藏紅花素誘導視網(wǎng)膜母細胞瘤自噬性死亡并抑制細胞侵襲和PI3K/AKT的活化*

林 珊 屈思萌 張 榮 王生海 韋秋紅Δ

（1 保定市第一中心醫(yī)院眼一科，2 河北大學附屬醫(yī)院ICU重癥醫(yī)學科，保定 071000）

視網(wǎng)膜母細胞瘤（retinoblastoma，Rb）是全世界兒童中最常見的眼內(nèi)腫瘤，盡管盡早發(fā)現(xiàn)可治愈，但在發(fā)展中國家Rb死亡率高達70%[1]。盡管在放射療法和化學療法以及手術(shù)切除治療Rb方面取得了進步，但晚期Rb很難治療，因為Rb可以迅速填充眼睛，侵入視神經(jīng)，并最終擴散到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從而致命[2]。因此，迫切需要開發(fā)用于治療Rb新的藥物。藏紅花素（Crocin）是鳶尾科番紅花屬球根類草本植物藏紅花中提取的一種水溶性類胡蘿卜素。相關(guān)研究表明藏紅花素具有較強的抗腫瘤活性，可抑制腫瘤的生長和擴散，包括結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、骨髓癌和白血病[3-9]，這表明它可以作為癌癥化療和癌癥預防劑。本研究旨在探究藏紅花素對Rb自噬、凋亡、侵襲和PI3K/AKT活化的影響，以期為藏紅花素應(yīng)用于Rb的治療提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗藥物和主要試劑

藏紅花素購自美國Sigma-Aldrich，化學式為C44H64O24，分子量976.96；Roswell Park Memorial Institute 1640（RPMI 1640）培養(yǎng)基、胎牛血清、青-鏈霉素、胰蛋白酶購自美國Gibco 公司；Transwell購自美國Corning Costar；CCK-8試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、免疫熒光染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗LC3Ⅰ/LC3Ⅱ、Beclin1、ATG7、PI3K、p-PI3K、AKT（ab106693）、p-AKT、GAPDH單克隆抗體購自英國Abcam公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

人Rb細胞Y79來源于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，將細胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基中，添加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素，置于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h更換新鮮培養(yǎng)基，1：2傳代。選用對數(shù)生長期細胞為實驗用細胞。

1.3 CCK-8

將Rb細胞Y79接種于96孔板（100 μL/孔）孵育24 h后，用不同劑量（0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16 μmoL/L）藏紅花素處理細胞，每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育4 h，在450 nm處用酶標儀測定OD值。

1.4 細胞分組及處理

通過方法1.3結(jié)果計算藏紅花素對人Rb細胞Y79的IC50值，選擇無顯著毒性1、2、4 μmoL/L劑量藏紅花素處理Y79細胞48 h，并選擇0 μmoL/L劑量藏紅花素作為對照組，將細胞分為4組：對照組、藏紅花素1 μmoL/L組、藏紅花素2 μmoL/L組和藏紅花素4 μmoL/L組。

1.5 免疫熒光

將爬片用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗15 min，用0.1 % Triton X-100通透5 min，用5 %牛血清白蛋白（BSA）在PBS中培養(yǎng)30 min，滴加LC3（1∶100）或AKT（1∶100）一抗，4℃孵育過夜，清洗后，加入FITC標記熒光二抗（1∶1 000）孵育2 h，最后加入DAPI染色避光孵育1 h。清洗后用抗熒光淬滅劑封片。在熒光顯微鏡下觀察，并采集圖片，每個細胞的綠色熒光斑點數(shù)量通過用斑點數(shù)除以每個場中的細胞核數(shù)來確定。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡

采用Annexin V-FITC和PI雙重染色檢測細胞凋亡。收集各組Y79懸浮細胞到10 mL的離心管中，每樣本細胞數(shù)為3×106/mL， 1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液，用孵育緩沖液洗滌1次，1 000 r/min離心5 min，重懸細胞后加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI溶液室溫避光孵育15 min，1 000 r/min離心5 min，將細胞懸浮在結(jié)合緩沖液中，采用流式細胞儀分析。右上象限（晚期凋亡）和右下象限（早期凋亡）中的Y79細胞是凋亡細胞。

1.7 Transwell檢測細胞遷移

Transwell小室加入50 μL基質(zhì)膠并于37℃孵育3 h凝固。將1.4所述的方法分組及處理的細胞接種于Transwell小室上室，其中上室為無血清培養(yǎng)基，下室為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后取出小室，擦除未過膜的細胞后多聚甲醛固定，1%結(jié)晶紫染色后拍照。每組取3個隨機視野，計數(shù)視野中的染色細胞數(shù)目即為侵襲細胞數(shù)。

1.8 免疫印跡檢測

收集各組細胞加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液進行總蛋白提取，用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)含量。提取等量的蛋白質(zhì)樣品，在100℃條件下變性5 min。然后使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，在4℃條件下加入LC3（1∶3 000）、Beclin1（1∶2 000）、ATG7（1∶3 000）、PI3K（1∶1 000）、p-AKT（1∶1 000）、AKT（1∶1 000）、p-AKT（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000）并孵育過夜，清洗，然后在4℃下加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶10 000），孵育2 h，最后加入發(fā)光液，曝光處理。Image J軟件統(tǒng)計灰度值。

1.9 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用SPSS 18.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采取t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 藏紅花素降低Y79細胞活力

通過CCK-8法檢測不同劑量藏紅花素對Y79細胞活力的影響，與0.125 μmoL/L組相比較，2、4、8、16 μmoL/L組細胞存活率顯著降低（P＜0.05）（圖1）。

圖1 藏紅花素對Y79細胞存活率的影響

2.2 藏紅花素升高Y79細胞LC3含量

通過免疫熒光檢測LC3含量結(jié)果，與對照組相比較，Crocin 2、4 μmol/L組細胞LC3含量顯著升高（P＜0.05）（圖2）。

圖2 藏紅花素對Y79細胞LC3含量的影響，×200。A～D：免疫熒光染色； A：對照組；B：藏紅花素1 μmol/L組；C：藏紅花素2 μmol/L組；D：藏紅花素4 μmol/L組；E：各組LC3比較。*P＜0.05 vs 對照組.

2.3 藏紅花素升高Y79細胞LC3II/LC3I比值，降低ATG7蛋白表達水平

免疫印跡檢測各組細胞LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Beclin1、ATG7蛋白表達水平，與對照組相比較，Crocin 2、4 μmoL/L組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著升高（P＜0.05），Beclin1、ATG7蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）（圖3）。

圖3 藏紅花素對Y79細胞LC3I、LC3II、Beclin1、ATG7蛋白表達水平的影響

2.4 藏紅花素促進Y79細胞凋亡

通過流式細胞儀檢測各組細胞凋亡，與對照組相比較，Crocin 2、4 μmol/L組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）（圖4）。

圖4 流式細胞術(shù)檢測藏紅花素對Y79細胞凋亡的影響

2.5 藏紅花素抑制Y79細胞侵襲

與對照組相比較，藏紅花素2、4 μmol/L組侵襲細胞數(shù)顯著降低（P＜0.05）（圖5）。

圖5 藏紅花素對Y79細胞侵襲細胞數(shù)的影響，×200。A～D：Transwell檢測細胞侵襲； A：對照組；B：藏紅花素1 μmol/L；C：藏紅花素2 μmol/L；D：藏紅花素4 μmol/L；E：各組侵襲細胞數(shù)目比較，*P＜0.05 vs 對照組.

2.6 藏紅花素降低Y79細胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值及AKT核轉(zhuǎn)位

通過免疫印跡檢測各組細胞PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達水平結(jié)果如圖6A所示，與對照組相比較，藏紅花素2、4 μmoL/L組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值顯著降低（P＜0.05）；免疫熒光檢測AKT的細胞核轉(zhuǎn)位情況結(jié)果如圖6C所示，與對照組相比較，藏紅花素2、4 μmoL/L組AKT核轉(zhuǎn)位顯著降低（P＜0.05）。

圖6 藏紅花素對Y79細胞PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達水平和AKT核轉(zhuǎn)位的影響，×200。A：免疫印跡檢測PI3K和AKT蛋白的磷酸化；B：蛋白相對表達水平；C～F：免疫熒光檢測AKT的表達；C：對照組；D：藏紅花素1 μmol/L；E：藏紅花素2 μmol/L；F：藏紅花素4 μmol/L；G：各組AKT核轉(zhuǎn)位的比較，*P＜0.05 vs 對照組.

3 討論

Rb是源自未成熟視網(wǎng)膜細胞的眼內(nèi)惡性腫瘤，目前用于Rb治療的策略有限，包括手術(shù)切除、放療和全身化學療法[10]，因此，需要新的療法和治療策略來改善Rb患者的預后。植物類藥物在中醫(yī)治療疾病中發(fā)揮著重要作用，植物類藥物及提取物因其作用溫和、療效顯著、副作用輕，因而廣泛用于許多疾病的治療。本研究通過CCK-8法實驗結(jié)果表明，藏紅花素具有降低Y79細胞活力的作用。提示藏紅花素可能對Rb具有抗腫瘤活性。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)藏紅花素處理后， Y79細胞LC3含量和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高， ATG7蛋白表達水平降低。自噬是一種主要的細胞內(nèi)降解過程，發(fā)生在細胞遭受某些應(yīng)激條件時，可抑制某些癌細胞的生長[11]。自噬蛋白LC3可分為LC3Ⅰ和LC3Ⅱ2種，LC3Ⅱ定位在雙層膜和自噬體上，是自噬體的特異性標志分子，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值與自噬泡的數(shù)量呈正相關(guān)，其比值大小是判定自噬水平高低的依據(jù)[12]。Beclin1基因，可作為抑癌基因參與大部分惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在 Rb中表達下調(diào)可降低細胞自噬能力，增加腫瘤發(fā)生的概率[13]。ATG7是自噬調(diào)節(jié)的重要蛋白，可通過調(diào)節(jié)多種酶的活性從而激活細胞的自噬及凋亡過程[14]。駱玉霜等[15]研究發(fā)現(xiàn)藏紅花素聯(lián)合順鉑可能下調(diào)LC3Ⅱ和ATG7表達，提高對BGC-823細胞的生長抑制作用。Zeng等[16]研究顯示藏紅花素通過調(diào)節(jié)自噬活性狀態(tài)，起到保護心肌細胞的功效。本研究與上述研究結(jié)果一致，說明藏紅花素可抑制Y79細胞自噬。

本研究通過流式和Transwell實驗結(jié)果顯示，經(jīng)藏紅花素處理后，Y79細胞凋亡率升高，侵襲細胞數(shù)降低。相關(guān)研究表明，藥物過度誘導自噬可導致腫瘤細胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)[17]。細胞凋亡屬于機體對自身穩(wěn)定性進行調(diào)節(jié)的一種機制，提高腫瘤細胞凋亡率，是多種抗腫瘤藥物及抗癌基因作用的典型特征。Rb的惡性程度極高，防治Rb侵襲對于控制腫瘤、提高治愈率及延長患者生存具有重要意義。劉柏林等[17]研究表明藏紅花素可誘導人胰腺癌HPAC細胞凋亡，李媛等[18]研究表明藏紅花素可抑制黑色素瘤A375細胞的侵襲與遷移。說明藏紅花素具有促進Y79細胞凋亡，降低細胞侵襲能力的作用。

磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸蘇氨酸激酶（phosphatidylinositol 3-kinase/Serine/threonine kinase，PI3K/AKT）信號通路在炎癥反應(yīng)和各種腫瘤細胞中發(fā)揮重要作用，其表達異常可導致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[19]。相關(guān)研究表明，PI3K/AKT信號通路在Rb中表達異常，可參與調(diào)控腫瘤細胞生長、凋亡等過程[20]。Gui等[21]研究表明，抑制PI3K/AKT信號通路可降低Rb的增殖及誘導細胞的凋亡。Qi 等[22]研究顯示藏紅花素可以通過PI3K/AKT信號通路阻止視網(wǎng)膜缺血性損傷導致的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡。本研究結(jié)果表明，藏紅花素具有降低Y79細胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值及AKT核轉(zhuǎn)位的作用，提示藏紅花素抑制PI3K/AKT信號通路。

綜上所述，藏紅花素誘導Y79細胞凋亡和自噬，抑制細胞侵襲，這可能是通過抑制PI3K/AKT活化實現(xiàn)。然而Rb細胞凋亡、自噬和侵襲機制較復雜，是否還通過其他通路發(fā)揮作用，還有待于后續(xù)深入研究。