NOD樣受體C5對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡及核轉(zhuǎn)錄因子-κB表達(dá)的影響

王海燕 趙潤(rùn)根 肖高健

（河南平煤集團(tuán)總醫(yī)院消化內(nèi)科，平頂山 467000）

肝癌具有高發(fā)生率和死亡率[1-2]。肝癌病理過(guò)程較復(fù)雜，其中肝慢性炎癥因素得到學(xué)者們的認(rèn)可。研究表明，核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factorκB，NF-κB）在炎癥誘發(fā)肝癌中起重要作用[3]，其可參與免疫、炎癥、癌變等多種生理病理過(guò)程[4-5]。機(jī)體中多種有效的抗凋亡基因可被NF-κB激活，且激活NF-κB可使細(xì)胞對(duì)凋亡失去敏感性，從而產(chǎn)生抗凋亡作用，促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展[6]。最新研究報(bào)道稱，天然免疫系統(tǒng)中的NOD樣受體（NOD-like receptor，NLP）家族成員之一，NLRC5的蛋白分子直接與先天免疫細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路中IKKα和IKKβ結(jié)合，從而抑制其磷酸化，能夠有效調(diào)控免疫細(xì)胞活性，以避免炎癥反應(yīng)不斷增加造成對(duì)機(jī)體本身的傷害[7-8]。研究顯示，NLRC5可通過(guò)調(diào)控NF-κB炎癥體通路和基因的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能[9-10]，但NLRC5具體作用機(jī)制尚未有明確報(bào)道。因此，本研究通過(guò)向肝癌細(xì)胞株SMMC-7721轉(zhuǎn)染NLRC5 miRNA，并分析NLRC5對(duì)肝癌細(xì)胞的凋亡和增殖能力的影響，探究其對(duì)NF-κB的調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

本實(shí)驗(yàn)所用有正常的肝細(xì)胞株HL-7702和人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721均購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物寶藏中心。

1.2 試劑和儀器

NLRC5（Abcam公司）；NF-κB抗體（美國(guó)PTG）；TRIzol Reagent 試劑（美國(guó) Invitrogen公司）；RNA提取試劑盒（TaKaRa Bio公司）；逆轉(zhuǎn)錄以及qPT-PCR試劑盒（廣州Gene Copoeia公司）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó) Thermo Fisher 公司）；凝膠電泳儀、半干轉(zhuǎn)儀、濕干轉(zhuǎn)儀（美國(guó)伯樂(lè)生物公司）；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó) Eppndorf 公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

HL-7702、SMMC-7721細(xì)胞在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中均補(bǔ)充有10% FBS和雙抗青霉素（100 UI/mL）-鏈霉素（100 μg/mL），于37℃、5% CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，每天更換培養(yǎng)液1次，2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組

所有操作按照細(xì)胞轉(zhuǎn)染的步驟嚴(yán)格進(jìn)行。按1∶30的比例在培養(yǎng)基中加入轉(zhuǎn)染液，并將其混勻后靜置，10 min后將人源pEGFP-C2-NLRC5重組質(zhì)粒載體和空質(zhì)粒載體（Vector）均加入到含有轉(zhuǎn)染液的培養(yǎng)基中，將其混勻后靜置，10 min后讓其發(fā)生反應(yīng)生成復(fù)合體。將以上配置好的復(fù)合體全部鋪到6孔板內(nèi)，輕輕晃動(dòng)后加入細(xì)胞的懸浮液，混勻后用培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。

將SMMC-7721細(xì)胞分為3組。NLRC5組：在SMMC-7721細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA pEGFP-C2-NLRC5重組質(zhì)粒載體后進(jìn)行培養(yǎng)；Vector組：在SMMC-7721細(xì)胞中轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體后進(jìn)行培養(yǎng)；對(duì)照組：?jiǎn)渭僑MMC-7721細(xì)胞不做任何處理，正常培養(yǎng)。采用qRT-PCR檢測(cè)NLRC5的轉(zhuǎn)染以及表達(dá)效率。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)HL-7702和SMMC-7721細(xì)胞中NLRC5的表達(dá)

分別取出HL-7702細(xì)胞和SMMC-7721細(xì)胞，用TRIzol進(jìn)行裂解，對(duì)總RNA進(jìn)行提取，所有的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，所得到的cDNA進(jìn)行熒光實(shí)驗(yàn)。按照反應(yīng)的條件嚴(yán)格進(jìn)行擴(kuò)增，變性3 s 95℃，變性10 s 95℃，退火30 s 60℃，共40個(gè)循環(huán)。取平均值后得到Ct值，計(jì)算方法用2－△△Ct法進(jìn)行分析（表1）。

表1 引物序列

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取轉(zhuǎn)染后的3組肝癌細(xì)胞，使用4℃的恒溫離心機(jī)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行離心處理，5 min后收集經(jīng)過(guò)離心處理的細(xì)胞；收集3組細(xì)胞后，在細(xì)胞中加入100 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，隨后加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL的PI溶液，輕輕把所有溶液混勻；在避光環(huán)境下室溫孵育，15 min后再次加入400 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，最后用流式細(xì)胞儀對(duì)肝癌細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

比較3組細(xì)胞在傳代后3、6、9、12、24、48 h SMMC-7721細(xì)胞的增殖情況。接種細(xì)胞于96孔板內(nèi)，分別培養(yǎng)細(xì)胞12、48、72 h，添加20 μL MTT溶液于孔板的每孔中，培養(yǎng)箱孵育4 h，棄掉培養(yǎng)基，將100 μL 二甲基亞砜加入每孔中，終止反應(yīng)。將孔板置于無(wú)光條件下并渦旋10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)下各孔吸光度值，以空白孔為參照來(lái)評(píng)估細(xì)胞增殖能力。

1.7 免疫印跡檢測(cè)細(xì)胞NF-κB的蛋白表達(dá)

取轉(zhuǎn)染后的3組細(xì)胞進(jìn)行裂解，并提取核蛋白，并對(duì)核蛋白的濃度進(jìn)行測(cè)量，分裝后，保存在-20℃的環(huán)境中。將提取出的蛋白溶液和緩沖溶液進(jìn)行混勻，按照4∶1的比例進(jìn)行，為使蛋白質(zhì)變性，需將蛋白溶液全部進(jìn)行煮沸處置。在電泳板內(nèi)加50 μg蛋白樣品。全部轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，再把脫脂奶粉加入，封閉1 h。加入一抗（NF-κB，1∶100）后，進(jìn)行TTBS洗滌，最后加入二抗（1∶100）對(duì)溶液進(jìn)行稀釋，再在常溫的環(huán)境中封閉1 h。取出PVDF膜，TTBS漂洗，DAB顯色后數(shù)碼相機(jī)照相。

1.8 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞NF-κB mRNA的表達(dá)

取轉(zhuǎn)染后的3組細(xì)胞，用TRIzol進(jìn)行總RNA的提取，逆轉(zhuǎn)錄按照說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格進(jìn)行，將逆轉(zhuǎn)后所得的cDNA進(jìn)行熒光反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。所有反應(yīng)嚴(yán)格按照反應(yīng)的條件進(jìn)行擴(kuò)增，變性4 min 94℃，變性30 s 94℃，變性40 s 50℃，變性40 s 72℃，退火7 min 72℃，共40個(gè)循環(huán)。取得的平均值后得到Ct值，計(jì)算方法用2－△△Ct法進(jìn)行分析，引物序列見(jiàn)表1。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用±s表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，結(jié)果以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NLRC5 mRNA的表達(dá)

與正常肝細(xì)胞HL-7702相比，肝癌細(xì)胞SMMC-7721中的NLRC5 mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05）（圖1）。對(duì)照組和Vector組細(xì)胞中NLRC5 mRNA相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與對(duì)照組、Vector組相比較，NLRC5組細(xì)胞中NLRC5 mRNA的表達(dá)顯著降低（P＜0.05）（圖2）。

圖1 正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中NLRC5 mRNA表達(dá)比較

圖2 3組細(xì)胞中NLRC5 mRNA的表達(dá)變化

2.2 肝癌細(xì)胞凋亡變化

與對(duì)照組相比，Vector組細(xì)胞凋亡率無(wú)顯著差異（P＞0.05）；與對(duì)照組、Vector組相比，NLRC5組細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.05）（圖3）。

圖3 3組肝癌細(xì)胞的凋亡變化（A）及比較（B）

2.3 肝癌細(xì)胞增殖能力的變化

與對(duì)照組相比，Vector組細(xì)胞的增殖能力無(wú)變化（P＞0.05）；而NLRC5組細(xì)胞的增殖能力顯著低于對(duì)照組和Vector組（P＜0.05）（圖4）。

圖4 3組肝癌細(xì)胞增殖能力的變化

2.4 細(xì)胞NF-κB蛋白表達(dá)的變化

與Vector組相比，NLRC5組細(xì)胞中的NF-κB蛋白表達(dá)顯著增多（P＜0.05）；對(duì)照組和Vector組細(xì)胞中NF-κB蛋白比無(wú)顯著差異（P＞0.05）（圖5）。

圖5 3組細(xì)胞中NF-κB蛋白表達(dá)的變化

2.5 細(xì)胞中NF-κB mRNA表達(dá)的變化

與對(duì)照組、Vector組相比，NLRC5組細(xì)胞中NF-κB mRNA的表達(dá)（0.43±0.05）顯著升高（P＜0.05），對(duì)照組（0.12±0.02）和Vector組（0.13±0.03）細(xì)胞中NF-κB mRNA表達(dá)無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

3 討論

肝癌是世界上常見(jiàn)腫瘤之一， 每年約有70多萬(wàn)人死于肝細(xì)胞癌，其死亡率位居惡性腫瘤第2位[11-12]。肝癌的發(fā)生發(fā)展是多基因、多因素、多生物階段共同作用的結(jié)果[13]。目前在臨床上通常采用外科手術(shù)的方法對(duì)肝癌進(jìn)行治療，但患者手術(shù)后還會(huì)有復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的可能，這對(duì)肝癌的治療和預(yù)后情況產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，但當(dāng)中晚期的肝癌患者不具備臨床手術(shù)的條件時(shí)，目前還沒(méi)發(fā)現(xiàn)其他的有效治療方法。在過(guò)去幾十年，肝癌患者存活率并沒(méi)有顯著提高。因此，需要找到更好的肝癌治療手段和藥物。天然免疫是抗病原體感染的第一道防御屏障，在防御外來(lái)微生物入侵的同時(shí)持續(xù)監(jiān)控入侵病原體的環(huán)境[14]。天然免疫系統(tǒng)通過(guò)多種不同模式識(shí)別病原體，對(duì)免疫反應(yīng)進(jìn)行有效激活。NLRs是目前最新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)識(shí)別受體家族，其中包括5個(gè)亞家族，在人體中有23個(gè)成員，在動(dòng)物中有34個(gè)成員[15]。最近研究表明，NLRs參與許多免疫調(diào)節(jié)過(guò)程和很多其他疾病，其在疾病中的作用也引起了很大的關(guān)注。此外也有研究表明，NLRs的激活與結(jié)腸癌、乳腺癌和肝癌等多種類型的癌癥有密切關(guān)系[16]。作為NLRs成員之一的NLRC5被發(fā)現(xiàn)在先天免疫調(diào)節(jié)中有著重要的作用，但具體扮演什么角色尚不清楚。

本研究通過(guò)向SMMC-7721細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA pEGFP-C2-NLRC5重組質(zhì)粒載體和空質(zhì)粒載體進(jìn)行培養(yǎng)，NLRC5 mRNA比較結(jié)果顯示，正常的肝細(xì)胞中NLRC5 mRNA呈低表達(dá)，在肝癌SMMC-7721細(xì)胞中高表達(dá)；轉(zhuǎn)染后3組細(xì)胞中NLRC5組中的表達(dá)顯著低于對(duì)照組和Vector組，可見(jiàn)NLRC5參與肝癌的發(fā)生和發(fā)展。肝癌是一種高侵襲、高轉(zhuǎn)移性癌癥，臨床治療又面臨易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，從而使臨床治療效果難以得到提高。目前對(duì)于肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移進(jìn)行有效的抑制成為了治療肝癌的熱點(diǎn)。因此，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，NLRC5組肝癌細(xì)胞的凋亡數(shù)量顯著多于對(duì)照組和Vector組，而肝癌細(xì)胞的增殖能力顯著降低；對(duì)照組和Vector組細(xì)胞的凋亡數(shù)量和增殖能力沒(méi)有顯著的差異。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NLRC5可以調(diào)控肝癌細(xì)胞的凋亡和增殖能力。汪歡等[17]研究顯示，NLRC5肝癌細(xì)胞中高表達(dá)，并促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲，在肝癌的發(fā)生和發(fā)展中起到促進(jìn)作用。

目前為止，NF-κB是公認(rèn)的一種具有轉(zhuǎn)錄激活的蛋白質(zhì)，屬于NF-κB/Rel家族中的重要成員[18]。在動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，NF-κB主要是由p50和p65兩個(gè)多肽鏈單位組成，NF-κB通常在細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，是一種極容易被誘導(dǎo)的二聚體。在炎癥反應(yīng)中，NF-κB是最為重要的轉(zhuǎn)錄因子。最近文獻(xiàn)報(bào)道NLRC5可有效調(diào)控NF-κB的活性[19]。有研究表明，NLRC5對(duì)NF-κB可進(jìn)行負(fù)向調(diào)控，同時(shí)負(fù)調(diào)控干擾素-I信號(hào)的發(fā)生途徑[20]。在機(jī)體的多種免疫反應(yīng)中，NLRC5起主要的介導(dǎo)作用，但其在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)中具體的反應(yīng)機(jī)制還未見(jiàn)明確的報(bào)道。NLRC5通過(guò)調(diào)控I類主要組織相容性復(fù)合體的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)病原體特異性CD8+T細(xì)胞的激活與增殖，從而有效清除病原菌。研究證實(shí)，小鼠組織中均有NLRC5表達(dá)，但在造血細(xì)胞中的表達(dá)最高，同時(shí)免疫組織中NLRC5 mRNA的表達(dá)相對(duì)較高?？梢?jiàn)，在機(jī)體的免疫和防御中，NLRC5起到一定的調(diào)節(jié)作用[21]。本研究通過(guò)免疫印跡和qRT-PCR檢測(cè)顯示，NLRC5組細(xì)胞中的NF-κB的蛋白和mRNA表達(dá)均顯著增高，可見(jiàn)低表達(dá)NLRC5可增加肝癌細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)，NLRC5對(duì)NF-κB可進(jìn)行負(fù)向調(diào)控。Liu等[19]研究顯示，在HEK293T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的NLRC5抑制NF-κB和干擾素信號(hào)通路，這種關(guān)系很可能是轉(zhuǎn)錄抑制所導(dǎo)致，也再次證實(shí)了NLRC5可負(fù)向調(diào)控NF-κB信號(hào)通路，從而對(duì)過(guò)激的炎癥反應(yīng)進(jìn)行有效抑制。

綜上，低表達(dá)NLRC5可促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與負(fù)調(diào)控NF-κB有關(guān)，進(jìn)而對(duì)肝癌的發(fā)生發(fā)展起到抑制作用。