蒺藜苜蓿MtSAG113基因的轉(zhuǎn)化及表達(dá)特征分析

李舒文 李殷睿智 董笛 王夢(mèng)迪 晁躍輝 韓烈保

（北京林業(yè)大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院，北京 100083）

MtSAG113基因是在蒺藜苜蓿中被發(fā)現(xiàn)的，該基因?qū)儆赑P2Cc超家族，為葉片發(fā)育和衰老時(shí)選擇性啟動(dòng)基因［7］。在調(diào)控植物葉片衰老方面具有一定的作用［8］。MtSAG113基因在植物抗衰老過(guò)程中具有高度的特異表達(dá)特性，在植物衰老葉片中可驅(qū)動(dòng)IPT（isopentenyl transferase）基因的表達(dá)，對(duì)內(nèi)源分裂素含量進(jìn)行有效調(diào)控，在不影響植株正常發(fā)育的前提下，達(dá)到延緩葉片衰老的目的［9］。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real time quantitative PCR，qRT-PCR）具有重復(fù)性好、靈敏度高、定量準(zhǔn)確和反應(yīng)迅速等優(yōu)點(diǎn)，已成為確定基因表達(dá)水平的最常用方法［10-11］。

本試驗(yàn)以煙草和蒺藜苜蓿R108葉片為材料，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法［12］轉(zhuǎn)化煙草，獲得具有抗性的轉(zhuǎn)基因植株以及檢測(cè)蒺藜苜蓿MtSAG113基因在逆境條件和激素誘導(dǎo)下的表達(dá)情況，研究MtSAG113基因的特異性表達(dá)，并通過(guò)亞細(xì)胞定位確定該基因位于細(xì)胞核內(nèi)，旨為進(jìn)一步探究MtSAG113基因的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用的煙草和蒺藜苜蓿為實(shí)驗(yàn)室種植，將煙草種植于組培瓶中，于無(wú)菌環(huán)境下培養(yǎng)20 d左右，進(jìn)行MtSAG113基因的轉(zhuǎn)化及亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)；蒺藜苜蓿R108種植在12 cm的花盆里，放置于人工培養(yǎng)箱中，植株大約培養(yǎng)20 d，然后對(duì)蒺藜苜蓿R108葉片進(jìn)行處理。剩下的植株繼續(xù)培養(yǎng)至葉片發(fā)黃。反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime ScriptRTReagent Kit、DNA提取試劑盒（Plant DNA Kit）、RNA提取試劑盒（Plant RNA Kit）購(gòu)自O(shè)MEGA公司。瓊脂、NaCl、6-BA、IAA、ABA購(gòu)買(mǎi)于Sigma公司，MtSAG113基因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 MtSAG113 基因轉(zhuǎn)化及處理 取長(zhǎng)勢(shì)健康的煙草葉片，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法進(jìn)行浸染轉(zhuǎn)化。將含有MtSAG113質(zhì)粒的農(nóng)桿菌震蕩培養(yǎng)至OD600=0.6-0.8時(shí)低速離心收集沉淀，然后使用MS溶液進(jìn)行重懸，即可得到侵染液。將煙草葉片剪碎，于侵染液中浸泡10 min，于接種培養(yǎng)基上27℃暗培養(yǎng)3 d，然后將其轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，待系帶培養(yǎng)3次后進(jìn)行誘芽和誘根培養(yǎng)，期間用草銨膦對(duì)轉(zhuǎn)化的葉片進(jìn)行篩選。取生長(zhǎng)至60 d左右的成熟蒺藜苜蓿和葉片變黃的衰老蒺藜苜蓿葉片進(jìn)行熒光定量，檢測(cè)MtSAG113基因在成熟和衰老葉片的表達(dá)量。選取生長(zhǎng)狀況良好且一致的蒺藜苜蓿R108葉片，分別浸泡于清水、含有15%的聚乙二醇（PEG）溶液、150 mmol/L NaCl營(yíng)養(yǎng)液、1 μmol/L 6-BA溶液、1 μmol/L IAA溶液、1 μmol/L ABA溶液中，處理時(shí)間為 0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h。按照DNA和RNA提取試劑盒的方法對(duì)所處理的葉片進(jìn)行DNA和RNA的提取，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，最后進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。選取長(zhǎng)勢(shì)良好的煙草，并將攜帶35S-MtSAG113-YFP質(zhì)粒的EHA105農(nóng)桿菌注射于該煙草中，黑暗培養(yǎng)48 h，在聚焦顯微鏡下觀察YFP信號(hào)在細(xì)胞中的位置。

對(duì)于本論文的探討方案和方法已經(jīng)到此為止了，個(gè)人認(rèn)為最后的結(jié)果還是有些差強(qiáng)人意，畢竟處理設(shè)計(jì)與人們的微妙關(guān)系不是那么容易做到的，對(duì)于不同的客戶，設(shè)計(jì)也有著不同的定向趨勢(shì)。相信設(shè)計(jì)在滿足其客戶的需求同時(shí)，滿足了好設(shè)計(jì)的基本概念，就可以在更大程度上滿足更多人的需求。

1.2.2 MtSAG113基因在激素誘導(dǎo)后的表達(dá)分析 植物外源激素已被研究證實(shí)可以參與植物非生物調(diào)節(jié)，在植物抗逆方面也有良好的調(diào)控作用［13-14］。外源植物激素對(duì)植物器官生長(zhǎng)發(fā)育、養(yǎng)分吸收、光合作用以及抗性生理都有一定的影響。同時(shí)外源激素對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的表達(dá)量也會(huì)產(chǎn)生一定的影響。對(duì)蒺藜苜蓿R108葉片進(jìn)行激素誘導(dǎo)處理，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)分析表達(dá)量。進(jìn)一步研究激素誘導(dǎo)對(duì)蒺藜苜蓿MtSAG113基因表達(dá)量的影響。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 將MtSAG113基因用NCBI網(wǎng)站進(jìn)行同源蛋白的查找及蛋白結(jié)構(gòu)域的分析。對(duì)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)通過(guò)Cell-PLoc package（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc/）網(wǎng)站完成。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)基因植株及鑒定

經(jīng)葉盤(pán)法對(duì)煙草進(jìn)行轉(zhuǎn)化，提取再生煙草植株的DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)。以再生植株的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果（圖1）表明，檢測(cè)的7株再生煙草植株中，有5株的DNA片段符合預(yù)期大小，未轉(zhuǎn)化成功的和野生型的煙草條帶大小則小于預(yù)期條帶。

圖1 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(cè)Fig.1 PCR detection of transgenic plants

提取再生植株的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以再生植株的cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，取RTPCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果（圖2）顯示，所獲得的目的片段符合預(yù)期大小，表明MtSAG113基因在煙草中成功表達(dá)。

圖2 轉(zhuǎn)基因煙草RT-PCR檢測(cè)Fig.2 RT-PCR detection of transgenic tobacco

2.2 轉(zhuǎn)基因煙草表型

將轉(zhuǎn)基因煙草苗與野生型煙草苗同時(shí)放于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)大約1個(gè)月，觀察其表型。觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草相比植株明顯矮小且葉片出現(xiàn)早衰現(xiàn)象（圖3）。

圖3 轉(zhuǎn)基因煙草表型Fig.3 Phenotype of transgenic tobacco

2.3 MtSAG113基因在蒺藜苜蓿葉片中的表達(dá)分析

對(duì)蒺藜苜蓿成熟葉片和衰老葉片進(jìn)行熒光定量分析，檢測(cè)MtSAG113基因在調(diào)控葉片衰老進(jìn)程的作用。結(jié)果（圖4，圖5）表明，MtSAG113基因在衰老葉片中表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未衰老葉片中的表達(dá)水平；衰老葉片的基因表達(dá)量是未衰老葉片的4.94倍。

圖4 MtSAG113基因在蒺藜苜蓿葉片中的表達(dá)分析Fig.4 Expression analysis of MtsAG113 gene in Medicago truncatula leaves

圖5 蒺藜苜蓿成熟衰老葉片對(duì)比Fig.5 Comparison of mature and senescent leaves of Medicago truncatula

2.4 MtSAG113基因未處理?xiàng)l件下的表達(dá)分析

清水處理0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、48 h后，熒光定量PCR檢測(cè)分析結(jié)果（圖6）顯示，0 h的MtSAG113基因表達(dá)量最高，處理4 h時(shí)達(dá)到最低，是0 h樣品的13倍，隨著清水處理的時(shí)間延長(zhǎng)，MtSAG113基因表達(dá)量有逐漸增加的趨勢(shì)，但仍然低于0 h。

圖6 蒺藜苜蓿MtSAG113基因未處理?xiàng)l件下的表達(dá)分析Fig.6 Expression analysis of MtsAG113 gene in Medicago truncatula under untreated conditions

2.5 MtSAG113基因干旱脅迫表達(dá)分析

通過(guò)PEG模擬干旱脅迫環(huán)境，在脅迫處理的0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h后進(jìn)行熒光定量分析，檢測(cè)MtSAG113基因在模擬干旱脅迫的表達(dá)情況。結(jié)果（圖7）顯示，脅迫2 h蒺藜苜蓿MtSAG113基因表達(dá)水平有所提高，為未處理的3.18倍；脅迫處理4 h后，MtSAG113基因的表達(dá)量大大提高，為對(duì)照樣品的95.96倍；在脅迫8 h時(shí)略有下降，但仍為對(duì)照樣品的62.41倍；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，并在24 h達(dá)到最大值，與對(duì)照處理相比增加了276.48倍。

圖7 蒺藜苜蓿MtSAG113基因的干旱脅迫表達(dá)Fig.7 Drought-stress expression of MtsAG113 gene in Medicago truncatula

2.6 MtSAG113基因鹽脅迫表達(dá)分析

作為一種重要的脅迫條件，高鹽對(duì)于很多基因的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用。通過(guò)熒光定量分析MtSAG113基因在鹽脅迫處理表達(dá)情況，結(jié)果（圖8）顯示經(jīng)NaCl處理后，MtSAG113基因的表達(dá)量與對(duì)照相比整體呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。在2 h后表達(dá)量逐漸增加，并在12 h達(dá)到高峰，是對(duì)照處理的49.96倍。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)水平逐漸降低，48 h表達(dá)水平有所回落，但與對(duì)照相比仍增加了54.4%。

圖8 蒺藜苜蓿MtSAG113基因的鹽脅迫表達(dá)Fig.8 Expression of MtsAG113 gene in Medicago truncatula under salt stress

2.7 細(xì)胞分裂素對(duì)MtSAG113影響

經(jīng)6-BA處理后，MtSAG113表達(dá)量呈現(xiàn)不同程度的增加，在誘導(dǎo)2 h時(shí)，出現(xiàn)緩慢的提高，與未處理樣品相比，增加了50.44%；在4 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值，是對(duì)照樣品的917.46倍；在8 h時(shí)，略有下降，但與對(duì)照相比增加了5.72倍；48 h時(shí)表達(dá)量為對(duì)照的6.47倍（圖9）。

圖9 6-BA誘導(dǎo)對(duì)蒺藜苜蓿MtSAG113基因表達(dá)影響Fig.9 Effects of 6-BA induction on MtsAG113 gene expression in Medicago truncatula

2.8 生長(zhǎng)素對(duì)MtSAG113影響

IAA處理后，MtSAG113基因的表達(dá)量與對(duì)照相比呈增加的趨勢(shì)，但增加量的趨勢(shì)呈現(xiàn)出先升高后降低。如圖4所示，2 h后，MtSAG113基因的表達(dá)增加量逐漸升高，并在12 h達(dá)到高峰，與對(duì)照相比增加了15.52倍；24 h后增加量出現(xiàn)了迅速的下降，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)水平回落至對(duì)照組水平（圖 10）。

圖10 IAA誘導(dǎo)對(duì)蒺藜苜蓿MtSAG113基因表達(dá)影響Fig.10 Effects of IAA induction on MtsAG113 gene expression in Medicago truncatula

2.9 ABA對(duì)MtSAG113影響

外源施加ABA對(duì)植物葉片衰老有促進(jìn)作用，MtSAG113基因在ABA處理2 h時(shí)表達(dá)水平稍稍降低，但與對(duì)照組相比并不顯著；隨著誘導(dǎo)時(shí)間的推移，表達(dá)量逐漸增加，并在8 h達(dá)到最大值，是對(duì)照組的13.02倍；24和48 h雖然表達(dá)量出現(xiàn)下降，但與對(duì)照相比，表達(dá)量仍分別提高了41.84%和116.41%（圖 11）。

圖11 ABA誘導(dǎo)對(duì)蒺藜苜蓿MtSAG113基因表達(dá)影響Fig.11 Effects of ABA induction on MtsAG113 gene expression in Medicago truncatula

2.10 生物信息學(xué)分析 MtSAG113基因共852個(gè)堿基，編碼 284個(gè)氨基酸。對(duì)MtSAG113保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析可知該基因?qū)儆赑P2Cc超家族。該超家族的磷酸酶的蛋白結(jié)構(gòu)和推導(dǎo)的催化機(jī)理與Ser/Thr磷酸酶的PP1、PP2A、PP2B家族相似，與PP2C沒(méi)有序列相似性。

2.11 亞細(xì)胞定位分析 將含有35S-MtSAG113-YFP質(zhì)粒的EHA105農(nóng)桿菌注射于煙草中，黑暗培養(yǎng)48 h，在聚焦顯微鏡下觀察YFP信號(hào)在細(xì)胞中的位置（圖12）。圖中紅色熒光為細(xì)胞核自發(fā)熒光，黃色熒光為YFP蛋白所發(fā)熒光，亞細(xì)胞定位結(jié)果表明MtSAG113基因定位于細(xì)胞核內(nèi)，與前期預(yù)測(cè)結(jié)果相同。

圖12 亞細(xì)胞定位結(jié)果Fig.12 Results of subcellular localization

3 討論

衰老是植物生命活動(dòng)過(guò)程中比較重要的生理生化過(guò)程，在植物合成代謝的過(guò)程中，葉細(xì)胞總RNA下降［15］。有研究表明，即使在適宜的外界環(huán)境下，葉片衰老仍然會(huì)自發(fā)的進(jìn)行，直到葉片細(xì)胞凋亡［16-17］。未處理?xiàng)l件下的葉片隨著時(shí)間的推移，MtSAG113基因呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，表明MtSAG113基因可能對(duì)葉片衰老具有積極作用。張?zhí)m等［18］曾發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)外源激素ABA誘導(dǎo)，編碼葉綠素酶的PpCHL1的基因在草地早熟禾葉片中表達(dá)活躍加速了葉綠素的降解。在外源施加6-BA、IAA、ABA后基因表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，并在48 h達(dá)到較低的水平，但都明顯高于對(duì)照組，比較發(fā)現(xiàn)MtSAG113基因的表達(dá)量受外源激素的誘導(dǎo)。SAG基因在葉片衰老進(jìn)程中起重要作用，該基因是衰老過(guò)程中表達(dá)水平上調(diào)的基因，Singh等［19］在研究中發(fā)現(xiàn)Os SAG12-2在誘導(dǎo)衰老葉片中表達(dá)量明顯上升，可負(fù)調(diào)控誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，促進(jìn)水稻衰老。該研究中轉(zhuǎn)MtSAG113基因煙草與野生型相比出現(xiàn)矮小及葉片早衰現(xiàn)象，說(shuō)明MtSAG113基因?qū)χ仓甑乃ダ暇哂幸欢ǖ拇龠M(jìn)作用。Chen等［20］發(fā)現(xiàn)，高鹽脅迫后，鈣調(diào)蛋白基因SPCAM可誘導(dǎo)甘薯葉片衰老，說(shuō)明逆境脅迫可誘導(dǎo)某些基因的表達(dá)。該研究結(jié)果顯示干旱脅迫和高鹽脅迫處理下的蒺藜苜蓿葉片表達(dá)量都高于對(duì)照組，而且干旱脅迫下呈現(xiàn)持續(xù)增加的趨勢(shì)。表明逆境脅迫下能夠誘導(dǎo)MtSAG113基因的表達(dá)。Zhang等［21］研究發(fā)現(xiàn)，SAG113基因在擬南芥中的表達(dá)量隨葉齡的延長(zhǎng)而增加，而在突變體中，由于ABA合成代謝受阻，在葉片中的表達(dá)變得消極。本研究中外源激素及逆境脅迫對(duì)MtSAG113基因的誘導(dǎo)具有積極的作用，對(duì)此基因的誘導(dǎo)如何影響葉片發(fā)育和衰老，還需要進(jìn)一步的研究。

該基因在擬南芥中研究較多，在苜蓿中鮮有研究，該基因的功能在蒺藜苜蓿中尚未得到證實(shí)。因此，本研究以煙草和蒺藜苜蓿R108葉片為材料，通過(guò)葉盤(pán)法對(duì)煙草進(jìn)行轉(zhuǎn)化獲得具有抗性的轉(zhuǎn)基因植株，熒光定量PCR檢測(cè)MtSAG113基因在逆境脅迫條件以及外源激素誘導(dǎo)處理下的基因表達(dá)量。為后續(xù)鑒定MtSAG113基因在蒺藜苜蓿中的功能提供研究基礎(chǔ)和參考依據(jù)。研究結(jié)果表明，PCR檢測(cè)成功獲得5株轉(zhuǎn)基因植株，對(duì)轉(zhuǎn)基因成功的植株進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，檢測(cè)證明MtSAG113基因在煙草中能夠成功表達(dá)。轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株相比表現(xiàn)出矮小及葉片早衰的表型；MtSAG113基因在衰老葉片中表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未衰老葉片中的表達(dá)水平；未處理葉片中的表達(dá)水平隨著時(shí)間的增加有增加的趨勢(shì)；干旱脅迫和高鹽脅迫處理下的蒺藜苜蓿葉片表達(dá)量都高于對(duì)照組，而且干旱脅迫下呈現(xiàn)持續(xù)增加的趨勢(shì)，在施加6-BA、IAA、ABA外源激素后發(fā)現(xiàn)，MtSAG113基因表達(dá)量也高于對(duì)照。說(shuō)明逆境脅迫和外源激素可誘導(dǎo)MtSAG113基因在植物葉片中的表達(dá)。

4 結(jié)論

在逆境條件和外源激素處理下植物葉片中的MtSAG113基因可被誘導(dǎo)表達(dá)。這一結(jié)果為MtSAG113 基因在功能鑒定及蒺藜苜蓿中的應(yīng)用提供了新的思路；另一方面，從分子水平上為通過(guò)外部常規(guī)手段控制植物衰老提供了旁證，同時(shí)也為研究豆科植物提供了理論依據(jù)。