實現(xiàn)微米級滅菌范圍控制的微細等離子體射流裝置

張雨晗，朱鴻成，杜曉霞，肖文香，李華

實現(xiàn)微米級滅菌范圍控制的微細等離子體射流裝置

張雨晗，朱鴻成，杜曉霞，肖文香，李華*

（桂林電子科技大學 生命與環(huán)境科學學院，廣西 桂林 541004）

為了實現(xiàn)微細等離子體的精準滅菌，設計了新型微細等離子體射流裝置，并對該裝置產(chǎn)生的含氧活性粒子（Reactive Oxygen Species， ROS）和含氮活性粒子（Reactive Nitrogen Species， RNS）分布范圍及其滅菌范圍進行研究。淀粉碘化鉀混合溶液里的碘離子可以被微細等離子體射流產(chǎn)生的ROS，RNS氧化成碘單質(zhì)，根據(jù)淀粉遇碘變藍的顯色原理，使用含有淀粉碘化鉀混合溶液的瓊脂培養(yǎng)基表征該裝置射流中ROS，RNS的分布范圍。將菌液涂布在瓊脂培養(yǎng)基上，使用微細等離子體射流裝置在相同的條件下處理不同的時間，于生化培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)以進行滅菌范圍的表征。最后在Ts2FL尼康倒置熒光顯微鏡下進行觀察。實驗結(jié)果表明，在交流電壓幅值為5 kV，中心頻率為10 kHz，作用時間為10，20和30 s時，滅菌范圍分別控制在30，65和75 μm的直徑內(nèi)。等離子體射流與處理物體表面不直接接觸和等離子體與物體表面直接接觸兩種作用方式相比，前者的滅菌范圍更小，更容易實現(xiàn)精準控制。該裝置將目前毫米量級的滅菌范圍提高到了微米量級，對等離子體醫(yī)學研究具有重要意義。

微細等離子體；滅菌；淀粉碘化鉀混合溶液；微米級

1 引　言

現(xiàn)代醫(yī)學技術(shù)的發(fā)展對細菌檢測以及滅菌消毒技術(shù)的要求越來越高，其應用領(lǐng)域也越來越廣。醫(yī)療器械的消毒、皮膚表面的傷口處理、牙齒根管治療、癌細胞的殺滅等大量臨床治療都需要進行高精度的滅菌消毒。在細菌檢測方面，近幾年已經(jīng)做到了高精度快速定量的檢測［1-2］。目前，滅菌方式主要有物理法、化學法和生物法等［3］。物理法滅菌主要是通過施加高溫高壓、紫外線等進行滅菌，包括熱力滅菌、輻射滅菌等，容易破壞不耐高溫高壓的醫(yī)療器械及人體組織，且大量的紫外線對人體皮膚、免疫系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等均會造成一定的損傷；化學法滅菌主要是通過投加化學藥物進行滅菌，常用的滅菌劑有戊二醛、鄰苯二甲醛和二溴海因等，極易殘留化學試劑并對人體及生態(tài)環(huán)境造成不可逆轉(zhuǎn)的損害；生物法滅菌主要是利用各種生物酶以達到消滅微生物及其排泄物的目的，雖然更加生態(tài)環(huán)保，但降解率低，且易受到外界環(huán)境的影響，使用范圍有限［4］。相比之下，低溫等離子體射流因具有低溫、高效、無殘留的特點，可以在高精度醫(yī)療器械消毒和空氣凈化等技術(shù)領(lǐng)域彌補傳統(tǒng)滅菌方式的不足［5］。繼1996年Laroussi課題組在世界上首次將大氣壓低溫等離子體技術(shù)應用于滅菌消毒以來［6］，在學術(shù)界迅速掀起了大氣壓低溫等離子體滅菌消毒技術(shù)的研究熱潮，各種新型等離子體如介質(zhì)阻擋放電等離子體（DBD）、電暈放電等離子體（corona discharge）、輝光放電等離子體（glow discharge）等相繼被提出［7-9］。

將等離子體應用于臨床，除了要考慮生物安全性、滅菌效果等因素外，還應著重考慮是否會對周圍正常組織產(chǎn)生損傷，是否可以做到對處理區(qū)域的范圍及劑量的精確控制。此外，等離子體在細菌滅活方向的科學研究也迫切需要在細胞大小層面（微米量級）開展原理性研究。因此，等離子體射流對滅菌區(qū)域的精準定位作用近年來成為研究熱點。盧新培課題組采用針電極電暈放電實現(xiàn)了對單個細胞的精準滅活控制［10］。Sun等研究了2×7的微細等離子體射流陣列對中耳炎的治療效果［11］。Shinya等以硅片為基底制作出一種等離子體芯片（Plasma-on-Chip），將等離子體放電電極和細菌培養(yǎng)皿集成設計，可對特定區(qū)域的小球藻細胞進行等離子體處理［12-15］。上述裝置采用針電極或光纖材質(zhì)產(chǎn)生微細等離子體射流。裸露的針電極上有高壓，使用不方便且?guī)硪欢ǖ陌踩[患，而光纖材料做工精細，容易破碎，實際應用中具有一定的難度；微細等離子體射流作用的實際范圍未見描述，不利于實際應用。目前，微細等離子體作用的滅菌范圍還在毫米量級，如上海交通大學采用的微細等離子體射流裝置，滅菌范圍在0.4～2 mm之間［16］。本課題組在前期研究中，微細等離子體的作用精度也只停留在直徑為2 mm的圓形區(qū)域［17］，還不能滿足等離子體醫(yī)學研究的需求。

針對目前研究的不足與實際的臨床應用，本文設計了一種新型的微細等離子體裝置。一方面，該裝置會限制ROS，RNS向四周擴散，縮小處理范圍，減少了無關(guān)ROS，RNS的損耗；另一方面，等離子體處理劑量主要依賴射流時間的長短和ROS，RNS的劑量，在保證時間恒定的情況下，可提高ROS，RNS變化的精度，從而精確控制滅菌范圍及其效果，為細胞層面的等離子體生物醫(yī)學研究提供了科學依據(jù)和技術(shù)手段。

2 實　驗

2.1　實驗裝置

如圖1所示，微細等離子體由載氣流速控制裝置、交流電源、微細等離子體射流產(chǎn)生裝置以及數(shù)據(jù)采集和存儲裝置4部分組成。氣體流速控制部分主要由高壓氣瓶、D08-1F型流量顯示儀和CS200A數(shù)字式氣體質(zhì)量流量控制器（北京七星華創(chuàng)電子股份有限公司）組成。交流電源為低溫等離子體電源CTP-2000K（南京蘇曼電子有限公司，中心頻率10 kHz）。微細等離子體射流產(chǎn)生裝置采用內(nèi)徑為0.2 mm、外徑為0.49 mm、長度為60 mm的中空金屬毛細管作為單電極，在單電極上施加交流電壓電離氦氣產(chǎn)生低溫等離子體射流。一個內(nèi)徑為75 μm、涂層厚度為20 μm、長度為40 mm的彈性石英毛細管（YN-標準聚酰胺涂層毛細管，銳沛色譜器件有限公司，人工合成的高純度石英玻璃，其金屬粒子總含量≤30、OH含量≤100；抗張拉力>300 Kpsi；工作溫度為350 ℃，最高可達400 ℃）通過石英管（內(nèi)徑為2 mm，外徑為3 mm，長度為2.5 mm）與金屬毛細管連接。微細等離子體射流產(chǎn)生的ROS，RNS在氦氣的作用下從彈性石英毛細管口吹出到達被處理物體表面，從而起到滅菌作用。放電電壓波形由衰減1 000倍的P6015A高壓探頭測量獲得，并通過TDS1002B-SC泰克示波器顯示和存儲。放電圖像由NIKON D300S相機進行拍攝，光譜信息由AvaSpec-ULS3648-USB2光譜儀進行采集，Ts2FL尼康倒置熒光顯微鏡用來觀察經(jīng)微細等離子體處理過后的培養(yǎng)基。

圖1　微細等離子體放電電路原理

2.2　菌株與培養(yǎng)

本實驗用到的菌種為大腸桿菌（ATCC 25922）。將一定數(shù)量的大腸桿菌接種于75 mL無菌Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基并放置于恒溫震蕩搖床中孵育16 h，設置參數(shù)180 rmp、37 ℃。之后，取100 μL已完成一次活化的菌液加入到75 mL的LB培養(yǎng)基中，放置于恒溫震蕩搖床中孵育6 h以使其菌種活性達到最佳，其余參數(shù)與第一次活化時設置相同。

2.3　實驗方法

在微細等離子體ROS，RNS濃度測量實驗中，主要采用分光光度法測量等離子體ROS，RNS中H2O2，HNO3/HNO2的濃度，基于Beer-Lambert定律進行物質(zhì)濃度含量的測量：

式中：表示吸光度，表示吸光系數(shù)，表示吸收層的厚度，表示吸光物質(zhì)的濃度［18］。吸光度是被測等離子體ROS，RNS在紫外分光光度計特定波長處或一定波長范圍內(nèi)產(chǎn)生的，可以對該物質(zhì)進行定性、定量分析。同時結(jié)合顯色法測量O3的濃度。通過繪制標準溶液的濃度與吸光度的標準曲線，將同一操作下經(jīng)等離子體處理過的水溶液中ROS，RNS在特定波長處的吸光度帶入前述所得的標準曲線中，最后得出等離子體中ROS，RNS的實際濃度。

在微細等離子體滅菌范圍表征實驗中，取100 μL活化好的菌液涂布到瓊脂培養(yǎng)基上。本次實驗所用的瓊脂培養(yǎng)基每升超純水中含有如下成分：16 g瓊脂，10 g胰蛋白胨，5 g氯化鈉和5 g酵母提取物。涂布有菌液的瓊脂培養(yǎng)基經(jīng)微細等離子體射流裝置滅菌后放在生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h。最后在顯微鏡下觀察并測量滅菌范圍，并與未處理的對照組進行對比以分析其滅菌效果。實驗共進行三組以減小誤差。

3 結(jié)論與分析

3.1　放電特性分析

實驗裝置中，電源的中心頻率固定在10 kHz，氦氣流速在0～0.3 slm（standard liter per minute，每分鐘標準升）可調(diào)，電壓幅值在0～9 kV內(nèi)變化。放電方式為單電極模式，即交流高壓加載在金屬毛細管上，等離子體射流末端相當于虛地。當加載的交流電壓幅值為5 kV，氦氣流速為0.1 L/min時，放電圖像如圖2所示。金屬毛細管兩端的等離子體射流從管口噴出，呈淡紫色。當放電電壓幅值從5 kV增加到9 kV時，等離子體射流的長度和強度逐漸增大，且發(fā)出不斷增強的“嗡嗡”音。

圖2　微細等離子體器件與電壓波形

根據(jù)氣體放電理論，等離子體以子彈的形式在空氣中傳播，本質(zhì)上是流光傳播過程。由于只有一個電極，因此放電在金屬毛細管高壓電極和周圍的氦氣中產(chǎn)生，類似于正電暈放電，且放電呈現(xiàn)周期性的脈沖形式，放電穩(wěn)定，能夠持續(xù)工作。等離子體射流只在金屬毛細管兩端產(chǎn)生，金屬毛細管不僅起到放電裝置的作用，也是氣體通路的一部分。ROS，RNS在氦氣流速的帶動下進入微細彈性石英毛細管，并排出管口進行滅菌。

由于在氦氣電離放電時，電子與氦中性氣體相撞的概率很小，通常氦原子只能夠電離激發(fā)到亞穩(wěn)態(tài)，無法完全電離，而且自然狀態(tài)下空氣中氮分子電離所需的能量低于氦原子電離為亞穩(wěn)態(tài)所需要的能量，因此在電子與氦原子發(fā)生碰撞后，生成的亞穩(wěn)態(tài)氦原子極大可能還會與氮分子發(fā)生二次碰撞激發(fā)。如此，氦亞穩(wěn)態(tài)原子便將本身存在的能量傳導給了氮分子，該過程中進一步碰撞激發(fā)，而激發(fā)所產(chǎn)生的能量可以通過氮分子離子退激過程中產(chǎn)生的光子來進行釋放，因此可以在氦氣的發(fā)射光譜中明顯看到氮氣第一負帶系的譜線，且對于氦氣等離子體射流的溫度測量也是選擇氮氣第一負帶系來進行計算［20-21］。

圖3顯示了由大氣壓氦氣低溫等離子體單管射流裝置生成的氦氣等離子體射流的發(fā)射光譜圖，標記了羥基譜線、氮氣第二正帶系、氮氣第一負帶系、氦氣關(guān)鍵譜線及氧的譜線，具體如表1所示。

圖3　大氣壓氦等離子體射流的發(fā)射光譜

表1氦等離子體發(fā)射光譜中的主要譜線

Tab.1　Main spectral lines in helium plasma emission spectra

3.2　ROS，RNS濃度測量及分布范圍表征

321HNO3濃度檢測及結(jié)果

硝酸根在紫外分光光度計中有最大吸收波長［25］，因此本文以氫氧化鈉和硝酸反應生成硝酸鈉來反映等離子體ROS，RNS中硝酸的濃度。然而，氫氧化鈉濃度過高會對吸光值產(chǎn)生影響，故實驗所用的氫氧化鈉濃度為450 μmol/L。在標準曲線的繪制過程中，取濃硝酸347 μL定容至500 mL配置成0.01 mol/L的硝酸溶液，隨后將0.01 mol/L的硝酸溶液稀釋成一系列梯度濃度后，與450 μmol/L氫氧化鈉溶液各500 μL混合反應定容至3.5 mL，測其吸光度值，最后繪制標準曲線。在測量等離子體ROS，RNS中硝酸濃度的過程中，各取500 μL等離子體處理的超純水和450 μmol/L 氫氧化鈉溶液加入比色皿中定容至3.5 mL，測量其吸光度。具體結(jié)果如圖4和表2所示。

圖4　硝酸鹽的吸收光譜及標準曲線

322H2O2濃度檢測及結(jié)果

在酸性條件下，H2O2與鉬酸銨反應生成穩(wěn)定且呈黃色的過氧鉬酸化合物，利用這個原理對H2O2濃度進行測量［26］。采用碘化鉀作為顯色劑，通過顯色劑與活性物質(zhì)反應生成新的長壽命粒子，在紫外分光光度計設定的波長超過300 nm時，碘單質(zhì)和碘離子基本沒有吸收波長，碘三離子在350 nm處有最大吸收波長［27］，檢測結(jié)果的靈敏度更高。分別配制檢測液A和B，A液由2 g鄰苯二甲酸氫鉀定容至100 mL配制而成，B液由0.02 g鉬酸銨、6.6 g碘化鉀以及0.2 g氫氧化鈉混合后定容至100 mL制得，最后將A，B液等體積混合得到最終的檢測液。在標準曲線的繪制中，將100 μL 30%的過氧化氫溶液加入99.6 mL超純水配制成0.01 mol/L的過氧化氫標準溶液，隨后將0.01 mol/L的過氧化氫標準溶液稀釋成一系列梯度濃度的過氧化氫標準液，隨后取不同濃度的過氧化氫標準溶液與檢測液各1 mL于3.5 mL石英比色皿中混合，再加超純水稀釋至3 mL，充分反應10 min后，進行吸光度檢測。選取吸收波長為350 nm處繪制標準曲線。對于H2O2濃度的測量，各取1 mL經(jīng)等離子體處理不同時間的超純水與檢測液后稀釋到3 mL，充分反應10 min后測量吸光度，結(jié)果如圖5和表3所示。

表2　等離子體處理水溶液和氫氧化鈉反應后混合溶液中硝酸的吸光度和實際濃度

圖5　過氧化氫的吸收光譜及標準曲線

表3等離子體處理水溶液和鉬酸銨反應后混合液中過氧化氫的吸收光譜

Tab.3　Absorption spectra of hydrogen peroxide in mixed liquid after plasma treatment of aqueous solution and reaction of ammonium molybdate

323O3濃度檢測及結(jié)果

2014年，Patil等檢測到等離子體ROS，RNS中存在O3［28］。氣相臭氧溶解于水溶液中產(chǎn)生了液相臭氧，但是半衰期較短，本文采用碘量法測量液相臭氧的濃度。根據(jù)臭氧具有氧化性，可以將碘離子氧化成碘單質(zhì)，具體反應如下：

O3+2KI+H2O→O2+I2+2KOH，（4）

I2+2Na2S2O3→2NaI+Na2S4O6，（5）

臭氧的濃度可以通過硫代硫酸鈉溶液的體積間接計算得出：

其中：Na為硫代硫酸鈉標液的體積，為硫代硫酸鈉標液的濃度，0代表所含臭氧的溶液體積。

在檢測液的配制過程中，取20 g碘化鉀定容至100 mL得到20%的碘化鉀溶液，避光保存一天后使用；將1 g可溶性淀粉加熱溶解于200 mL超純水中獲得淀粉指示劑，隨后放于4 ℃冰箱中隔夜沉淀，第二日取上清液使用；（1+5）硫酸溶液由2 mL濃硫酸和10 mL超純水混合制得；0.05 mol/L硫代硫酸鈉溶液由1.24 g硫代硫酸鈉溶液加超純水定容至100 mL。在臭氧濃度的測量過程中，將500 μL 20%的碘化鉀溶液和125 μL（1+5）硫酸溶液加入500 μL等離子體剛處理完的超純水中，并用保鮮膜密封避光保存5 min。取0.05 mol/L硫代硫酸鈉溶液滴定檢測液直到呈現(xiàn)淡黃色，隨后滴加2.5 μL配置好的淀粉指示劑，此時溶液呈藍色，繼續(xù)滴定同時搖勻溶液，直到藍色恰好消失且30 s內(nèi)不變顏色為止，此為滴定終點。記錄消耗的硫代硫酸鈉溶液的量，利用式（6）計算并得出臭氧的濃度。具體結(jié)果見表4。

表4等離子體處理溶液中臭氧的濃度

Tab.4　Concentration of ozone in solution treated by plasma

如圖6所示，在處理距離為（處理距離為含有淀粉碘化鉀混合溶液的培養(yǎng)基平面和內(nèi)徑75 μm的彈性石英毛細管末端的距離）1 mm、電源電壓為5 kV、氣流量為0.1 L/min的條件下，按照不同時間進行處理，隨后拿到顯微鏡下觀察處理區(qū)域?？梢悦黠@看到，ROS，RNS的分布范圍隨著時間的增加而增大。當處理時間為10 s時，ROS，RNS的作用范圍呈圓形，直徑為30 μm。處理時間增大到20 s和30 s時，ROS，RNS的作用范圍分別增大到40 μm和63 μm，顏色逐漸加深，表明ROS，RNS濃度越大，作用范圍越寬。這是因為在電壓和氣流量一定的情況下，隨著處理時間的延長，微細等離子體射流產(chǎn)生的ROS和RNS的含量不斷增加，其可以氧化含有淀粉碘化鉀混合溶液瓊脂培養(yǎng)基里I形成I2的含量就越多，故而形成的顏色就會越深。

圖6　不同處理時間階段微等離子體中ROS，RNS分布的圖像

為了進一步驗證含有淀粉碘化鉀混合溶液的瓊脂培養(yǎng)基顯色是微細等離子體的作用而與載氣無關(guān)，將瓊脂培養(yǎng)基放到只通載氣的彈性石英毛細管下處理30 s，隨后拿到顯微鏡下觀察處理的區(qū)域，結(jié)果如圖7所示。視野范圍內(nèi)標注的處理區(qū)域未見明顯的深色區(qū)域，即淀粉碘化鉀混合溶液顯色區(qū)域。由此可以得出結(jié)論，含有淀粉碘化鉀混合溶液的瓊脂培養(yǎng)基顯色是微細等離子體射流的作用，即微細等離子體射流產(chǎn)生的ROS和RNS具有將I氧化成I2的性質(zhì)。

圖7　含淀粉碘化鉀混合溶液的瓊脂培養(yǎng)基僅通氦氣的對比

3.3　滅菌范圍表征

雖然沒有從彈性石英毛細管末端觀察到射流，但在載氣的作用下，確實會把射流產(chǎn)生的ROS，RNS吹出彈性石英毛細管并與含有淀粉碘化鉀混合溶液的瓊脂培養(yǎng)基里的I發(fā)生氧化還原反應而顯色。同樣將裝置電壓控制在5 kV、氣流量控制在0.1 L/min，可以明顯觀察到處理區(qū)域內(nèi)有一形狀改變區(qū)域，且隨著時間的增大，其范圍明顯增大，如圖8所示?？梢悦黠@看到，滅菌范圍隨著時間的增加而增大。當處理時間為10 s時，滅菌作用范圍呈圓形分布，直徑為30 μm。處理時間增大到20 s和30 s時，滅菌作用范圍分別增大到65 μm和75 μm。其滅菌范圍較上述ROS，RNS的分布范圍相比偏大，其原因是能夠使含淀粉碘化鉀混合溶液的瓊脂培養(yǎng)基顯色的ROS，RNS都是具有強氧化性的，然而一些不具有氧化性的ROS，RNS均具有滅菌效果。以上實驗均進行3組，結(jié)果取平均值。

圖8　不同處理時間階段微等離子體射流滅菌范圍表征圖像

為了進一步驗證上文所述的滅菌作用是微細等離子體射流產(chǎn)生的，將涂布有菌液的瓊脂培養(yǎng)基放在彈性石英毛細管末端，不施加電壓僅通入流速為0.1 slm的氦氣，在顯微鏡下的觀察結(jié)果如圖9所示?？梢悦黠@觀察到，雖然氣流會使瓊脂培養(yǎng)基產(chǎn)生凹陷，但不會改變其涂布的菌液的形狀，無滅菌效果，即滅菌效應與所通載氣無關(guān)。

圖9　涂有菌液的瓊脂培養(yǎng)基僅通氦氣的對比

3.4　溫度和濕度對實驗的影響

為了研究環(huán)境溫度對實驗的影響，對培養(yǎng)基局部進行加熱，模擬環(huán)境溫度的改變，在3組不同溫度下測量淀粉碘化鉀的顯色范圍。實驗過程中發(fā)現(xiàn)，將培養(yǎng)基加熱到50 ℃以上時，培養(yǎng)基存在融化的可能，故溫度控制在50 ℃以下。觀察數(shù)據(jù)可知，隨著溫度的升高，顯色區(qū)域（如圖10中各圖標出的黑色圓圈部分）逐漸變大。這是因為樣品加熱到較高溫度時，其表面附近的氣體溫度也升高，導致氣體密度降低。氣體密度的降低會降低周圍氣體與等離子體羽的碰撞，等離子體膨脹過程中等離子體壓力降低，這會直接增加等離子體羽的大小。根據(jù)上述內(nèi)容，樣品溫度的提高會影響等離子體羽的膨脹動力學，進而可以增大等離子體的尺寸［29］，所以隨著實驗環(huán)境溫度的提高，顯色范圍逐漸增大。具體結(jié)果如圖10所示。

圖10　不同溫度下含淀粉碘化鉀混合溶液的瓊脂培養(yǎng)基的顯色范圍比較

為了研究環(huán)境濕度對實驗的影響，通過將空調(diào)調(diào)至抽濕模式的方式，模擬環(huán)境濕度的變化，實驗測了兩組淀粉碘化鉀的顯色范圍，其中實驗室的標準濕度為50% RH。從實驗數(shù)據(jù)觀察，隨著環(huán)境濕度的增大，顯色區(qū)域也逐漸增大。主要原因為，低濕度的情況下，大量的高能電子直接作用于處理物體表面，但是由于水分子的數(shù)量較少，產(chǎn)生的OH自由基（由高能電子與水分子發(fā)生非彈性碰撞產(chǎn)生）等ROS的數(shù)量也比較少，隨著濕度的增加，高能電子直接作用于處理物體的自由電子數(shù)量減少，但是產(chǎn)生了更多的OH自由基，使得OH自由基與處理物表面的碰撞概率加大［30］，故顯色范圍隨著濕度的增加而變大。具體結(jié)果如圖11所示。

圖11　不同濕度下含淀粉碘化鉀混合溶液的瓊脂培養(yǎng)基的顯色范圍比較

3.5　機理分析

本文中微細等離子體射流實現(xiàn)滅菌采用的等離子體射流與處理物體表面不直接接觸的方式，其物理過程與另一種等離子體射流與處理物體表面直接接觸的方式不同。為了觀察兩者的不同，分別采用內(nèi)徑為20 μm（圖12（a））和100 μm（圖12（b））的毛細管進行實驗。當?shù)入x子體射流與處理物體表面（玻璃平板和含有淀粉碘化鉀混合溶液的培養(yǎng)基）直接接觸時，在接觸面都有一個顯著的明亮斑點，說明在接觸面等離子體射流明顯增強，等離子體射流覆蓋的作用區(qū)域面積明顯增大。一方面，處理物體表面對氦氣起到了阻擋作用，使氦氣碰到物體表面后沿著物體表面向周圍擴展；另一方面，空間電荷在物體表面更加容易沉積。以上兩方面因素會導致電離更容易發(fā)生，從而使等離子體射流變大變強，特別是在接觸點放電更加強烈。此外，等離子體射流與處理物體接觸，ROS，RNS運動距離更小，短壽命和長壽命的ROS，RNS存活性更高，濃度更大，從而滅菌效能也相應提高。

使用圖12（a）所示的等離子體射流裝置將涂布了菌液的瓊脂培養(yǎng)基處理30 s，之后于生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 h，如圖12（c）所示，圓形區(qū)域為滅菌區(qū)域，直徑為6.7 mm。其顯微結(jié)構(gòu)如圖12（d）所示，左上角為未處理的對照區(qū)域，右下角為處理過的滅菌區(qū)域?？梢娊?jīng)等離子體射流裝置滅菌過后的瓊脂培養(yǎng)基在顯微鏡下的結(jié)構(gòu)與本實驗微細裝置滅菌的性狀一致。在微細等離子體射流作用的過程中，ROS，RNS的分布沿軸向呈現(xiàn)依次遞減的趨勢，故而滅菌區(qū)域與對照區(qū)域交界處明顯可見部分白色的條紋。滅菌區(qū)域內(nèi)的透明小氣泡，為培養(yǎng)基制作過程中攪拌時產(chǎn)生的氣泡。

圖12　等離子體噴射裝置直接連接到被處理物體的表面及其滅菌效果

實驗結(jié)果表明，直接接觸的等離子體射流相比不接觸的作用方式，產(chǎn)生的滅菌范圍更大，直徑在毫米量級。因此，為得到精度更高的滅菌范圍，本文采用的等離子體射流與物體表面不直接接觸的作用方式更有效。

4 結(jié)　論

本文為了實現(xiàn)微細等離子體的精準滅菌，設計了一套直徑為75 μm的微細等離子體射流裝置。該裝置不同于傳統(tǒng)直接接觸的作用方式，在等離子體射流尾羽的末端通過石英管與內(nèi)徑75 μm的彈性石英毛細管相連接，在氦氣流速的推動下，將等離子體產(chǎn)生的ROS，RNS經(jīng)彈性石英毛細管間接作用到處理物體的表面。內(nèi)徑75 μm的彈性石英毛細管不同于傳統(tǒng)的光纖材料，觸碰不易破碎，因此可以縮短對比于傳統(tǒng)裝置的處理距離，更好地抑制了ROS，RNS的擴散；同時也不容易堵塞管口，提高了裝置的利用率。

射流裝置在交流電壓和He氣流的共同作用下，通過對該裝置的ROS，RNS分布范圍和滅菌范圍進行表征。結(jié)果表明，在交流電壓幅值為5 kV，中心頻率為10 kHz，作用時間分別為10，20和30 s時，滅菌范圍可分別控制在30，65和75 μm的直徑范圍內(nèi)，均實現(xiàn)了微米級別圓形的精準射流以及滅菌。該裝置可以滿足精準滅菌的需求，對等離子體醫(yī)學研究具有重要意義。

在后續(xù)的研究中，將進一步優(yōu)化裝置的控制精度。一方面，設計精密測控裝置，使等離子體射流出口與作用物體表面的距離可以精確控制；另一方面，通過三自由度運動平臺和攝像頭模塊相互配合，從而實現(xiàn)基于機器視覺的等離子體精準滅菌。

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Micro plasma jet devices for micron sterilization range control

ZHANG Yuhan，ZHU Hongcheng，DU Xiaoxia，XIAO Wenxiang，LI Hua*

（，，541004，），：

In order to achieve precise sterilization using micro plasma， a novel micro plasma jet device was designed， and the distribution range of the reactive oxygen species （ROS） and reactive nitrogen species （RNS） generated by the device and the sterilization range of the device were investigated. First， iodine ions （I） in a potassium starch iodide mixture were oxidized to iodine monomers （I2） by the ROS and RNS generated by microplasma jets. The range of distribution of the ROS and RNS in the jet of the device was characterized using an agar medium containing the starch-potassium iodide mixture， based on the color development principle of starch， which turns blue when exposed to iodine. Next， a bacterial solution was coated on an agar medium and incubated overnight at 37 °C in a biochemical incubator using a micro plasma jet device for different times under the same conditions for characterization of the sterilization range. Finally， the sterilization ranges were observed under a Ts2FL Nikon inverted fluorescence microscope. The experimental results indicate that the sterilization range can be controlled within diameters of 30， 65， and 75 μm at an AC voltage amplitude of 5 kV， a center frequency of 10 kHz， and an action time of 10， 20， and 30 s， respectively. A plasma jet does not directly contact the surface of the object， whereas plasma directly contacts the surface of the object； the former has a smaller sterilization range， and it is easier to achieve accurate control. This device improves the current millimeter-scale sterilization range accuracy to the micron scale， which is of great significance for plasma medical research.

micro plasma； sterilization； starch-potassium iodide mixture； micron scale

TM213

A

10.37188/OPE.20223003.0296

1004-924X（2022）03-0296-14

2021-09-02；

2021-10-29.

國家自然科學基金資助項目（No.61864001，No.62163009）；廣西自然科學基金重點項目（No.2021GXNSFDA196005）；廣西自動檢測技術(shù)與儀器重點實驗室主任基金資助項目（No.YQ21111）；廣西研究生教育創(chuàng)新計劃項目（No.YCSW2021181）

張雨晗（1997），女，吉林長春人，碩士研究生，主要從事微細等離子體滅菌的研究。E-mail：2504901871@qq.com

李華（1978），男，湖南郴州人，博士，教授，博士生導師，2001年、2004年于中北大學分別獲得學士和碩士學位，2007年于北京理工大學獲得博士學位，2010年于清華大學儀器科學與技術(shù)博士后流動站出站，主要從事等離子體醫(yī)學、MEMS等的研究。E-mail：lihua@guet.edu.cn