CRISPR/Cas9介導(dǎo)的二穗短柄草bdfls2敲除突變體的獲得

王睿 韓烈保

（北京林業(yè)大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院，北京 100083）

植物在自然環(huán)境下的生長(zhǎng)過(guò)程中一直受到數(shù)量眾多的病原菌的攻擊。植物為了生存進(jìn)化出了一套獨(dú)特的先天免疫系統(tǒng)，從而識(shí)別并清除病原菌入侵者［1］。植物先天免疫系統(tǒng)通?？梢苑譃閮蓚€(gè)層面，分別是分子模式觸發(fā)的免疫（pattern-triggered immunity，PTI）和效應(yīng)子觸發(fā)的免疫（effector-triggered immunity，ETI）［2-3］。其中 PTI是基于定位在植物細(xì)胞細(xì)胞膜上的模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs）對(duì)病原物相關(guān)分子模式（pathogenassociated molecular patterns，PAMPs） 或 損 傷 相關(guān)分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）進(jìn)行識(shí)別并響應(yīng)的免疫過(guò)程，該免疫過(guò)程可以幫助植物抵御大部分病原微生物［4-5］。

PAMPs廣泛存在于微生物中，是其生存所必需的一類進(jìn)化上保守的分子［6］。flg22是其中一種已被深入研究的PAMP，它是一種由22個(gè)氨基酸組成的高度保守的細(xì)菌鞭毛蛋白，可誘導(dǎo)多種植物的廣譜的PTI反應(yīng)［7-9］。擬南芥的相關(guān)研究表明植物細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體FLS2可以識(shí)別flg22［10］，此后在水稻以及其他植物中也發(fā)現(xiàn)同源的FLS2受體也可以識(shí)別 flg22 誘導(dǎo) PTI反應(yīng)發(fā)生［8，11-12］。植物感受PAMPs后誘導(dǎo)活性氧（ROS）爆發(fā)、MAPKs激活、防衛(wèi)基因表達(dá)以及植保素合成等一系列的防衛(wèi)響應(yīng)，抑制病原物生長(zhǎng)，從而實(shí)現(xiàn)植物對(duì)病原物的廣譜抗性［10，13］。

在基因編輯領(lǐng)域，分子生物學(xué)家一直在找尋并完善對(duì)基因組進(jìn)行精確編輯和改造的高效便利的新工具，繼鋅指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFNs）、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）技術(shù)之后，利用基于細(xì)菌以及古菌抵御病毒侵染的CRISPR/Cas系統(tǒng)，使得基因編輯更為簡(jiǎn)單［14-15］。其中CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是當(dāng)前最為主流的基因編輯技術(shù)，其設(shè)計(jì)流程簡(jiǎn)單、操作方便、基因編輯效率高，被廣泛應(yīng)用到了各種植物的基因編輯當(dāng)中，在提高作物產(chǎn)量、改良作物品質(zhì)、培育抗病及抗逆境脅迫新品種等領(lǐng)域都具有良好的應(yīng)用前景［16-17］。

二穗短柄草（Brachypodium distachyon）是溫帶一年生禾本科早熟禾亞科植物。二穗短柄草同禾本科最基本的常用模式植物水稻相比，其生長(zhǎng)周期短，對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求較低，同時(shí)與早熟禾亞科之間的親緣關(guān)系更近，是理想的冷季型草坪草模式植物，二穗短柄草 Bd21 已被廣泛應(yīng)用到科學(xué)研究中［18-19］。

目前對(duì)冷季型草坪草的先天免疫的研究開展十分有限，相關(guān)研究的突變體材料十分有限。因此本研究利用基于CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)，在冷季型草坪草模式植物二穗短柄草中對(duì)抗病免疫相關(guān)的重要基因BdFLS2進(jìn)行了定向編輯，通過(guò)篩選轉(zhuǎn)基因植株，對(duì)編輯后的bdfls2 突變體植株進(jìn)行測(cè)序分析，我們發(fā)現(xiàn)該突變體中bdfls2 基因編碼序列由于堿基的缺失導(dǎo)致提前終止，從而獲得了敲除突變體bdfls2。同時(shí)基于此前擬南芥和水稻的FLS2的相關(guān)研究，我們發(fā)現(xiàn)該突變體在flg22 處理后相比于野生型，無(wú)顯著的ROS爆發(fā)或防衛(wèi)基因的激活，暗示二穗短柄草的FLS2也參與識(shí)別病原相關(guān)分子模式flg22激活PTI的過(guò)程中。進(jìn)而也證明該突變體植株相關(guān)基因FLS2確實(shí)是植物中保守存在的識(shí)別病原相關(guān)分子模式flg22的關(guān)鍵組分，該突變體的構(gòu)建為此后進(jìn)一步研究冷季型草坪草FLS2的先天免疫奠定了材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 本研究所用二穗短柄草生態(tài)型均為BD21，由中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育研究所高彩霞研究組提供。

1.1.2 菌株和載體 本研究載體構(gòu)建使用大腸桿菌菌株為DH5α，轉(zhuǎn)化所用根癌農(nóng)桿菌菌株為AGL1，利用的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)載體為pHUE411，以上菌株及載體均由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所邱金龍研究組提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 Taq DNA 聚合酶等PCR 相關(guān)實(shí)驗(yàn)試劑以及RNA提取所用的Trizol試劑均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT 和染料法熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex TaqⅡ均購(gòu)自TaKaRa；活性氧檢測(cè)試劑Luminol 和Peroxidase 購(gòu)自Sigma-Aldrich 公司；激發(fā)子肽段flg22（QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA）由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；其他實(shí)驗(yàn)試劑均為國(guó)產(chǎn)試劑分析純。實(shí)驗(yàn)相關(guān)的引物合成以及測(cè)序工作均由北京六合華大基因科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA 靶位點(diǎn)的選取 首先從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）中獲得 BdFLS2基因序列（BRADI5g21960）。并登陸CRISPR-P 網(wǎng)站（http：//crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/）輸入本研究目的基因BdFLS2的基因序列，獲得該基因上一系列含有PAM序列備選的潛在靶位點(diǎn)［20］。基于此前對(duì)擬南芥FLS2 蛋白相關(guān)的研究報(bào)道［21］，顯示FLS2蛋白的N端在識(shí)別PAMP的過(guò)程中具有重要作用，因此我們?cè)诒姸鄠溥x位點(diǎn)中最終選擇了位于FLS2 胞外區(qū)功能結(jié)構(gòu)域的sgRNA 靶位點(diǎn)序列bdfls2-sgRNA（5′-GCCGGCTTCAGTCCCTCGAAGGG-3′）進(jìn)行BdFLS2基因的定向編輯。

1.2.2 CRISPR/Cas9-bdfls2載體構(gòu)建 首先根據(jù)選擇的靶位點(diǎn)序列，合成含對(duì)應(yīng)靶位點(diǎn)序列的一對(duì)引物Tfls2-F（5′-GGCGCCGGCTTCAGTCCCTCGAA-3′）和Tfls2-R（5′-AAACTTCGAGGGACTGAAGCCGG-3′），將靶位點(diǎn)序列引物溶解成100 μmol/L母液，各取1 μL 加入到 98 μL 超純水中稀釋到 1 μmol/L，90℃孵育約30 s后移至室溫冷卻完成退火。最后如表1所示將完成退火后的靶點(diǎn)序列與pHUE411載體通過(guò)酶切連接構(gòu)建表達(dá)載體CRISPR/Cas9-bdfls2［22］。

表1 酶切-連接體系Table 1 Enzyme digestion-connection system

1.2.3 二穗短柄草的轉(zhuǎn)化與陽(yáng)性株檢測(cè) 將載體CRISPR/Cas9-bdfls2通過(guò)電激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGL1中，然后通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法對(duì)二穗短柄草胚性愈傷進(jìn)行轉(zhuǎn)化。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后2周再將愈傷組織轉(zhuǎn)接至新的選擇誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，該過(guò)程在設(shè)置為16 h光照，8 h黑暗的25℃的光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)。此后每2周繼代1次，在第2次繼代后將篩選出的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到選擇再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)。之后當(dāng)抗性再生綠苗長(zhǎng)至4 cm時(shí)將陽(yáng)性苗轉(zhuǎn)移至壯苗培養(yǎng)基內(nèi)，同時(shí)取少量葉片提取基因組DNA通過(guò)PCR對(duì)含目標(biāo)位點(diǎn)的序列進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序鑒定陽(yáng)性植株。待抗性再生苗具有較健壯的根后，轉(zhuǎn)入花盆中，于溫室內(nèi)種植［23］。相應(yīng)PCR擴(kuò)增引物如下：bdfls2-F（5′-CGTTCCTAGCACTAGCAGCACTG-3′），bdfls2-R（5′-GGTTCCGTGGAGCGAGTTGT-3′）。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 利用TRIzol試劑參照RNA提取試劑說(shuō)明書提取植物的總RNA。取等量植物總RNA并通過(guò)DNaseⅠ對(duì)提取的植物總RNA進(jìn)行前處理后，將處理后的RNA樣品用反轉(zhuǎn)錄試劑盒根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。參考2014年郭葳等［24］在擬南芥PTI實(shí)驗(yàn)中的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)分析的方法，使用TaKaRa公司的染料法熒光定量試劑盒SYBR Premix Ex TaqⅡ通過(guò)伯樂（Bio-Rad）公司的CFX96熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中以BdAct（Bradi4g41850）作為內(nèi)參基因，基因相對(duì)表達(dá)量根據(jù)2-ΔΔCt公式的計(jì)算方法。本實(shí)驗(yàn)中實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)所使用的引物見表2。

表2 qRT-PCR引物序列Table 2 Sequence of primer for qRT-PCR

1.2.5 ROS的測(cè)定 挑選14 d大的正常生長(zhǎng)的二穗短柄草為材料，用植物葉片打孔器取直徑大小為4 mm 的二穗短柄草葉圓片并用鑷子小心放入各孔已加入去離子水200 μL 的96 孔酶標(biāo)板中。室溫下靜置避光過(guò)夜，第2天小心吸去各孔的去離子水，并加入200 μL ROS測(cè)定溶液，然后用酶標(biāo)儀（Centro XS3LB 960微孔板式發(fā)光檢測(cè)儀）按2 min 一次計(jì)數(shù)，記錄總計(jì)50 min 內(nèi)的相關(guān)吸光值［25］。本實(shí)驗(yàn)中ROS的測(cè)定每種樣品設(shè)8個(gè)生物學(xué)重復(fù)，統(tǒng)計(jì)分析作圖表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果

2.1 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的bdfls2突變體構(gòu)建與分子鑒定

在二穗短柄草BdFLS2 基因序列473 bp對(duì)應(yīng)的前間隔序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM）位置設(shè)計(jì)一對(duì)引物（Tfls2-F和Tfls2-R），通過(guò)pHUE411載體相應(yīng)的酶切連接體系，將該靶序列插入到Bsa I酶切后的pHUE411載體中（圖1）。

圖1 二穗短柄草CRISPR/Cas9-bdfls2基因編輯載體示意圖Fig. 1 Illustration of CRISPR/Cas9-bdfls2 gene editing vector in B. distachyon

通過(guò)電激法轉(zhuǎn)化將構(gòu)建好的帶有BdFLS2基因靶序列的CRISPR/Cas9-bdfls2載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株AGL1，用于此后二穗短柄草愈傷的轉(zhuǎn)化。同時(shí)利用PCR的方法，通過(guò)pHUE411植物表達(dá)載體上對(duì)應(yīng)的一對(duì)鑒定引物OsU3p-F3（5′-GACAGGCGTC TTCTACTGGTGCTAC-3′）和 OsU3t-R（5′-TATTCACTA GCTCGGGATAGTTGGC-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)成功轉(zhuǎn)化的菌株對(duì)應(yīng)的條帶大小和預(yù)期片段大小一致，表明基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的靶向編輯敲除二穗短柄草BdFLS2的基因組編輯載體已構(gòu)建成功（圖2-A）。在獲得了一批經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化再生后成功通過(guò)篩選的植株后，為了驗(yàn)證是否成功靶向編輯對(duì)野生型Bd21中的FLS2 基因，以及確定編輯后的基因型，我們選取轉(zhuǎn)化篩選再生后的植株葉片，提取基因組DNA，并利用一對(duì)基因型鑒定引物bdfls2-F和bdfls2-R擴(kuò)增包含編輯位點(diǎn)的片段進(jìn)行測(cè)序分析（圖2-B）。如圖3-B所示，我們?cè)谄渲?株不同的轉(zhuǎn)基因植株中發(fā)現(xiàn)BdFLS2靶位點(diǎn)處測(cè)序結(jié)果呈現(xiàn)雙峰，利用2015年劉耀光課題組開發(fā)的目標(biāo)靶點(diǎn)突變的分析程序DSDecodeM對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行解讀［26］，發(fā)現(xiàn)這2株不同的轉(zhuǎn)基因植物的BdFLS2等位基因上均發(fā)生了不同大小片段的堿基缺失，導(dǎo)致原有序列提前終止，因此獲得了bdfls2 的基因敲除突變體。

圖2 編輯載體和編輯后靶基因的鑒定Fig. 2 Identification of gene editing vector and edited target gene

圖3 二穗短柄草bdfls2 突變體基因型檢測(cè)Fig. 3 Genotyping of bdfls2 mutants in B. distachyon

2.2 bdfls2突變體在病原相關(guān)分子模式flg22誘導(dǎo)下的ROS檢測(cè)

為了檢測(cè)二穗短柄草BdFLS2 是否參與了植物抗病的PTI 過(guò)程，我們用5 μmol/L flg22 去處理二穗短柄草野生型（WT）和bdfls2 突變體植物葉片?；钚匝醣l(fā)是植物細(xì)胞一個(gè)早期的應(yīng)對(duì)PAMP的反應(yīng)，因此我們首先檢測(cè)了flg22 處理后激發(fā)的活性氧（ROS）的變化。發(fā)現(xiàn)在野生型中flg22 能明顯誘導(dǎo)的活性氧的爆發(fā)，且在15 min左右相對(duì)水處理的對(duì)照有顯著峰值產(chǎn)生，此后下降并于24 min后趨于平穩(wěn)。而bdfls2 突變體在flg22處理后則與未誘導(dǎo)的水處理野生型的曲線基本一致，無(wú)明顯的活性氧爆發(fā)發(fā)生（圖4）。以上結(jié)果表明，BdFLS2 參與了二穗短柄草識(shí)別flg22激活PTI的過(guò)程。

圖4 二穗短柄草野生型和bdfls2 突變體在flg22處理下的ROS檢測(cè)Fig. 4 ROS burst of wild-type B. distachyon and bdfls2 mutants under flg22 treatment

2.3 bdfls2突變體在病原相關(guān)分子模式flg22誘導(dǎo)下的抗病相關(guān)基因檢測(cè)

抗病相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè)是PTI研究中常用的一種檢測(cè)手段［27］，為了進(jìn)一步證明BdFLS2 參與了二穗短柄草識(shí)別flg22激活PTI的過(guò)程，我們通過(guò)RT-PCR的方法檢測(cè)了抗病相關(guān)基因表達(dá)情況。用5 μmol/L flg22分別處理二穗短柄草野生型（WT）和bdfls2 突變體植物葉片，并檢測(cè)未處理的對(duì)照及處理1、3、6 h后不同時(shí)間的抗病相關(guān)基因BdChit8和PR2的的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在bdfls2 突變體中兩種抗病基因在flg22處理后無(wú)顯著變化，而在野生型中在處理后3 h顯著增加，并在6 h呈現(xiàn)顯著的峰值（圖5-A）。同時(shí)我們利用另一種可以激發(fā)植物PTI的被廣泛研究的真菌類PAMP 幾丁質(zhì)（chitin）進(jìn)行了相同的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，如圖5-B所示，發(fā)現(xiàn)在100 μg/mL chitin 處理下bdfls2 突變體植物的抗病相關(guān)基因有顯著的變化，其中BdChit8的變化模式野生型基本一致。以上結(jié)果表明，BdFLS2 參與了二穗短柄草特異性識(shí)別flg22激活PTI的過(guò)程。

圖5 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 對(duì)PAMPs誘導(dǎo)的防衛(wèi)基因的檢測(cè)Fig. 5 Detection of defense gene expression induced upon different PAMPs treatment by real-time quantitative RT-PCR

3 討論

相對(duì)于早期研究基因功能時(shí)常用的T-DNA插入技術(shù)無(wú)法定向編輯研究中的目的基因，以及盡管可以進(jìn)行靶向編輯但操作及構(gòu)建較為復(fù)雜的鋅指核酸內(nèi)切酶（ZFNs）和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶（TALENs）這兩種基因編輯技術(shù)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)操作簡(jiǎn)便，可編輯區(qū)域大，靶向編輯效率高。同時(shí)隨著CRISPR/Cas系統(tǒng)研究的日益深入，諸如單堿基編輯以及多位點(diǎn)編輯等技術(shù)勢(shì)必都能夠更好地應(yīng)用到提高作物產(chǎn)量、改良作物品質(zhì)、培育抗病及抗逆境脅迫新品種等領(lǐng)域中［16-17］。本研究利用該技術(shù)成功地對(duì)二穗短柄草的單一目的基因FLS2進(jìn)行了編輯，并在第一代便獲得了完全的基因敲除突變體，可見通過(guò)該方法可以大大縮短突變體材料獲得的時(shí)間。而在冷季型草坪草領(lǐng)域基因編輯目前主要仍受限于材料的遺傳轉(zhuǎn)化再生體系仍不完善，直接在目的材料上進(jìn)行直接的遺傳操作耗費(fèi)巨大，也因此利用好已有的模式植物二穗短柄草進(jìn)行相關(guān)研究，在獲得一定基礎(chǔ)后進(jìn)而定向擴(kuò)展到相應(yīng)草坪草植物的基因編輯育種中勢(shì)必能取得更好的突破。

在PAMPs處理植物后防衛(wèi)基因響應(yīng)的測(cè)定中，我們同時(shí)發(fā)現(xiàn)bdfls2突變體植株的某些防衛(wèi)基因在flg22誘導(dǎo)下仍會(huì)顯著變化，這表明除BdFLS2外可能還有其他的模式識(shí)別受體可以識(shí)別flg22并激活PTI響應(yīng)。而在chitin的誘導(dǎo)下其防衛(wèi)基因PR2的表達(dá)模式也與野生型有顯著差別（圖5-B），這表明在敲除BdFLS2后可能由于其他模式識(shí)別受體參與相關(guān)信號(hào)的識(shí)別傳遞發(fā)生了改變從而導(dǎo)致了這一變化。所以對(duì)于本研究中獲得的bdfls2突變體植株，可作為研究FLS2相關(guān)植物免疫通路的模式植物，更好地研究FLS下游信號(hào)通路的具體傳導(dǎo)過(guò)程，對(duì)于開發(fā)相關(guān)的細(xì)菌型病害的抗病策略或新抗病品種的開發(fā)都有著重要意義。同時(shí)關(guān)于flg22的最新研究表明flg22的種類也會(huì)與不同種類的FLS2有特異性的識(shí)別關(guān)系［28］，而本研究中使用的只是此前廣泛應(yīng)用于擬南芥研究當(dāng)中并在水稻PTI研究中被證明可以激發(fā)PTI相應(yīng)的單一一種flg22，所以要更深入有效地進(jìn)行草坪草相關(guān)的抗病研究可能仍需要針對(duì)當(dāng)前草坪草生長(zhǎng)環(huán)境中天然存在的特異性的細(xì)菌病害所含的flg22進(jìn)行相關(guān)研究，從而獲得更實(shí)際的研究結(jié)果。

4 結(jié)論

本研究利用基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)成功獲得了二穗短柄草bdfls2的基因敲除突變體。通過(guò)檢測(cè)突變體相應(yīng)的PTI響應(yīng)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)bdfls2突變體植株ROS爆發(fā)和相關(guān)防衛(wèi)基因的表達(dá)相較于未誘導(dǎo)的野生型均無(wú)明顯變化，表明獲得的bdfls2突變體確實(shí)未參與相應(yīng)的PAMP的識(shí)別和誘導(dǎo)PTI響應(yīng)的過(guò)程中。證明利用該技術(shù)在模式植物二穗短柄草中可以較快速地定向獲得新的突變體并進(jìn)行相應(yīng)的功能研究，也為研究冷季型草坪草植物的先天免疫奠定了重要的遺傳材料基礎(chǔ)。