當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片指紋圖譜建立及4種成分含量測定

俱蓉 ，楊秀娟 ，2，3，李響 ，王本歡 ，權(quán)起元 ，李碩 ，2，3，靳子明

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省高校中（藏）藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省中藥質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)研究重點實驗室培育基地，甘肅 蘭州 730000；4.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000

當(dāng)歸始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，來源于傘形科植物當(dāng)歸（Oliv.）Diels.的干燥根，甘肅所產(chǎn)為“岷歸”，為甘肅道地藥材。現(xiàn)代研究表明，當(dāng)歸主要活性成分有揮發(fā)油（洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、藁本內(nèi)酯等）、多糖（當(dāng)歸多糖等）、有機(jī)酸（綠原酸、阿魏酸等）等，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抗菌、抗氧化等功能，對呼吸、血液、神經(jīng)等系統(tǒng)有一定作用。

中藥煮散是指原藥材或飲片通過一定的加工方式，得到具有一定規(guī)格的粗顆粒，將其在水中煎煮而煎得的湯藥。與傳統(tǒng)湯劑比較，煮散的有效成分含量和干膏率均高于飲片，且中藥煮散在節(jié)省藥材、節(jié)約煎煮時間及增加煎出率等方面有明顯優(yōu)勢。宋代龐安時《傷寒總病論》有“湯液之制，遭值天下禍亂之久，地脈薄產(chǎn)之時，天災(zāi)眾多之世，安得不吝惜而為煮散乎”的描述，可見煮散目的是在資源稀缺時替代飲片使用、節(jié)省藥材。但目前煮散“粗顆?！钡牧酱_定尚無科學(xué)依據(jù)，且煎煮得到的湯劑易粘鍋、有焦味，煮散的形態(tài)與傳統(tǒng)飲片相比無法進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別，且難以確定煮散與傳統(tǒng)飲片的對應(yīng)量效關(guān)系，亟需對煮散制備工藝及質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究。精準(zhǔn)煮散飲片可為煮散規(guī)范化生產(chǎn)及質(zhì)量控制提供研究思路。當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片是指將當(dāng)歸飲片通過一定加工方式制作成規(guī)格統(tǒng)一的粗顆粒。本課題組前期研究得到當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片的最佳粒度為 0.400～0.475 cm。

中藥指紋圖譜技術(shù)現(xiàn)已廣泛用于中藥材質(zhì)量控制。利用指紋圖譜可從整體上評價當(dāng)歸藥材質(zhì)量，具有體現(xiàn)藥材特異性和信息豐富性的作用。對當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片進(jìn)行指紋圖譜研究，是對其內(nèi)在質(zhì)量的保證，也是對其關(guān)鍵化學(xué)信息的保存。本研究采用HPLC對10批當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片進(jìn)行指紋圖譜研究，并測定綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ和藁本內(nèi)酯的含量，將傳統(tǒng)飲片與精準(zhǔn)煮散飲片作對比，得到2種飲片“量”的對應(yīng)關(guān)系，為當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片的質(zhì)量控制及其開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

CPA224D電子天平、BSA224S-CW十萬之一電子天平（德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；LC-20高效液相色譜儀、DAD檢測器（日本島津）；CH-300型粗碎機(jī)（江陰市高宏機(jī)械制造有限公司）；KQ500VDE超聲波清潔器（昆山市超聲儀器有限公司）。

阿魏酸對照品（批號 L03A9D57744，純度≥98%），綠原酸對照品（批號Y22M8K365444，純度≥98%），藁本內(nèi)酯對照品（批號R06S10F97166，純度≥98%），洋川芎內(nèi)酯Ⅰ對照品（批號 A6A10F85918，純度≥98%），上海源葉生物科技有限公司；乙腈為色譜純，甲醇、磷酸為分析純，水為娃哈哈純凈水。

當(dāng)歸飲片（甘肅隴西保和堂藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號 20191002、20191005、20191006、20191101、20191102、20191104、20191106、20191201、20191204、20191205，編號 S1～S10），經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)李碩副教授鑒定為傘形科植物當(dāng)歸（Oliv.）Diels的干燥根。將當(dāng)歸飲片制備為煮散顆粒，備用。本品呈方形、菱形或類方形的不規(guī)則狀粗顆粒，粒度為0.400～0.475 cm（4～5目），表面淺棕色至棕黃色，有的具有外表皮，香氣濃郁，味甘、辛、微苦。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Robusta C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫程序見表1，檢測波長280 nm，進(jìn)樣量20 μL，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃。

表1 流動相梯度洗脫程序（%）

2.2 對照品溶液制備

精密稱取阿魏酸、綠原酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ和藁本內(nèi)酯對照品適量，加甲醇制成濃度分別為 0.870 4、1.170 1、0.890 0、2.101 1 mg/mL的對照品溶液。分別吸取上述對照品溶液1.00 mL，定容至100 mL棕色容量瓶中，制成混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片1 g，精密稱定，置錐形瓶中，加70%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）提取40 min，取出，冷卻至室溫，再次稱定質(zhì)量，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，過濾，取續(xù)濾液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗

精密吸取供試品溶液20 μL，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）計算，各指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度均大于0.99，表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜的要求。

2.4.2 重復(fù)性試驗

取同一批樣品，按“2.3”項下方法平行制備 6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）計算，指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度均大于0.99，表明此方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗

取樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、16、24 h，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）計算，各指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度均大于0.99，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 指紋圖譜建立

2.5.1 特征指紋峰標(biāo)定

按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分析 10批當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片，指紋圖譜見圖1。將檢測數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版），生成當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片的對照指紋圖譜及共有模式，手動標(biāo)識mark峰并進(jìn)行相關(guān)匹配，確定了 26個共有特征峰，其峰面積總和高于總峰面積的90%。將當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片HPLC指紋圖譜與傳統(tǒng)飲片色譜圖和混合對照品溶液色譜圖進(jìn)行比對，確定了4個共有成分，分別為綠原酸（5號峰）、阿魏酸（8號峰）、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ（12號峰）、藁本內(nèi)酯（25號峰），見圖2。

圖1 10批當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片HPLC指紋圖譜

圖2 當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片HPLC指紋圖譜特征峰標(biāo)定

2.5.2 相似度評價

將HPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版），進(jìn)行相似度分析，結(jié)果相似度均大于0.97，見表2。表明10批當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片具有較好的相似性，本試驗建立的指紋圖譜方法體系合理有效。

表2 10批當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片指紋圖譜相似度評價（r）

2.6 含量測定

2.6.1 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2”項下藁本內(nèi)酯對照品溶液1 mL，用甲醇定容至10 mL棕色容量瓶中。分別精密吸取一定量“2.2”項下綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ和稀釋后的藁本內(nèi)酯對照品溶液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，分別進(jìn)樣10、20、30、40、60、80 μL。以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，計算綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ和藁本內(nèi)酯的回歸方程，結(jié)果見表3，表明4種成分線性關(guān)系良好。

表3 4種成分線性關(guān)系考察結(jié)果

2.6.2 精密度試驗

精密吸取“2.2”項下對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，得到綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ和藁本內(nèi)酯的峰面積 RSD分別為 0.92%、0.69%、1.03%、1.79%，表明儀器精密度良好。

2.6.3 重復(fù)性試驗

取S1樣品，按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，計算含量，得到綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ和藁本內(nèi)酯的平均含量分別為 0.473、0.783、0.244、12.331 mg/g，RSD分別為 1.79%、1.18%、1.19%、1.32%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.4 穩(wěn)定性試驗

取S1樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、16、24 h，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ和藁本內(nèi)酯的峰面積RSD分別為2.07%、1.18%、1.35%、1.26%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

2.6.5 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品6份，分別加入一定量的“2.2”項下對照品溶液，按“2.2”項下方法制備，按“2.1”項下色譜條件測定，計算綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ和藁本內(nèi)酯的加樣回收率，結(jié)果見表4。

表4 4種成分加樣回收率試驗結(jié)果

2.6.6 樣品含量測定

按“2.3”項下方法制備當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片和傳統(tǒng)飲片供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件測定，計算 10批當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片和傳統(tǒng)飲片中綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ和藁本內(nèi)酯的含量，結(jié)果見表5。

表5 10批當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片和傳統(tǒng)飲片中4種成分含量測定結(jié)果（mg/g）

2.7 獨立性權(quán)重法評分分析

獨立性權(quán)重法數(shù)據(jù)之間相關(guān)性，使用回歸分析得到復(fù)相關(guān)系數(shù)R，該值越大表明共線性越強(qiáng)，則權(quán)重越低。以 10批當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片和傳統(tǒng)飲片樣品中綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ和藁本內(nèi)酯含量為評價指標(biāo)，進(jìn)行加權(quán)評分，4種成分的權(quán)重見表6。將當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片與傳統(tǒng)飲片的4種成分均值與權(quán)重系數(shù)相乘得到的綜合得分進(jìn)行比較，得到1 g當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片相當(dāng)于傳統(tǒng)飲片1.26 g，結(jié)果見表7。

表6 獨立性權(quán)重法計算4種成分權(quán)重結(jié)果

表7 當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片與傳統(tǒng)飲片綜合得分比較

3 討論

本課題組在制備當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片時，進(jìn)行了不同粒度的比較，2020年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定的粉末等級（中粉、細(xì)粉、極細(xì)粉等）均在煎煮過程中出現(xiàn)了糊化、粘鍋問題，且藥液澄清度不高?？紤]當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片揮發(fā)油隨粒度變小而容易流失，將當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片最佳粒度確定為0.400～0.475 cm。精準(zhǔn)煮散飲片質(zhì)量控制的關(guān)鍵，是在確定最佳粒度的基礎(chǔ)上評價其整體藥效成分含量，故課題組進(jìn)行色譜指紋圖譜和代表化學(xué)成分含量測定的研究，以期獲得粒度均一、質(zhì)量穩(wěn)定的精準(zhǔn)煮散飲片。

本研究對色譜條件進(jìn)行了考察，對乙腈-1%甲酸水、甲醇-水和乙腈-0.2%磷酸作為流動相的洗脫效果進(jìn)行比較，運用DAD檢測器進(jìn)行全波長掃描，確定采用乙腈-0.2%磷酸為流動相梯度洗脫，檢測波長為280 nm。將當(dāng)歸傳統(tǒng)飲片與精準(zhǔn)煮散飲片色譜圖進(jìn)行比對，確定共有成分，10批當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片指紋圖譜相似度均大于0.97，表明不同批次間相似度良好，指紋圖譜可代表當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片的整體信息。

本試驗在比較CRITIC法、信息量權(quán)重法、熵權(quán)系數(shù)法、獨立性權(quán)重法及加權(quán)評分法的基礎(chǔ)上，采用獨立性權(quán)重法作為綜合評定方法，將每種成分進(jìn)行單獨加權(quán)，結(jié)果顯示，當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片1 g相當(dāng)于傳統(tǒng)飲片1.26 g，且當(dāng)歸傳統(tǒng)飲片中這4種成分的含量整體低于當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片。

本試驗建立的指紋圖譜與含量測定方法穩(wěn)定可靠，可用于當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片的質(zhì)量控制與評價。當(dāng)歸精準(zhǔn)煮散飲片與傳統(tǒng)飲片HPLC指紋圖譜的整體信息，可為其規(guī)范化生產(chǎn)及質(zhì)量控制提供依據(jù)，也可為根及根莖類中藥材煮散研究及臨床應(yīng)用提供參考。