NtSPX4基因敲除對煙草苗期磷吸收和生長發(fā)育的影響研究

單玉靜，王召軍，程澤華，余婧，雷波，閆筱筱，張洪映，崔紅*

生物技術(shù)

基因敲除對煙草苗期磷吸收和生長發(fā)育的影響研究

單玉靜1，王召軍1，程澤華1，余婧2，雷波2，閆筱筱1，張洪映1，崔紅1*

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，煙草學(xué)院，鄭州市文化路95號 450002；2 貴州省煙草科學(xué)研究院，煙草行業(yè)分子遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽龍灘壩路29號 550081

【目的】為探究基因在煙草磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用?！痉椒ā客纯寺×藷煵荩↙.）K326中基因，通過CRISPR/Cas9技術(shù)獲得了和均發(fā)生純合突變的K326株系S42，在不同磷濃度的Hoagland溶液培養(yǎng)條件下，對S42株系的生長發(fā)育、物質(zhì)積累、磷吸收相關(guān)基因表達(dá)及有效磷含量變化進(jìn)行研究。【結(jié)果】煙草基因組中存在兩個(gè)同源基因，分別命名為和。其中CDS全長為924 bp，編碼氨基酸序列與祖先種林煙草NsylSPX4相同；CDS全長為933 bp，編碼氨基酸序列與祖先種絨毛煙草NtomSPX4相同。S42株系中和均在第52 bp處插入一個(gè)堿基T，導(dǎo)致NtSPX4蛋白翻譯提前終止。在標(biāo)準(zhǔn)Hoagland溶液培養(yǎng)條件下， S42株系的生長發(fā)育與對照無明顯差異；在高磷條件下，S42株系生長發(fā)育受到抑制，生物量較對照降低了約45%；在低磷條件下，S42株系生長勢優(yōu)于對照，生物量較對照提高了約39%。RT-PCR分析表明，在正常磷條件下，S42株系中磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因和的表達(dá)水平與對照基本一致，在高磷和低磷條件下，S42株系中和基因表達(dá)水平均顯著高于對照K326。有效磷檢測分析表明，不同磷濃度條件下，S42株系中有效磷含量均極顯著高于對照K326?！窘Y(jié)論】基因敲除在低磷條件下可以促進(jìn)煙株的生長發(fā)育，在高磷條件下對煙株生長發(fā)育有一定的抑制作用，在煙草磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)中具有負(fù)向調(diào)控作用。

煙草；；基因編輯；磷脅迫；磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

磷是植物生長發(fā)育的必需營養(yǎng)元素之一，參與植物體內(nèi)多種代謝過程，缺磷會抑制細(xì)胞的分裂和增殖，造成植株生長發(fā)育遲緩甚至停止[1]。據(jù)調(diào)查統(tǒng)計(jì)，我國約有2/3的土壤缺磷，并且由于土壤對磷的強(qiáng)烈化學(xué)固化作用，土壤中可吸收利用的有效磷極度缺乏[2]。通過分子手段篩選培育磷高效基因型的植物是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的研究方向之一。

植物對磷的應(yīng)答反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的過程，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有一百多個(gè)基因參與了植物的缺磷反應(yīng)[3-5]。研究表明含有SPX結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)參與磷酸鹽穩(wěn)態(tài)，包括磷轉(zhuǎn)運(yùn)和對磷缺乏的適應(yīng)[6]。SPX結(jié)構(gòu)域通常位于蛋白質(zhì)的N端，含有三個(gè)高度保守的子結(jié)構(gòu)域，每個(gè)子結(jié)構(gòu)域包含30～40個(gè)氨基酸。根據(jù)是否含有其他保守結(jié)構(gòu)域，SPX結(jié)構(gòu)域蛋白分為四個(gè)亞家族[7-8]，擬南芥和水稻中第一亞家族的成員分別有4個(gè)（AtSPX1-4）和6個(gè)（OsSPX1-6）。擬南芥中，AtSPX1蛋白以磷依賴的方式抑制轉(zhuǎn)錄因子AtPHR1的活性，參與磷穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)[9]。在水稻中研究發(fā)現(xiàn)，是磷吸收的負(fù)調(diào)控因子。在正常情況下，OsSPX4通過SPX結(jié)構(gòu)域與轉(zhuǎn)錄因子OsPHR2蛋白的C端互作，抑制其進(jìn)入細(xì)胞核，從而影響下游磷饑餓誘導(dǎo)基因的表達(dá)[10]。低磷脅迫能導(dǎo)致OsSPX4 蛋白泛素化，然后被26S蛋白酶體降解，從而釋放出PHR2并進(jìn)入細(xì)胞核行使轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，導(dǎo)致磷饑餓誘導(dǎo)基因表達(dá)上調(diào)，從而增強(qiáng)植株對磷的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)[11]。因此，基因在植物對磷的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起著重要作用。

磷對煙株的抗性、煙葉品質(zhì)起著重要的作用[12]。缺磷會造成煙株生長緩慢、根系發(fā)育不良、成熟期推遲、葉片狹小、葉色暗綠，調(diào)制后的葉片缺乏光澤、油分不足、主要化學(xué)成分的含量及比例受到影響[13-14]。研究表明，植物體對磷素的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和再利用過程主要是由位于質(zhì)膜上的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（，）家族調(diào)控[15]，低磷能夠誘導(dǎo)家族的多數(shù)基因特異性表達(dá)或表達(dá)量上調(diào)。、是煙草中已經(jīng)克隆出的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，在缺磷水平下其轉(zhuǎn)錄本大量增加[16]。有研究表明在煙草中和的表達(dá)可能受到類似擬南芥和水稻中的SPX-PHR信號途徑調(diào)控[17]。但目前關(guān)于基因在煙草磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)中的功能還未見報(bào)道。因此，本研究采用同源克隆的方法獲得了煙草中的基因，創(chuàng)制基因敲除株系，通過研究不同磷濃度下煙苗的生長發(fā)育、磷吸收相關(guān)基因的表達(dá)和磷含量的變化，闡明對煙草磷吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，為培育磷高效煙草品種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為煙草主栽品種K326，培養(yǎng)于光照培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件為14 h光，（28±1）℃/10 h暗，（24±1）℃，濕度為60%±2%。

1.2 基因克隆及生物信息學(xué)分析

以水稻中的基因序列在煙草基因組數(shù)據(jù)庫（https://solgenomics.net/organism/Nicotiana tabacum/ genome）中進(jìn)行比對，獲得同源基因序列。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)上下游引物（F1：5’-ATGAAATTC GGGAAAGAATTTA-3’，R1：5’-CTATTCTGGTGGAT GGGAATCC-3’），以K326葉片cDNA為模板擴(kuò)增基因CDS序列，反應(yīng)條件為98℃，5 min；98℃，30 s，58℃，30 s，72℃，45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃，5 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目標(biāo)片段并連接到pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性菌斑，提取質(zhì)粒后送金唯智公司進(jìn)行測序。

NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）在線分析基因的保守結(jié)構(gòu)域。利用DNAMAN和MEGA5.0軟件進(jìn)行多序列比對和進(jìn)化樹分析。

1.3 組織表達(dá)模式分析

分別取K326的根、莖、葉和花4個(gè)組織樣品，經(jīng)液氮速凍后于-80℃保存。RNA提取按照TIANGEN公司試劑盒（DP441）說明書進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄程序參照novoprotein公司的NovoScript? Plus All-in-one 1stStrand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說明書進(jìn)行。

以煙草核糖體蛋白基因?yàn)閮?nèi)參（擴(kuò)增引物為F2：5’-CCCCTCACCACAGAGTCTGC-3’，R2：5’-AAGGGTGTTGTTGTCCTCAATCTT-3’）[18]，分別對（擴(kuò)增引物為F3：5’-TGAGACGATGGGA ATACGTAA-3’，R3：5’-GCTTCCAAAGGAAATAGGA GC-3’）和（擴(kuò)增引物為F4：5’-CAACCCTTC TTTACAACGGAG-3’，R4：5’-CCTCCTGTTGGCCC TTCTG-3’）進(jìn)行RT-PCR分析。反應(yīng)條件為95℃，2 min；95℃，15 s，60℃，15 s，72℃，20 s，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線為：95℃，15 s，60℃，15 s，20 min內(nèi)升至95℃，95℃，15 s。用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[19]。

1.4 載體構(gòu)建

根據(jù)和的CDS序列，在36-55 bp處設(shè)計(jì)gRNA靶位點(diǎn)序列（Targeting Sequence：5’-AGAAACCCTACCCGAATGGA-3’），該靶位點(diǎn)序列能同時(shí)敲除和兩個(gè)基因，并在靶位點(diǎn)序列5’端添加I酶切位點(diǎn)，敲除載體與孟盈等人所用載體相同[20]?；瘜W(xué)合成靶位點(diǎn)序列及其反向互補(bǔ)序列，退火后形成Oligo二聚體，Oligo二聚體與CRISPR/Cas9載體經(jīng)I酶切后進(jìn)行連接，反應(yīng)體系如下：CRISPR/Cas9載體2.0 μL，Oligo二聚體1.0 μL，Enzyme Mix 1.0 μL，無菌水補(bǔ)充至10.0 μL，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中培養(yǎng)，挑選陽性菌斑，提取質(zhì)粒進(jìn)行測序，獲得NtSPX4-knockout基因編輯載體。

1.5 遺傳轉(zhuǎn)化與分子鑒定

采用凍融法[21]將NtSPX4-knockout基因編輯載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，煙草轉(zhuǎn)化采用葉盤轉(zhuǎn)化法[22]，侵染后的葉片轉(zhuǎn)移到含有6.0 mg·L-1潮霉素、0.15 mg·L-1NAA、1 mg·L-16BA、500 mg·L-1噻孢霉素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)和篩選，分化芽轉(zhuǎn)至含有8.0 mg·L-1潮霉素、0.1 mg·L-1NAA、500 mg·L-1噻孢霉素的MS培養(yǎng)基上生根成苗。提取潮霉素抗性植株的DNA，在靶位點(diǎn)上下游根據(jù)和序列分別設(shè)計(jì)特異性引物（F5：5’-TTCATCACATGAT CACATCAG-3’，R5：5’-GGTAAATAAAATTCAGCAA ACAGA-3’；F6：5’-CAGTTGTTTAATTCCAACTAAG TG-3’，R6：5’-TGCAAGTGCGGGGGAGGC-3’）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序篩選靶位點(diǎn)發(fā)生堿基突變的株系。

1.6 磷濃度對煙苗生長發(fā)育的影響

煙草種子消毒后，均勻等量點(diǎn)在浸透蒸餾水的海綿上（30 cm×20 cm×1 cm），置于培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，種子露白后進(jìn)行光照培養(yǎng)。待煙苗長至兩葉一心期時(shí)，將海綿轉(zhuǎn)移至不同磷濃度的Hoagland溶液中進(jìn)行培養(yǎng)。高磷處理（HP）中磷濃度為10 mmol·L-1、對照處理（MP）中磷濃度為1 mmol·L-1、低磷處理（LP）中磷濃度為0.005 mmol·L-1，其它元素濃度保持一致。低磷處理用KCl補(bǔ)充溶液中的K+，高磷處理用NaH2PO4補(bǔ)充溶液中的pi，調(diào)節(jié)PH至6.0。培養(yǎng)過程中，每天定時(shí)定量更換溶液，觀察記錄煙苗的生長發(fā)育狀況。

1.7 煙苗生物量及有效磷含量測定

處理20 d后，將海綿上的煙株取出稱重，每個(gè)處理10個(gè)生物學(xué)重復(fù)，進(jìn)行煙苗生物量的測定。

處理20 d后，每個(gè)處理取5株煙苗，混合均勻，進(jìn)行有效磷含量的測定，測定方法參照文獻(xiàn)中的步 驟[23]。

1.8 磷吸收相關(guān)基因表達(dá)水平分析

處理20 d后，取煙株根組織樣，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以為內(nèi)參，分別對（GenBank accession：AB020061，擴(kuò)增引物F7：5’-ATGGGCTTC TTTACTGATGC-3’，R7：5’-TTCCCATTTTATCTCC GAGCC-3’)和（GenBank accession：AB042951，擴(kuò)增引物F8：5’-CTTGGGCGTTTATACTACACC-3’，R8：5’-CCATGATAATCAAAGTCATACC-3’）進(jìn)行RT-PCR分析。反應(yīng)體系同方法1.3。

1.9 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2003進(jìn)行整理，使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NtSPX4基因克隆及生物信息學(xué)分析

煙草K326中，有兩條序列與水稻基因高度同源，在N端均具有一個(gè)典型的單一的SPX結(jié)構(gòu)域，分別命名為、。經(jīng)克隆、測序發(fā)現(xiàn)，編碼區(qū)長924 bp，編碼區(qū)長933 bp，NtSPX4-2在60-62位較NtSPX4-1多了3個(gè)脯氨酸，二者氨基酸相似性為96.77%（圖1）。

注：NtSPX4：烤煙；NsylSPX4：林煙草；NtomSPX4：絨毛煙草；BXSPX4：香料煙巴斯瑪；TN90SPX4：白肋煙TN90；NbSPX4：本氏煙。

蛋白序列比對和進(jìn)化樹分析表明NtSPX4-1與林煙草中的NsylSPX4氨基酸序列相同，NtSPX4-2與絨毛煙草中的NtomSPX4氨基酸序列相同，說明和來源于不同的祖先種。在白肋煙TN90、香料煙巴斯瑪中均有兩條與NtSPX4-1和NtSPX4-2氨基酸序列分別相同的拷貝。在本氏煙中，NbSPX4-1與NtSPX4-1相似性為97.11%，NbSPX4-2與NtSPX4-2相似性為97.52%。NtSPX4-1、NtSPX4-2與番茄SlSPX4相似性分別為89.39%、92.32%，與水稻OsSPX4相似性分別為56.87%、56.19%，與擬南芥AtSPX4相似性分別為61.77%、60.55%（圖2）。該結(jié)果表明，NtSPX4在栽培煙草不同類型、不同品種之間高度保守，與本氏煙NbSPX4和番茄SlSPX4親緣關(guān)系較近，與水稻OsSPX4及擬南芥AtSPX4的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖2 NtSPX4及其同源蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

2.2 NtSPX4基因組織表達(dá)模式分析

和的組織表達(dá)特異性分析結(jié)果如圖3，、在根、莖、葉和花中均有表達(dá)，在根和花中的表達(dá)水平顯著高于。研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥和水稻中含有SPX結(jié)構(gòu)域的大多數(shù)基因也在不同器官中廣泛表達(dá)，并且這些基因在根中能夠較快地響應(yīng)低磷脅迫從而調(diào)控磷的吸收及磷向其他器官的轉(zhuǎn)運(yùn)[7,24-26]。由此推測，煙草中和不僅參與了磷的吸收，也可能參與了磷的分配，并且在磷吸收過程中起到更加重要的作用。

注：圖中*表示基因表達(dá)量差異在P <0.05水平具有顯著性。

2.3 NtSPX4基因敲除和分子鑒定

基因敲除的測序結(jié)果顯示有19株與野生型序列一致（圖4-a），25株在gRNA區(qū)域出現(xiàn)雙峰（圖4-b），1株發(fā)生純合突變（圖4-c），基因編輯效率約為58%。對圖4-c所示的單株S42進(jìn)行擴(kuò)增并測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)和在靶位點(diǎn)處均發(fā)生了如圖4-c所示的突變，說明和均發(fā)生了純合突變，在第52 bp處插入一個(gè)堿基T，這導(dǎo)致了的移碼突變，蛋白翻譯提前中止（圖4）。

注：下劃線部分為PAM序列。

2.4 磷濃度對NtSPX4純合突變株系生長發(fā)育和物質(zhì)積累的影響

磷濃度對煙苗生長發(fā)育和物質(zhì)積累的影響結(jié)果顯示（圖5），處理20 d后，在磷濃度為1 mmol·L-1的標(biāo)準(zhǔn)Hoagland溶液（MP）中，S42株系與K326生長發(fā)育正常，二者無明顯差異；在磷濃度為10 mmol·L-1的高磷Hoagland溶液（HP）中，S42株系與對照K326相比生長發(fā)育受到抑制，對照K326莖圍較粗，株高較高，葉片較大，說明高磷對S42株系生長有一定抑制作用；在磷濃度為0.005 mmol·L-1的低磷Hoagland溶液（LP）中，S42株系與對照K326生長發(fā)育均受到抑制，出現(xiàn)發(fā)育遲緩、葉色深綠、葉片變厚等現(xiàn)象，但總體上S42株系株高較高，葉片數(shù)較多，葉片較大，生長勢優(yōu)于對照K326。生物量檢測結(jié)果表明，K326煙苗的鮮重隨著磷濃度的升高而增加，S42株系在正常磷濃度下生物量積累最高，在高磷和低磷條件下生物量減少，高磷條件下S42株系的生物量較對照降低了約45%左右，低磷條件下S42株系的生物量較對照提高了39%左右。說明基因的敲除，在高磷條件下對煙株的生長發(fā)育有一定的抑制作用，但在低磷條件下有助于煙株的生長發(fā)育和物質(zhì)積累。

注：圖中*表示不同材料間差異在P<0.05水平具有顯著性。

2.5 NtSPX4基因敲除對磷吸收相關(guān)基因表達(dá)及有效磷含量的影響

不同磷濃度下煙株、的表達(dá)水平的測定結(jié)果顯示（圖6A、6B），在正常磷濃度處理下，S42株系和對照K326中，和基因的表達(dá)水平無顯著差異；在高磷和低磷濃度處理下，S42株系中和表達(dá)水平顯著高于對照K326。其中，高磷情況下，S42株系中表達(dá)量是對照的2倍，表達(dá)量是對照的4.4倍；低磷情況下，S42株系中表達(dá)量是對照的1.6倍，表達(dá)量是對照的1.5倍。該結(jié)果表明，基因的敲除可促進(jìn)煙草磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因、的表達(dá)。S42株系和K326煙株的有效磷含量檢測結(jié)果如圖6C所示，在低磷、高磷以及正常磷濃度處理下，S42株系中可利用的有效磷含量均極顯著高于對照K326。這與磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、基因的表達(dá)趨勢基本一致，證明了基因的敲除提高了煙株對磷元素的吸收能力，促進(jìn)了有效磷的積累。

注：圖中*表示不同材料間差異在P<0.05水平具有顯著性；**表示不同材料間差異在P<0.01水平具有顯著性。

3 討論與結(jié)論

植物磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的分子調(diào)控機(jī)制研究已取得較多進(jìn)展，但鮮有研究將其應(yīng)用于磷高效煙草品種的定向改良。水稻基因是磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的負(fù)調(diào)控因子，該基因缺失突變體中磷含量顯著增加[27]，煙草中基因功能尚未得到深入研究。本研究對煙草進(jìn)行了克隆和生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)存在兩個(gè)同源基因，分別來源于祖先種林煙草和絨毛煙草，在第一外顯子區(qū)域60-62位處比多了3個(gè)脯氨酸。組織表達(dá)特異性分析表明，整體表達(dá)水平高于，而且在根和花中顯著高表達(dá)，推測其在磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)中具有比較重要的作用，這還需要對分別進(jìn)行功能研究來驗(yàn)證。

本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得了K326的基因純合突變株系S42，在此基礎(chǔ)上，研究S42株系與對照在不同磷濃度條件下生長發(fā)育、物質(zhì)積累、基因表達(dá)及有效磷含量等方面的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在正常磷濃度培養(yǎng)條件下，雖然S42株系中有效磷含量顯著高于對照株系，但S42株系的生長發(fā)育與對照無明顯差異，說明此時(shí)煙株體內(nèi)的有效磷含量處于適宜的范圍內(nèi)，由此推測在煙株體內(nèi)有效磷含量在適宜的范圍內(nèi)時(shí)，基因敲除對煙株生長發(fā)育沒有明顯影響；與正常磷濃度相比，在低磷脅迫下S42株系和對照中磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因、的表達(dá)水平均提高，但S42株系的增加程度顯著高于對照株系，與之相應(yīng)的，S42株系中有效磷含量也顯著高于對照株系，說明敲除株系能夠更好的響應(yīng)低磷脅迫，從而比對照表現(xiàn)出更優(yōu)的生長勢；而在高磷脅迫下，與正常磷濃度相比，對照株系中的表達(dá)水平均降低，但S42株系中的表達(dá)水平則未發(fā)生顯著下降，說明敲除株系不能正常響應(yīng)高磷脅迫，仍然保持較高的磷吸收水平，造成體內(nèi)磷濃度過高而使生長發(fā)育受到抑制。結(jié)果表明基因敲除可顯著提高磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因、的表達(dá)水平和有效磷含量，促進(jìn)植株生長發(fā)育和物質(zhì)積累，該結(jié)果與水稻中研究報(bào)道相一致。不同的是，在水稻中突變體在正常條件下表現(xiàn)出“磷毒害”現(xiàn)象，植株葉尖發(fā)黃，但煙草中基因的敲除并未出現(xiàn)這一現(xiàn)象，這可能是由于單子葉植物與雙子葉植物對磷的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)及分配利用存在差異，還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究結(jié)果表明，K326中基因的敲除，不僅使其在正常磷濃度的1/200的低磷脅迫條件下仍具有一定的耐受能力，而且在正常磷濃度10倍的高磷脅迫條件下煙株無明顯的磷中毒現(xiàn)象。鑒于K326本身是耐低磷且磷高效型品種[28]，因而利用該基因?qū)ζ渌椎托У臒煵萜贩N進(jìn)行定向改良具有更為重要的意義，但本研究只是分析了敲除對煙株苗期磷吸收的影響，接下來還需要進(jìn)行不同磷供應(yīng)條件下的田間小區(qū)對比試驗(yàn)，以比較該基因?qū)熤暾麄€(gè)發(fā)育周期的綜合性狀及烤后煙葉的產(chǎn)量品質(zhì)的影響。有研究表明水稻OsSPX4蛋白降解促使氮吸收關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子NLP3易位至細(xì)胞核，從而提高植株對氮的吸收及積累[11]。關(guān)于在提高煙草氮利用效率中的調(diào)控作用將是下一步研究的重點(diǎn)。

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Effect ofgene knockout on phosphorus absorption and growth of tobacco plants in seedling stage

SHAN Yujing1, WANG Zhaojun1, CHENG Zehua1, YU Jing2, LEI Bo2, YAN Xiaoxiao1, ZHANG Hongying1, CUI Hong1*

1 College of Tobacco Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China； 2 Guizhou Academy of Tobacco Science, Key Laboratory of Molecular Genetics, China National Tobacco Corporation, Guiyang 550081, China

[Objective] This study aims to explore the role ofgene on phosphorus absorption and transport in tobacco plant. [Methods] In this research, we cloned thegene from tobacco (L.) cultivar K326 and obtained aandhomozygous mutant strain S42of K326 by CRISPR/Cas9 technology. The expressions of genes related to the growth, material accumulation, phosphorus absorption and available phosphorus content of S42and K326 were analyzed under different phosphorus concentration treatments. [Results] Twoparalogue genes were found in tobacco genome, namedand. The full length ofcoding sequence is 924 bp, and the amino acid sequence is identical to that of; the full length ofcoding sequence is 933 bp, and the amino acid sequence is identical to that of. In strain S42, bothandinserted a base T at 52 bp, which caused the premature of NtSPX4 protein translation. Under the standard Hoagland solution condition, we found that there was no significant difference between S42and K326 in growth. Under high-phosphorus condition, the growth of S42was inhibited, and the biomass was reduced by about 45% compared to that of the control. Under low-phosphorus condition, the growth of S42was better than that of the control, and the biomass was increased by about 39% compared to that of the control. RT-PCR analysis showed that the expression levels of the phosphorus transporter genesandin S42showed no significant difference compared with the control under normal phosphorus condition. Under high- phosphorus and low-phosphorus conditions, the expression levels of theandgenes in S42were significantly up-regulated. The available phosphorus detection analysis showed that the available phosphorus content in S42was significantly higher than that of the control under all treatments. [Conclusion] This study shows thatgene knockout can promote tobacco growth under low-phosphorus condition, while inhibit its growth under high-phosphorus condition.has a negative regulatory effect on phosphorus absorption and transport for tobacco plants.

tobacco;; gene editing; phosphorus stress; phosphorus transporter

Corresponding author. Email：cuihonger_13@163.com

國家煙草專賣局科技計(jì)劃項(xiàng)目110202101005（JY-05）

單玉靜（1996—），碩士研究生，煙草生物技術(shù)，Email：1614504615@qq.com

崔紅（1966—），教授，博士研究生導(dǎo)師，Email：cuihonger_13@163.com

2021-08-30；

2021-12-28

單玉靜，王召軍，程澤華，等. NtSPX4基因敲除對煙草苗期磷吸收和生長發(fā)育的影響研究[J]. 中國煙草學(xué)報(bào)，2022，28（1）. SHAN Yujing, WANG Zhaojun, CHENG Zehua, et al. Effect of NtSPX4 gene knockout on phosphorus absorption and growth of tobacco plants in seedling stage[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2022,28(1). doi: 10.16472/j.chinatobacco. 2021.T0152