of fermentation time on the growth of strain G2

3 討論

甜瓜黑斑病是由鏈格孢菌引起的甜瓜重要病害之一，然而長期、連續(xù)用藥使病原菌產(chǎn)生了抗藥性，導致化學藥劑防治效果逐年下降，并且化學藥劑殘留嚴重污染農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境，危及人畜健康。消費者對食品中的農(nóng)藥殘留和環(huán)境安全日益關注，對開發(fā)病害控制的替代方法的需求也在不斷增加［13］。內(nèi)生細菌存在于宿主植物的內(nèi)部組織中，可以在植物體內(nèi)繁殖和生長，不易受環(huán)境條件影響，在自然發(fā)生的生物防治和人工應用于植物病害生物防治實踐中，都顯示出良好的優(yōu)勢和應用前景，成為生物防治中有潛力的生防菌而加以利用［14］。本試驗從甜瓜健康植株的根、莖、葉和果實中采用平板稀釋法分離出內(nèi)生細菌50株，與高增貴等［15］從25葉期甜瓜根莖部共分離純化了內(nèi)生細菌81株相比本試驗分離數(shù)量較少，與馬元英等［5］從甜瓜高抗白粉病品種MR-1′不同組織中共分離純化到31株內(nèi)生細菌相比本試驗分離數(shù)量較多，這可能與植株的生育期和品種等有關，也可能是化學消毒劑的使用導致內(nèi)生細菌數(shù)量和種類減少；本試驗利用細極鏈格孢作指示菌進行平板對峙試驗，21株內(nèi)生細菌抑菌率在70%以上，占總菌株的42%，其中菌株G2抑菌率最高，達76.41%，高于蘭琴英等［16］從紅豆杉中分離的TB02和TB03對細極鏈格孢的抑制率，可見菌株G2在防治細極鏈格孢引起的病害時具有較大潛力。

近年來微生物分類更新周期快，對菌株準確鑒定的難度越來越大，因此需要將傳統(tǒng)的方法與先進的分子生物學方法相結合，本試驗根據(jù)病原菌形態(tài)學特征，結合16S rDNA與gyrB基因分析將菌株G2鑒定為枯草芽孢桿菌。目前在國內(nèi)外的研究中，枯草芽孢桿菌由于其次級代謝產(chǎn)物多、對環(huán)境友好等優(yōu)勢成為生防菌關注的熱點之一［17］，如利用枯草芽孢桿菌防治葡萄灰霉?。˙otrytis cinerea）［18］、庫爾勒香梨黑頭病（Alternaria brassicicola）［19］、小麥赤霉?。‵usarium graminearum）［20］和玉米葉斑?。˙ipolaris papendorfii）［21］。

發(fā)酵條件的優(yōu)化是提高生物農(nóng)藥制劑的抑菌效果、節(jié)約其生產(chǎn)成本的關鍵問題，也是生防菌株從實驗室走向市場的重要步驟［22］。目前，研究微生物發(fā)酵條件優(yōu)化的方法有單因素法、多因子法、正交實驗法和響應面法等，這些方法都有自身的優(yōu)點和缺陷。本試驗采用單因素法和正交試驗法對枯草芽孢桿菌菌株G2進行液體發(fā)酵條件優(yōu)化，結果表明最適發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖20 g、硝酸鈉30 g、酵母膏10 g和水1 000 mL；最優(yōu)發(fā)酵條件為搖床轉速150 r/min，溫度32℃，150 mL搖瓶裝液50 mL，最佳接種量為0.2%，培養(yǎng)基初始pH為7.5；其最佳發(fā)酵時間為18 h。該研究與陳莉等［23］報道的發(fā)酵時間相同，但裝液量較高、最佳轉速與溫度較低，因此更高效；與張慧等［24］對枯草芽胞桿菌CS27的研究結論除接種量相差很大外其他發(fā)酵條件均一致，本試驗接種量為0.2%遠遠低于文獻報道的10%，可能是因菌株G2對培養(yǎng)條件的要求較低，在發(fā)酵過程中可快速繁殖，節(jié)省成本和時間；大多數(shù)研究［23-24］表明枯草芽孢桿菌的最佳初始pH為6-7.5之間，與本試驗結果相似，說明該菌適宜在中性條件下生長；但培養(yǎng)基配方與其均有所差別，可能是由于菌株生物學特性差異所致。本試驗對篩選出的優(yōu)良拮抗菌進行了液體發(fā)酵，下一步將對田間防效進行試驗，以期能開發(fā)出穩(wěn)定性好、防效高的微生物源農(nóng)藥。

試驗結果表明枯草芽孢桿菌對細極鏈格孢引起的甜瓜黑斑有顯著抑制作用，為甜瓜黑斑病的生物防治提供菌種資源，也為內(nèi)生細菌資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。

4 結論

分離得到50株內(nèi)生細菌，21株對細極鏈格孢具有拮抗作用，11株的抑制率達到70%以上，其中菌株G2的抑菌率最高，達76.41%，經(jīng)形態(tài)特征和基因序列分析鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），其最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖20 g、硝酸鈉30 g、酵母膏10 g和水1 000 mL，最優(yōu)發(fā)酵條件為搖床轉速150 r/min，溫度32℃，150 mL搖瓶裝液50 mL，最佳接種量為0.2%，培養(yǎng)基初始pH為7.5，其最佳發(fā)酵時間為18 h。