基于iTRAQ-PRM技術(shù)篩選不同類型土壤烤煙根系差異表達(dá)蛋白

楊睿，查文菊，陳頤，何承剛，王濤，何聰蓮，費(fèi)明亮*

基于iTRAQ-PRM技術(shù)篩選不同類型土壤烤煙根系差異表達(dá)蛋白

楊睿1,2，查文菊3，陳頤1，何承剛2，王濤3，何聰蓮2，費(fèi)明亮1*

1云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南省昆明市五華區(qū)圓通街33號 650031；2云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南省昆明市盤龍區(qū)灃源路452號 650201；3云南省煙草公司曲靖市公司，云南省曲靖市官坡巷51號 671000

【目的】從蛋白質(zhì)水平揭示烤煙根系對不同類型土壤的響應(yīng)差異?！痉椒ā恳钥緹熎贩NK326為材料，選取石灰?guī)r土（沙壤土）、水稻土和紅壤土，測定3種類型土壤烤煙根系活力、硝酸還原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）和天冬氨酸合成酶（AS）活性；利用iTRAQ技術(shù)鑒定3種類型土壤烤煙根系差異表達(dá)蛋白，對所獲得的差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，從中選擇16個(gè)蛋白進(jìn)行平行反應(yīng)監(jiān)測（PRM）驗(yàn)證?！窘Y(jié)果】（1）紅壤土的烤煙根系活力、NR、GS和AS活性均高于沙壤土和水稻土；（2）從水稻土vs沙壤土、沙壤土vs紅壤土、水稻土vs紅壤土3組對比中分別鑒定出699、650、569個(gè)烤煙根系差異表達(dá)蛋白，其中上調(diào)/下調(diào)蛋白分別為412/287、291/359和323/246個(gè)；（3）差異蛋白質(zhì)主要有催化、結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)活性等功能；（4）差異蛋白功能富集于次生代謝產(chǎn)物的生物合成、代謝途徑和苯丙烷類生物合成等代謝途徑；（5）紅壤土烤煙根系與抗逆性、碳水化合物和能量代謝、蛋白質(zhì)合成等相關(guān)的差異蛋白表達(dá)均高于沙壤土和水稻土。【結(jié)論】利用iTRAQ標(biāo)記技術(shù)，結(jié)合PRM驗(yàn)證技術(shù)篩選出不同類型土壤烤煙根系差異表達(dá)蛋白，為獲取響應(yīng)關(guān)鍵蛋白奠定基礎(chǔ)。

iTRAQ；煙草根系；土壤類型；氮代謝；蛋白質(zhì)組學(xué)

烤煙根系具有支撐煙株、吸收水分和營養(yǎng)物質(zhì)的作用[1]，是分泌烤煙次生代謝物的主要場所[2]。影響烤煙根系生長發(fā)育的因素很多，如品種[3]、海拔[4]、施 肥[5]、土壤類型[6]、栽培管理措施[7]等，其中，土壤類型的影響較大。不同類型土壤條件下，烤煙根系生長狀況有明顯差異，進(jìn)而影響煙葉品質(zhì)[8]。馬新明等[9]研究結(jié)果表明不同土壤類型煙草根系發(fā)育特點(diǎn)不同，主要表現(xiàn)為生長規(guī)律和理化特性差異很大。高云等[10]研究結(jié)果表明不同類型土壤對煙葉感官質(zhì)量的評價(jià)指標(biāo)有不同程度的影響，主要表現(xiàn)在香氣量、雜氣、余味、勁頭和干燥感上。目前，烤煙根系響應(yīng)不同類型土壤的分子機(jī)制尚不清楚，近年來蛋白組學(xué)質(zhì)譜分析技術(shù)的迅速發(fā)展為相關(guān)研究提供了契機(jī)。同位素標(biāo)記的相對和絕對定量iTRAQ技術(shù)（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）是高通量篩選的蛋白質(zhì)定量技術(shù)，具有標(biāo)記效率高、標(biāo)記過程簡單、標(biāo)記范圍廣等特點(diǎn)[11-13]。本研究結(jié)合前期研究基礎(chǔ)與提出的理論假設(shè)，在測定烤煙根系氮代謝基礎(chǔ)上，利用iTRAQ標(biāo)記技術(shù)，結(jié)合PRM驗(yàn)證技術(shù)篩選不同類型土壤下烤煙根系差異表達(dá)蛋白，旨在為從蛋白質(zhì)水平上揭示烤煙根系對不同類型土壤的響應(yīng)差異提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究供試材料為烤煙品種K326（由玉溪中煙種子有限公司提供），于2019年4月至8月在云南省玉溪市紅塔區(qū)研和試驗(yàn)基地（102°29’58″ E, 24°14’21″ N，海拔1635 m）進(jìn)行旱棚試驗(yàn)。田間管理遵循正常的農(nóng)藝程序。土壤類型分別為石灰?guī)r土（沙壤土）、水稻土和紅壤土，前茬作物均為油菜。土壤養(yǎng)分肥力見表1，每個(gè)處理重復(fù)3次，且每個(gè)處理采用單獨(dú)的種植區(qū)。

表1 供試土壤養(yǎng)分信息

Tab.1 Nutrient information of soil tested

土壤類型有機(jī)質(zhì)/%pH值有效氮/(mg/kg)有效磷/(mg/kg)有效鉀/(mg/kg) 石灰?guī)r土（沙壤土）2.717.16136.027.446.7 水稻土4.377.80175.810.188.2 紅壤土3.916.04120.43.5133.5

1.2 取樣

采用隨機(jī)取樣法，選擇3種類型土壤的打頂后烤煙根系作為分析材料（石灰?guī)r土（沙壤土）-SS，水稻土-PS，紅壤土-RS），洗凈后甩干，剪取相同部位根系，用錫箔紙包住迅速置于液氮中，-80℃保存?zhèn)溆?。共選擇27株煙，每種類型土壤處理各9株，其中每3株混合作為1個(gè)重復(fù)，共3個(gè)重復(fù)。

1.3 酶活性測定

選取不同類型土壤烤煙根系1 g，在Giannopolitis等[14]的方法基礎(chǔ)上略作修改進(jìn)行酶提取，所有步驟均在4℃下進(jìn)行。根系酶活性分別采用硝酸還原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）和天冬氨酸合成酶（AS）試劑盒微量法進(jìn)行測定（北京索萊寶科技有限公司），根系活力采用TTC法進(jìn)行測定[15]。

1.4 蛋白質(zhì)組學(xué)分析

參照祁忠達(dá)等[16]的方法分別對不同土壤烤煙根系進(jìn)行全蛋白質(zhì)提取，對提取后的蛋白樣品采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。首先按1: 50的質(zhì)量比例（胰酶：蛋白）加入胰蛋白酶，37℃酶解過夜，酶解后的肽段用C18柱脫鹽，真空冷凍干燥脫鹽后的肽段，根據(jù) iTRAQ-8標(biāo)試劑盒（AB SCIEX，美國）操作說明進(jìn)行肽段標(biāo)記。然后將標(biāo)記后的樣品混合，應(yīng)用強(qiáng)陽離子交換色譜（SCX）對混合后的肽段進(jìn)行預(yù)分離，經(jīng)過StrataX除鹽柱除鹽，冷凍抽干。最后進(jìn)行液相分離和色譜分析。

1.5 差異蛋白的選擇

鑒定到的蛋白質(zhì)差異倍數(shù)≥1.3，可信度水平在 95%以上（即≤0.05），每個(gè)蛋白至少包含一個(gè)不同肽段的蛋白為可信蛋白；鑒定的肽段和蛋白質(zhì)定量，以conf. ≥95過濾，即可信度在95%以上可信肽段用于蛋白質(zhì)定量。通過兩兩對比獲取顯著差異蛋白，根據(jù)BH校正法，對原數(shù)據(jù)進(jìn)行≤0.05校正，將差異倍數(shù)≥1.2或者≤0.83時(shí)視為表達(dá)差異蛋白[17]。

1.6 生物信息學(xué)分析

蛋白注釋方法GO（Gene Ontology）分析，蛋白質(zhì)組學(xué)注釋分析選擇UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www. uniprot.org/）；KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析，選擇在線服務(wù)工具KAAS對提交的蛋白進(jìn)行注釋，之后通過KEGG mapper將注釋過的蛋白匹配入數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)的代謝通路中；蛋白質(zhì)定量至少包含1個(gè)特異肽段，豐度差異蛋白至少含有2個(gè)生物學(xué)重復(fù)。利用R語言進(jìn)行差異蛋白質(zhì)的熱圖聚類分析。

1.7 基于PRM技術(shù)驗(yàn)證差異蛋白

平行反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)（parallel reaction monitoring, PRM）是目前靶向蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)采集的主流方法，在3個(gè)對比組的共同豐度差異蛋白質(zhì)中，選取了16個(gè)與抗逆性相關(guān)的靶蛋白，用PRM技術(shù)驗(yàn)證iTRAQ分析獲得的蛋白質(zhì)表達(dá)水平以及蛋白質(zhì)的功能顯著性。根據(jù)iTRAQ技術(shù)制備蛋白質(zhì)提取液和胰蛋白酶消化液，然后將胰蛋白酶肽裝載在C18捕獲柱上進(jìn)行脫鹽，并在TripleTOF 5600 LC-MS/MS系統(tǒng)（AB SCIEX，Massachusetts，USA）上進(jìn)行PRM驗(yàn)證，MS1和MS2采集分別在350～1500 M/Z和100～1500 M/Z范圍內(nèi)進(jìn)行。將部分胰蛋白酶肽混合后，用質(zhì)譜DD（Data- Dependent Acquisition）進(jìn)行檢測。利用Protein-Pilot軟件對蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，用Skyline軟件（spectrum- library）對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，將目的肽M/Z加入到包含列表中，建立PRM采集方法，并通過混合樣品的PRM數(shù)據(jù)采集進(jìn)行優(yōu)化和調(diào)整。采用優(yōu)化的PRM質(zhì)譜采集方法，采集每個(gè)樣品的數(shù)據(jù)和PRM光譜文件，通過分析得到蛋白質(zhì)的定量信息[18]。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有數(shù)據(jù)均采用EXCEL 2016、SPSS 22.0和Origin 8.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型土壤烤煙根系活力及氮代謝相關(guān)酶活性比較

由圖1可知，紅壤土和水稻土根系活力、硝酸還原酶（NR）活性和天冬氨酸合成酶（AS）活性顯著高于沙壤土（＜0.05），紅壤土的谷氨酰胺合成酶（GS）活性顯著高于水稻土和沙壤土（＜0.05），表明不同土壤類型烤煙根系活力和氮代謝相關(guān)酶活性，均表現(xiàn)為紅壤土＞水稻土＞沙壤土。

注:（A）根系活力；（B）為硝酸還原酶;（C）谷氨酰胺合成酶；（D）天冬氨酸合成酶；“*”表示不同類型土壤烤煙根系相關(guān)酶活在P＜0.05水平差異顯著

2.2 不同類型土壤烤煙根系iTRAQ定量分析

在不同烤煙根系樣品中總共鑒定出1316466個(gè)二級圖譜，搜索產(chǎn)生了459135個(gè)匹配質(zhì)譜，鑒定到的特異肽段質(zhì)譜的數(shù)量為23346，鑒定到的肽段數(shù)有33576，特異肽段數(shù)有13826，總共鑒定到1282個(gè)蛋白質(zhì)（圖3A）。在3次上機(jī)鑒定的總蛋白質(zhì)中，2729個(gè)蛋白質(zhì)有1個(gè)特異肽段，2470個(gè)蛋白質(zhì)有2個(gè)特異肽段，1939個(gè)蛋白質(zhì)有3個(gè)特異肽段，1761個(gè)蛋白質(zhì)有11個(gè)特異肽段，其他的蛋白質(zhì)有4～10個(gè)特異肽段（圖3B）。鑒定的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量主要分布在20～80 kDa，其中相對分子質(zhì)量在20～30 kDa的蛋白質(zhì)所占比例最高，為17.18%。鑒定覆蓋率在0～10%的有337個(gè)蛋白質(zhì)，覆蓋率大于等于20%的蛋白質(zhì)占總蛋白質(zhì)數(shù)量的52.18%。

注：（A）煙葉樣品蛋白質(zhì)組鑒定；（B）蛋白質(zhì)匹配的特異肽段數(shù)；（C）為煙葉樣品蛋白質(zhì)質(zhì)量分布；（D）基于鑒定肽段的蛋白質(zhì)覆蓋范圍

2.3 3組間共同差異蛋白分析

當(dāng)iTRAQ分析得到的蛋白質(zhì)差異倍數(shù)大于1.2倍或小于0.83倍，且值≤0.05時(shí)，蛋白質(zhì)被鑒定為差異表達(dá)蛋白（上調(diào)顯著性差異蛋白和下調(diào)顯著性差異蛋白）。對已鑒定出的差異蛋白進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)PS vs SS、SS vs RS和PS vs RS這3個(gè)對比組中存在102個(gè)共同豐度差異蛋白質(zhì)（圖3），并利用R語言對這102個(gè)共同差異表達(dá)蛋白進(jìn)行熱圖聚類分析，紅色表示蛋白質(zhì)在樣品中的表達(dá)水平較高，藍(lán)色表示表達(dá)水平較低（圖4）。

圖3 3組間共同差異表達(dá)蛋白

注：圖中顏色所示為樣品中蛋白質(zhì)的相對表達(dá)水平。紅色表示蛋白質(zhì)在樣品中的表達(dá)水平較高，藍(lán)色表示表達(dá)水平較低。

2.4 3個(gè)對比組間差異蛋白火山圖

火山圖可以快速觀察差異表達(dá)蛋白在總定量蛋白中的比例。本研究中利用蛋白表達(dá)量比值（即差異倍數(shù)FC）和T檢驗(yàn)（t-test）-value將這部分顯著變化的蛋白用不同顏色標(biāo)示用以區(qū)分，即以log2（FC）為橫坐標(biāo)，以負(fù)對數(shù)-log10（-value）為縱坐標(biāo)（以|FC|≥1.2，顯著性≤0.05篩選差異表達(dá)蛋白）制作火山圖。PS vs SS組共鑒定出699個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，包括412個(gè)上調(diào)的蛋白質(zhì)和287個(gè)下調(diào)的蛋白質(zhì)（圖5A），在SS vs RS中，共獲得了650個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，有291個(gè)上調(diào)的蛋白質(zhì)和359個(gè)下調(diào)的蛋白質(zhì)（圖5B）。同樣，PS vs RS組間有569個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，包括323個(gè)上調(diào)的蛋白質(zhì)和246個(gè)下調(diào)的蛋白質(zhì)（圖5C）。這些蛋白質(zhì)豐度的差異表明，煙草根系對不同土壤類型的響應(yīng)具有復(fù)雜的生物學(xué)調(diào)控。

注：(A)PS vs SS差異蛋白；(B)SS vs RS差異蛋白；(C)PS vs RS差異蛋白；紅色為上調(diào)蛋白，綠色為下調(diào)蛋白，黑色的為沒有顯著變化的蛋白。

2.5 差異蛋白質(zhì)GO功能注釋

圖6A表示PS vs SS差異蛋白GO注釋結(jié)果。在GO富集分析中，699個(gè)差異蛋白質(zhì)富集到46個(gè)GO term（二級分類）中，分別參與了24個(gè)生物過程、11個(gè)細(xì)胞組成和11個(gè)分子功能。在生物過程條目中，差異蛋白主要富集在代謝過程（metabolic process）、細(xì)胞過程（cellular process）、應(yīng)激反應(yīng)（response to stimulus）等條目；在細(xì)胞組分條目中，差異蛋白質(zhì)在細(xì)胞（cell）、細(xì)胞組分（cell part）、細(xì)胞器（organelle）占較大比例；在分子功能分類中，富集于前3位的條目分別是催化活性（catalytic activity）、結(jié)合（binding）、結(jié)構(gòu)分子活動（structural molecule activity）。

圖6B表示SS vs RS對比組的差異蛋白GO注釋結(jié)果。在GO富集分析中，650個(gè)差異蛋白質(zhì)富集到49個(gè)GO term中，分別參與了27個(gè)生物過程、11個(gè)細(xì)胞組成和11個(gè)分子功能。在生物過程條目中，差異蛋白在代謝過程、細(xì)胞過程、應(yīng)激反應(yīng)等條目占比較高；在細(xì)胞組分條目中，差異蛋白質(zhì)主要富集在細(xì)胞、細(xì)胞組分和細(xì)胞器；在分子功能分類中，富集于前3位的條目分別是催化活性、結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)活性（transport- eractivity）。

圖6C表示PS vs RS對比組的差異蛋白GO注釋結(jié)果。在GO富集分析中，569個(gè)差異蛋白質(zhì)富集到47個(gè)GO term中，分別參與了24個(gè)生物過程、11個(gè)細(xì)胞組成和12個(gè)分子功能。在生物過程中，差異蛋白主要富集在代謝過程、細(xì)胞過程應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞成分的合成中；在細(xì)胞組成分類中，差異蛋白質(zhì)主要富集在細(xì)胞和細(xì)胞組分；在分子功能分類中，差異蛋白在催化活性和結(jié)合2個(gè)功能條目的占比較大。

從總體上看，這些差異蛋白質(zhì)具有多種分子功能，并參與了多種生物過程，說明烤煙根系對不同類型土壤的響應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過程，許多未知功能的蛋白質(zhì)也被鑒定，這些蛋白質(zhì)也參與烤煙根系對不同類型土壤的響應(yīng)。

注：(A) PS vs SS；(B) SS vs RS；(C) PS vs RS。

圖6 烤煙根系差異蛋白GO功能分類（分子功能、細(xì)胞組分、生物過程）

Fig.6 GO functional classification (molecular function, cellular component, biological process) of differentially expressed proteins in flue-tobacco roots

2.6 差異蛋白質(zhì)KEGG富集分析

KEGG富集可以分析確定蛋白質(zhì)參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。Pathway顯著性富集分析發(fā)現(xiàn)，PS vs SS、SS vs RS和 PS vs RS三個(gè)對比組的差異蛋白顯著富集于次生代謝產(chǎn)物的生物合成（Biosynthesisof secondary metabolites）、代謝途徑（Metabolic pathways）和苯丙烷類生物合成（PHenylpropanoid biosynthesis）等代謝途徑。

在PS vs SS組中（圖7A），有520個(gè)差異蛋白質(zhì)被注釋到103條通路中，顯著富集于15條代謝通路中（＜0.05），差異蛋白質(zhì)顯著富集的前5條代謝通路分別為次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑、代謝途徑、苯丙烷類生物合成、不同環(huán)境中的微生物代謝（Microbial metabolism in diverse environments）、二萜類生物合成（Diterpenoid biosynthesis）。

在SS vs RS組中（圖7B），有444個(gè)差異蛋白質(zhì)被注釋到104條通路中，顯著富集于18條代謝通路中（＜0.05），差異蛋白質(zhì)顯著富集的前5條代謝通路分別為次生代謝產(chǎn)物生物合成、代謝途徑、苯丙烷類生物合成、淀粉和蔗糖代謝（Starch and sucrose metabolism）和苯丙氨酸代謝（Phenylalanine metabolism）。

在PS vs RS比較組中（圖7C），有398個(gè)差異蛋白質(zhì)被注釋到101條通路中，顯著富集于15條代謝通路中（＜0.05），差異蛋白質(zhì)顯著富集的前5條代謝通路分別為苯丙氨酸代謝、苯丙烷類生物合成、代謝途徑、異喹啉生物堿生物合成（Isoquinoline alkaloid biosynthesis）、酪氨酸代謝（Tyrosine metabolism）。

2.7 差異蛋白質(zhì)的PRM 驗(yàn)證

通過PRM對16個(gè)靶蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，驗(yàn)證iTRAQ蛋白組學(xué)結(jié)果的可靠性（圖8），結(jié)果表明，3個(gè)比較組間分別有8、11和11個(gè)蛋白質(zhì)與iTRAQ結(jié)果一致，8、5和5個(gè)蛋白質(zhì)與iTRAQ結(jié)果相反。驗(yàn)證結(jié)果表明，有5個(gè)蛋白質(zhì)在3個(gè)對比組中均表現(xiàn)為與iTRAQ定量結(jié)果一致，包括A0A1S3YEB5，A0A1S3YHI6，A0A1S3ZA22，A0A1S4- BNE4，A7XAQ5。

3 討論

3.1 烤煙根系活力及氮代謝相關(guān)酶活性

根系活力是反映根系代謝水平、合成化合物能力的生理指標(biāo)[19]，趙輝等[20]證明了煙草根系活性受土壤類型的影響。在本研究中，紅壤土的根系活性顯著高于水稻土和沙壤土，說明紅壤土有利于煙株根系對土壤水分和養(yǎng)分的吸收利用，支持地上部分的生長。在不同類型土壤下，烤煙根系與氮代謝相關(guān)的酶包括NR、AS和GS活性呈現(xiàn)為紅壤土＞水稻土＞沙壤土，說明烤煙根系氮代謝能力受土壤類型影響較大。王樹會等[21]研究表明，不同類型土壤烤煙的NR活性變化動態(tài)和對氮素的吸收量具有顯著差異，這與本研究有一致性。

3.2 與防御代謝相關(guān)的差異蛋白

在102個(gè)差異蛋白中，共篩選出21個(gè)與防御機(jī)制相關(guān)的蛋白，以A0A1S4C127為代表的過氧化物酶（POD）可以使毒性物質(zhì)失活，使植物免受高濃度氧的毒性作用[22]；以A0A1S3XIZ5為代表的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST），是谷胱甘肽結(jié)合反應(yīng)的關(guān)鍵酶，在解毒和抗蟲方面有重要作用[23]；以A0A1S4CH99為代表的果糖激酶曾被發(fā)現(xiàn)參與植物細(xì)胞的應(yīng)激應(yīng)答[24]。以I7GVS5為代表的熱激蛋白具有分子伴侶功能，主要參與生物體內(nèi)新生肽的運(yùn)輸、折疊、組裝、定位以及變性蛋白的復(fù)性和降解，在細(xì)胞生命活動中起著重要的作用[25]。這些蛋白質(zhì)在對比組PS vs SS中豐度降低，在SS vs RS和PS vs RS這兩個(gè)對比組中豐度增加，推測不同類型土壤影響烤煙根系的防御機(jī)制，且調(diào)控網(wǎng)絡(luò)較為復(fù)雜。

3.3 與碳水化合物與能量代謝相關(guān)的差異蛋白

蔗糖合成酶是蔗糖代謝關(guān)鍵酶，可催化蔗糖的分解和合成，在淀粉合成、碳代謝和固氮調(diào)節(jié)中起著重要作用[26]。在102個(gè)差異蛋白中存在A0A1S3YFR7、A0A1S4ACT4、A0A1S3ZPV3等蔗糖合酶，上述蔗糖合酶在比較組PS vs SS顯著下調(diào)，在SS vs RS和PS vs RS中上調(diào)，這意味著煙草根系的蔗糖代謝可能受到不同類型土壤的影響，紅壤土處理下烤煙根系的蔗糖合酶表達(dá)上調(diào)，說明在紅壤土中烤煙根系的蔗糖代謝通路活性較強(qiáng)。有研究表明，三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle, TCA）是有機(jī)體獲得生命活動所需能量的主要途徑，它為植物合成某些物質(zhì)提供碳骨架[27]。參與TCA循環(huán)的幾種差異蛋白質(zhì)，包括比較組PS vs RS中的檸檬酸合成酶（W8SRJ8）上調(diào)；PS vs SS中的兩個(gè)蘋果酸脫氫酶（A0A1S3YXG6，A0A1S3ZI08）和琥珀酸脫氫酶（A0A1S4AC19）下調(diào)；SS vs RS中的延胡索酸水合酶（A0A1S3WYC1）和琥珀酸輔酶A連接酶（A0A1S3XSQ4）上調(diào)，說明相較于沙壤土和水稻土，紅壤土烤煙根系與TCA循環(huán)相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，可能能量代謝能力較強(qiáng)。

3.4 與蛋白質(zhì)合成能力相關(guān)的差異蛋白

核糖體蛋白質(zhì)是合成蛋白質(zhì)的細(xì)胞器，除參與蛋白質(zhì)合成，核糖體蛋白質(zhì)還具有廣泛的核糖體外功能，如調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、mRNA翻譯、細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等[28]。尤垂淮等[29]研究表明，輪作烤煙根系核糖體蛋白質(zhì)上調(diào)表達(dá)，蛋白質(zhì)合成增加，有利于烤煙的生長，而復(fù)種連作烤煙根系蛋白質(zhì)合成少，同時(shí)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄以及細(xì)胞生長發(fā)育能力降低，不利于烤煙的生長。本研究在3個(gè)比較組的102個(gè)共同差異蛋白中共篩選出8個(gè)核糖體蛋白質(zhì)，其中有5個(gè)核糖體蛋白質(zhì)在比較組SS vs RS和PS vs RS中上調(diào)，由此可以推測，相較于沙壤土和水稻土，紅壤土的蛋白質(zhì)合成增加，有可能利于烤煙生長。

4 結(jié)論

（1）相較于沙壤土和水稻土，紅壤土有利于提高烤煙根系活力和NR、GS、AS等與氮代謝相關(guān)酶的活性；

（2）在不同烤煙根系樣品中，總共鑒定出1282個(gè)定量蛋白，水稻土與沙壤土根系相比，發(fā)現(xiàn)699個(gè)差異蛋白，包括412 個(gè)上調(diào)蛋白與287個(gè)下調(diào)蛋白。沙壤土與紅壤土根系相比，發(fā)現(xiàn)650個(gè)差異蛋白，其中291個(gè)表現(xiàn)為上調(diào)，359個(gè)表現(xiàn)為下調(diào)。水稻土與紅壤土根系相比，發(fā)現(xiàn)569個(gè)差異蛋白質(zhì)，包括323個(gè)上調(diào)蛋白和264個(gè)下調(diào)蛋白；

（3）在基因本體功能注釋中，差異蛋白質(zhì)主要參與代謝過程、細(xì)胞過程、應(yīng)激反應(yīng)等生物過程，存在于細(xì)胞、細(xì)胞組分和細(xì)胞器等部位，有催化、結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)活性等功能；

（4）通過京都基因與基因組百科全書分析，差異蛋白功能富集于次生代謝產(chǎn)物生物合成、代謝途徑和苯丙烷類生物合成等代謝途徑；

（5）紅壤土烤煙根系的抗逆性、碳水化合物和能量代謝、蛋白質(zhì)的合成等相關(guān)差異蛋白的表達(dá)均高于沙壤土和水稻土；

（6）在PRM驗(yàn)證中，3個(gè)對比組選擇的16個(gè)蛋白質(zhì)分別有8、11和11個(gè)蛋白質(zhì)與iTRAQ結(jié)果一致。

[1] 楊林波，邵惠芳，章新軍，等. 煙草根系研究進(jìn)展[J]. 煙草科技，2002, (10): 45-48.

YANG Linbo, SHAO Huifang, ZHANG Xinjun, et al. Research progress of tobacco root system[J]. Tobacco Science & Technology, 2002(10): 45-48.

[2] 陳鵬宇，楊超，汪代斌，等. 基于盆栽試驗(yàn)的促根劑對低溫條件下烤煙地上部生長和根系發(fā)育的影響[J]. 煙草科技，2021, 54(1): 17-23.

CHEN Pengyu, YANG Chao, WANG Daibin, et al. Effects of root-promoting agents on flue-cured tobacco’s shoot and root development grown at low temperature based on pot experiment[J]. Tobacco Science & Technology, 2021, 54(1): 17-23.

[3] 杜倩，郭凌珂，李冰，等. 兩類土壤不同烤煙品種根際微生物變化特征[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020, 61(10): 1994-1998.

DU Qian, GUO Linke, LI Bing, et al. Variation characteristics of rhizosphere microorganisms of different flue cured tobacco varieties in two types of soil [J]. Journal of Zhejiang Agricultural Sciences, 2015(6): 152-154.

[4] 陳璐璐，馮秋紅，孫建新，等. 川西亞高山岷江冷杉外生菌根形態(tài)隨海拔梯度的分化[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2020, 31(9): 2911- 2922.

CHEN Lulu, FENG Qiuhong, SUN Jianxin, et al. Differentiation of ectomycorrhizal morphology ofin subalpine of Western Sichuan with altitude gradient[J]. Chinese Journal of Applied Ecology, 2020, 31(9): 2911-2922.

[5] 劉凱，黨濤濤，王方斌，等. 不同毛管配置對水氮分布和機(jī)采棉根系生長的影響[J]. 水土保持學(xué)報(bào)，2021, 35(3): 268-275+283.

LIU Kai, DANG Taotao, WANG Fangbin, et al. Effects of different capillary configuration on water and nitrogen distribution and root growth of machine harvested cotton[J]. Journal of Soil and Water Conservation, 2021, 35(3): 268-275+283.

[6] 曾宇，葉協(xié)鋒，符云鵬，等. 施加腐熟小麥秸稈對土壤容重及烤煙根系生長的影響[J]. 中國煙草學(xué)報(bào)，2014, 20(3): 68-72.

ZENG Yu, YE Xiefeng, FU Yunpeng, et al. Effects of decomposed wheat straw on soil bulk density and root growth of flue cured tobacco[J]. Chinese Tobacco Science, 2012, 33(1): 98-101.

[7] 賴勇林，楊旭健，吳道銘，等. 土壤栽培條件下根系生長非擾動觀測根箱及其應(yīng)用[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2013, 29(4): 174-182.

LAI Yonglin, YANG Xujian, WU Daoming, et al.Non disturbance observation of root growth in soil and its application[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering, 2013, 29(4): 174-182.

[8] 高林，董建新，武可峰，等. 土壤類型對煙草生長發(fā)育的影響研究進(jìn)展[J]. 中國煙草科學(xué)，2012, 33(1): 98-101.

GAO Lin, DONG Jianxin, WU Kefeng, et al. Research progress on effects of soil types on tobacco growth and development[J]. Chinese Tobacco Science, 2012, 33(1): 98-101.

[9] 馬新明，王小純，倪紀(jì)恒，等. 不同土壤類型煙草根系發(fā)育特點(diǎn)研究[J]. 中國煙草學(xué)報(bào)，2003, (1): 40-45.

MA Xinming, WANG Xiaochun, NI Jiheng, et al. Study on the root development characteristics of tobacco in different soil types[J]. Chinese Tobacco Science, 2003, (1): 40-45.

[10] 高云，盧秀萍，許自成，等. 曲靖中海拔煙區(qū)不同土壤類型烤煙品質(zhì)的差異比較[J]. 土壤通報(bào)，2017, 48(6): 1449- 1456.

GAO Yun, LU Xiuping, XU Zicheng, et al. Comparison of the quality of flue-cured tobacco of different soil types in the middle and West China Tobacco extraction areas of Qujing[J]. Chinese Journal of Soil Science, 2017, 48(06): 1449-1456.

[11] WU Shengjiang, GUO Yushuang, Joan Heren Issaka, et al. iTRAQ- based comparative proteomic analysis reveals high temperature accelerated leaf senescence of tobacco (L.) during flue-cuing [J]. Genomics, 2020, 112: 3075-3088.

[12] WU Shengjiang, CAO Gaoyi, ADIL Muhammad Faheem, et al. Changes in water loss and cell wall metabolism during postharvest withering of tobacco (L.) leaves using tandem mass tag-based quantitative proteomics approach [J]. Plant Physiology and Biochemistry, 2020, 150: 121-132.

[13] 何聰蓮，鄭志云，陳頤，等. 基于iTRAQ技術(shù)篩選煙葉響應(yīng)衰老差異表達(dá)蛋白[J]. 中國煙草學(xué)報(bào)，2020, 26(3): 99-108.

HE Conglian, ZHENG Zhiyun, CHEN Yi, et al. Screening differentially expressed proteins in response to senescence of tobacco leaves based on iTRAQ[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2020, 26(3): 99-108.

[14] Giannopolitis C N, Ries S K. Superoxide dismutases: I. occurrence in higher plants[J]. Plant Physiology, 1977, 59(2): 309-314.

[15] 朱秀云，梁夢，馬玉. 根系活力的測定（TTC法）實(shí)驗(yàn)綜述報(bào)告[J]. 廣東化工，2020,47(6):211-212.

ZHU Xiuyun, LIANG Meng, MA Yu. A review report on the experiments for the determination of root activity by TTC method[J]. Guangdong Chemical Industry, 2020, 47(6):211-212.

[16] 祁忠達(dá)，韋艷，龍水庭，等. 基于TMT質(zhì)譜分析技術(shù)篩選水稻根尖響應(yīng)汞脅迫差異表達(dá)蛋白[J]. 生態(tài)學(xué)雜志，2019, 38(6): 1792-1799.

QI Zhongda, WEI Yan, LONG Shuiting, et al. Screening differentially expressed proteins in response to mercury stress in rice roots by proteomic quantification based on stable isotope labeling and parallel reaction monitoring[J]. Chinese Journal of Ecology, 2019, 38(6): 1792-1799.

[17] Ruiling L, Yuying W, Guozheng Q, et al. iTRAQ-based quantitative proteomic analysis reveals the role of the tonoplast in fruit senescence[J]. Journal of Proteomics, 2016, 146(13): 975-986

[18] Guo Hui, Chen Tianci, Liang Zhi, Fan Lanfen, Shen Yuchun, Zhou Dayan. iTRAQ and PRM-based comparative proteomic profiling in gills of white shrimpunder copper stress[J]. Chemosphere, 2021, 263.

[19] Mohammad S, Shukla A K, Rahul T, et al. Root activity and antioxidant enzyme activities of rice cultivass under different iron toxicity mitigation options[J]. Journal of the Indian Society of Soil Science, 2017, 65(3): 596-611.

[20] 趙輝，趙銘欽，程玉淵，等. 河南南陽煙區(qū)不同類型土壤的根際和非根際微生物及酶活性變化[J]. 土壤通報(bào)，2010, 41(5): 1057-1063.

ZHAO Hui, ZHAO Mingqin, CHENG Yuyuan, et al. Changes of rhizosphere and non rhizosphere microorganisms and enzyme activities in different types of soil in Nanyang Tobacco Growing Area of Henan Province[J]. Chinese Journal of Soil Science, 2010, 41(5): 1057-1063.

[21] 王樹會，趙憲鳳，劉衛(wèi)群. 植煙土壤對云南滇中烤煙碳氮代謝及其代謝產(chǎn)物動態(tài)變化的影響[J]. 西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012, 37(12): 62-66.

WANG Shuhui, ZHAI Xianfeng, LIU Weiqun. Effects of tobacco planting soil on carbon and nitrogen metabolism and dynamic changes of metabolites of flue-cured tobacco in Central Yunnan[J]. Journal of Southwest Normal University(Natural Science Edition), 2012, 37(12): 62-66.

[22] 郭艷陽，劉佳，朱亞利，等. 玉米葉片光合和抗氧化酶活性對干旱脅迫的響應(yīng)[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2018, 54(12): 1839-1846.

GUO Yanyang, LIU Jia, ZHU Yali, et al. Responses of photosynthetic and antioxidant enzyme activities in maize leaves to drought stress[J]. Plant Physiology Journal, 2018, 54(12):1839-1846.

[23] 朱守晶，史文娟. 苧麻谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因BnGSTU1的克隆和表達(dá)分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2018, 19(6): 1197-1204.

ZHU Shoujing, SHI Wenjuan. Cloning and expression analysis of a glutathione-S-transferase genefrom Ramie ((.) Gaudich. )[J]. Journal of Plant Genetic Resources, 2018, 19(6): 1197-1204.

[24] 何亞飛，李霞，謝寅峰. 植物中糖信號及其對逆境調(diào)控的研究進(jìn)展[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2016, 52(3): 241-249.

HE Yafei, LI Xia, XIE Yinfeng. Research progress in sugar signal and its regulation of stress in plan[J]. Plant Physiology Journal, 2016, 52(3): 241-249.

[25] 秦芳玲. 五種野生扁桃亞屬植物種子營養(yǎng)組成和生境脅迫響應(yīng)蛋白組學(xué)研究[D]. 西安：西北大學(xué)，2019.

QIN Fangling. Nutritional composition and proteomics study on seed stress response of five wild speciesplants seeds[D]. Xian: Northwest University, 2019.

[26] 李麗娜，孔建強(qiáng). 植物蔗糖合酶的結(jié)構(gòu)、功能及應(yīng)用[J]. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2015, 31(9): 904-913.

LI Lina, KONG Jianqing. Structure, function and application of plant sucrose synthase[J]. Chinese Journal of Biochemistry Molecular Biology, 2015, 31(9): 904-913.

[27] 王得運(yùn)，羅光明，劉培培，等. 植物響應(yīng)淹澇的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2019, 35(7): 156-161.

WANG Deyun, LUO Guangming, LIU Peipei, et al. Advances in transcriptomics of plant response to flooding[J]. Biotechnology Bulletin, 2019, 35(7): 156-161.

[28] Hu R, Zhu X, Xiang S, et al. Comparative proteomic analysis reveals differential protein and energy metabolisms from two tobacco cultivars in response to cold stress[J]. Acta Physiologiae Plantarum, 2018, 40: 19.

[29] 尤垂淮，陳冬梅，黃錦文，等. 不同種植方式下烤煙根系差異表達(dá)蛋白質(zhì)分析[J]. 中國煙草科學(xué)，2014, 35(1): 89-95.

YOU Chuihuai, CHEN Dongmei, HUANG Jinwen, et al. Analysis of differentially expressed proteins in flue-cured tobacco roots under different planting methods[J]. Chinese Tobacco Science, 2014, 35(1): 89-95.

Screening of differentially expressed proteins in flue-cured tobacco roots in different soil types based on iTRAQ-PRM

YANG Rui1,2, ZHA Wenju3, CHEN Yi1, HE Chenggang2, WANG Tao3, HE Conglian2, FEI Mingliang1*

1 Agronomy Research Center, Yunnan Academy of Tobacco Agriculture Science, Kunming 650031, Yunnan, China;2 College of Tobacco Science, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, Yunnan, China;3 Qujing tobacco company of Yunnan, Qujing 671000, Yunnan, China

[Background] This study aims to reveal the response of flue-cured tobacco roots to different types of soil at the protein level.[Methods] Using flue-cured tobacco variety K326 as material, the root activity, nitrate reductase (NR), glutamine synthetase (GS) and aspartate synthetase (AS) activities of flue-cured tobacco roots in three types of soil including calcareous soil (sandy soil), paddy soil and red soil were measured. iTRAQ technology was used to identify the differentially expressed proteins of flue-cured tobacco roots in three types of soil, and the obtained differential proteins were analyzed by bioinformatics. On this basis,16 proteins were selected for parallel reaction monitoring (PRM) validation. [Results] (1) The root activity and activities of NR, GS, AS of flue-cured tobacco roots in red soil were higher than those in sandy soil and paddy soil ; (2) 699, 650 and 569 differentially expressed proteins were identified from the comparison of paddy soil vs sandy soil, sandy soil vs red soil, paddy soil vs red soil, respectively. The up-regulated/down regulated proteins were 412/287, 291/359 and 323/246, respectively; (3) Differentially expressed proteins are mainly involved in metabolic process, cellular process, stress response and other biological processes. They exist in cells, cell components and organelles, and have catalytic activity, binding activity and transport activity; (4) Their functions are enriched in the biosynthesis and metabolic pathways of secondary metabolites and phenylpropanoid biosynthesis; (5) The stress resistance, carbohydrate and energy metabolism, and protein synthesis of flue-cured tobacco roots in red soil were higher than those in sandy soil and paddy soil; (6) PRM analysis showed that results of iTRAQ proteomics were correct and reliable. [Conclusion] iTRAQ labeling technology was used to screen the root differentially expressed proteins of flue-cured tobacco in different types of soil combined with PRM verification technology, which provided some theoretical basis and technical support for choosing the appropriate soil type, formulating reasonable cultivation technology and producing high-quality tobacco.

iTRAQ; tobacco root system; soil type; nitrogen metabolism; proteomics

Corresponding author. Email：258181714@qq.com

楊睿，查文菊，陳頤，等. 基于iTRAQ-PRM技術(shù)篩選不同類型土壤烤煙根系差異表達(dá)蛋白[J]. 中國煙草學(xué)報(bào)，2022，28（1）. YANG Rui, ZHA Wenju, CHEN Yi, et al. Screening of differentially expressed proteins in flue-cured tobacco roots in different soil types based on iTRAQ-PRM [J]. Acta Tabacaria Sinica,2022, 28(1).doi: 10.16472/j.chinatobacco. 2021.121