miR-193a-3p通過富亮氨酸α2糖蛋白1/鞘氨醇激酶1信號通路抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌增殖與侵襲

何思思 李國良 黃鵬程

（郴州市第一人民醫(yī)院南院，1 健康管理中心，2 口腔科，郴州 423000）

口腔鱗狀細(xì)胞癌占頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的50%左右[1]。其中，舌癌在臨床上最為常見，約占50%[2]?？谇击[癌的轉(zhuǎn)移能力較強，可通過淋巴等浸潤周圍組織，還可造成口腔功能異常，影響患者生活質(zhì)量、危害患者生命安全[3-5]。有關(guān)研究表明，microRNAs和蛋白因子對癌細(xì)胞癌具有一定的治療作用，microRNAs具有調(diào)控基因水平的能力，機體內(nèi)有近半數(shù)的基因受microRNAs調(diào)控，且其還貫穿腫瘤產(chǎn)生及發(fā)展的全過程，并可影響癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。miR-193a-3p是microRNAs的一種，為抑癌基因，且已有研究證實其在食管癌等多種腫瘤中為低表達(dá)[6-7]。富亮氨酸α2糖蛋白1（LRG-1）屬于富亮氨酸重復(fù)蛋白（LRR）類，有關(guān)研究表明，LRG-1在舌癌等多種癌癥中均呈高表達(dá)，且其對癌細(xì)胞的生物學(xué)行為具有一定調(diào)控作用[8]。鞘氨醇激酶1（SPHK1）具有維持鞘脂代謝平衡的作用，對腫瘤的生物學(xué)行為也具有一定的影響[9]。因此本研究擬轉(zhuǎn)染miR-193a-3p模擬物通過LRG-1/SPHK1信號通路介導(dǎo)對口腔鱗狀細(xì)胞癌的作用，并探討機制。

1 材料和方法

1.1 一般資料

人口腔鱗癌細(xì)胞HN4來自上海澤葉生物公司，于實驗室保存。選取本院2018年1月～2020年1月20例口腔鱗癌患者的癌組織（已確診）與癌旁組織標(biāo)本進(jìn)行研究，分為口腔鱗癌組與癌旁組，每組10例，男女各半，年齡（49.37±5.22）歲，所有病例術(shù)前均未進(jìn)行放療、化療以及其他輔助治療?；颊弑救送鈪⒓颖敬螌嶒?。

1.2 實驗試劑

胰蛋白酶（河南瑞仁公司）；鏈霉素（武漢羅森杰公司）；CCK8溶液（青島達(dá)斐公司）；酶標(biāo)儀（山東霍爾德公司）；基質(zhì)膠（杭州仟諾公司）；酶聯(lián)免疫試劑盒（上海勁馬公司）；青霉素（湖南泰仁公司）。

1.3 細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

將HN4細(xì)胞用含1×105U/L青霉素、0.1 g/L鏈霉素、5 μmol/L PTX 培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞融合至80%～90%時胰蛋白酶消化，離心1 250 r/min，共5 min，重懸，傳代，取第4代細(xì)胞進(jìn)行實驗。

在6孔板中接種即將要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，待細(xì)胞長至65%融合時，采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染50 nmol/L相應(yīng)的microRNA mimics以及陰性對照miR-193a-3p-NC，繼續(xù)培養(yǎng)3 d。實驗分為3組，鱗癌組（口腔鱗癌細(xì)胞）、轉(zhuǎn)染NC組、轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染miR-193a-3p）。

1.4 PT-PCR檢測miR-193a-3p水平

取各組細(xì)胞及組織，胰酶消化后提取細(xì)胞懸液，沖洗。提取總 RNA，Primer 5.0 合成引物。 PCR反應(yīng)條件：95℃10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，以U6為內(nèi)參，共40個循環(huán)。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 CCK8檢測細(xì)胞增殖能力

于96孔板中接種各組細(xì)胞，常規(guī)孵育，待細(xì)胞生長至60 %時，加入10 μL CCK-8 溶液，后常規(guī)孵育2 h，在細(xì)胞孵育 0、24、48 h 和 72 h 時，酶標(biāo)儀測量 450 nm處每個孔的 OD 值。

1.6 Transwell小室檢測侵襲能力

將各組細(xì)胞接種于6孔板中，將50 mg/L的基質(zhì)膠稀釋后加入小室上層，37℃下呈凝膠狀態(tài)，上室加細(xì)胞懸液，下室加胎牛血清培養(yǎng)基，37.5℃，培養(yǎng)2 d，取出培養(yǎng)基，拭去殘留細(xì)胞，現(xiàn)配結(jié)晶紫，每孔500 μL，將小室放入，25℃染色30 min，PBS清洗，稍晾干。顯微鏡觀察，每個樣本連續(xù)選5個清晰視野進(jìn)行數(shù)量統(tǒng)計，然后計算平均數(shù)。

1.7 ELISA檢測各組p53、caspase-3、Bcl-2和survivin水平

取各組細(xì)胞，胰蛋白酶消化，離心5 min，1 250 r/min，重懸，取細(xì)胞懸液，采用ELISA法檢測人體抑癌基因（p53）、半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、生存素（survivin）水平。

1.8 免疫印跡檢測SPHK1、LRG-1、caspase-3、p53、survivin和Bcl-2水平

取各組細(xì)胞，裂解液裂解并提取蛋白，并對蛋白的濃度進(jìn)行測量，分裝后，保存在-20℃的環(huán)境中。將提取出的蛋白溶液和緩沖溶液進(jìn)行混勻，然后將其煮沸、變性、電泳，后移至PVDF膜上，加脫脂奶粉封閉1 h。加入（抗SPHK1、LRG-1）一抗，漂洗3次，每次隔10 min，加入二抗對溶液稀釋，常溫封閉1 h。取出PVDF膜，漂洗，DAB顯色后照相。增加敲除LRG-1、轉(zhuǎn)染SPHK1抑制劑、轉(zhuǎn)染miR-193a-3p+敲除LRG-1、轉(zhuǎn)染miR-193a-3p+SPHK1抑制劑進(jìn)行對照，敲除及轉(zhuǎn)染方法根據(jù)Takemoto[10]、楊永臻[11]實驗方法進(jìn)行，轉(zhuǎn)染miR-193a-3p+敲除LRG-1、轉(zhuǎn)染miR-193a-3p+轉(zhuǎn)染SPHK1抑制劑方法為在轉(zhuǎn)染miR-193a-3p的基礎(chǔ)上進(jìn)行敲除LRG-1、轉(zhuǎn)染SPHK1抑制劑。敲除LRG-1分為未敲除LRG-1組、陰性對照組、敲除LRG-1組。轉(zhuǎn)染SPHK1抑制劑分為未轉(zhuǎn)染組、NC組、轉(zhuǎn)染SPHK1組。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，鱗癌組、轉(zhuǎn)染NC組、轉(zhuǎn)染組口腔鱗癌細(xì)胞增殖、侵襲及LRG-1、SPHK1水平等比較采用單因素方差分析，計量資料采用±s，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-193a-3p在組織及細(xì)胞中的水平

口腔鱗癌組中miR-193a-3p水平低于癌旁組織，組間比較差異顯著（P＜0.05）（圖1A）。

鱗癌組miR-193a-3p水平與轉(zhuǎn)染NC組較為接近，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；轉(zhuǎn)染組miR-193a-3p水平高于鱗癌組、轉(zhuǎn)染NC組，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明miR-193a-3p抑制劑轉(zhuǎn)染成功（圖1B）。

圖1 miR-193a-3p在口腔癌組織（A）和口腔癌細(xì)胞（B）中的水平

2.2 細(xì)胞增殖能力

轉(zhuǎn)染組在0 h時的OD值均較為接近（P＞0.05）；鱗癌組與轉(zhuǎn)染NC組在不同時間點的OD值均較為接近（P＞0.05）；轉(zhuǎn)染組在24、48、72 h時的OD值低于鱗癌組、轉(zhuǎn)染NC組（P＜0.05）（表2和圖2）。

表2 各組在不同時間點的增殖情況（±s）

表2 各組在不同時間點的增殖情況（±s）

*P＜0.05 vs鱗癌 組；#P＜0.05 vs 轉(zhuǎn)染NC組

組別0 h24 h48 h72 h鱗癌組0.26±0.040.71±0.060.92±0.071.12±0.11轉(zhuǎn)染NC組0.24±0.030.68±0.040.89±0.081.03±0.09轉(zhuǎn)染組0.23±0.020.39±0.03*#0.61±0.05*#0.73±0.06*#P 0.27＜0.001＜0.001＜0.001

圖2 各組癌細(xì)胞在不同時間的增殖比較

2.3 侵襲能力檢測

鱗癌組癌細(xì)胞侵襲數(shù)量為（282.74±26.77）個，與轉(zhuǎn)染NC組侵襲數(shù)量（276.59±27.33）個較為接近，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；轉(zhuǎn)染組癌細(xì)胞侵襲數(shù)量為（152.11±14.33）個，較鱗癌組與轉(zhuǎn)染NC組明顯降低，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

圖3 各組細(xì)胞侵襲能力對比，×400

2.4 各組caspase-3、p53、survivin和Bcl-2水平

鱗癌組與轉(zhuǎn)染NC組caspase-3、p53、survivin、Bcl-2水平均較為接近，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），與鱗癌組、轉(zhuǎn)染NC組相比，轉(zhuǎn)染組caspase-3、p53水平有所升高，survivin、Bcl-2水平有所下降，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。

表3 各組蛋白水平對比（±s，ng/mL）

表3 各組蛋白水平對比（±s，ng/mL）

*P＜0.05 vs 鱗癌組；#P＜0.05 vs 轉(zhuǎn)染NC組

組別Caspase-3p53SurvivinBcl-2鱗癌組19.23±1.24 8.21±1.2218.26±1.7425.68±2.34轉(zhuǎn)染NC組20.11±1.04 9.13±0.8917.65±1.1324.11±2.55轉(zhuǎn)染組35.26±3.17*#17.25±1.07*# 9.31±0.45*#10.32±1.04*#P＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.5 SPHK1、LRG-1、caspase-3、p53、survivin和Bcl-2水平

鱗癌組與轉(zhuǎn)染NC組SPHK1、LRG-1、caspase-3、p53、survivin和Bcl-2水平相比無顯著差異（P＞0.05）。與鱗癌組相比，轉(zhuǎn)染組、敲除LRG-1組、轉(zhuǎn)染SPHK1組LRG-1、SPHK1、survivin、Bcl-2水平降低，caspase-3、p53水平升高（P＜0.05），轉(zhuǎn)染組、敲除LRG-1組和轉(zhuǎn)染SPHK1組上述各指標(biāo)水平對比無顯著差異（P＞0.05）（圖4，表4）。

圖4 SPHK1、LRG-1、caspase-3、p53、survivin和Bcl-2水平在各組中的對比

表4 SPHK1、LRG-1、caspase-3、p53、survivin和Bcl-2水平在各組中的對比（±s）

表4 SPHK1、LRG-1、caspase-3、p53、survivin和Bcl-2水平在各組中的對比（±s）

注：*P＜0.05 vs鱗癌組；#P＜0.05 vs轉(zhuǎn)染NC組

分組LRG-1SPHK1Caspase-3p53SurvivinBcl-2鱗癌組1.01±0.011.02±0.011.05±0.041.03±0.052.14±0.282.35±0.34轉(zhuǎn)染NC組0.94±0.020.91±0.041.01±0.060.98±0.082.11±0.342.32±0.35轉(zhuǎn)染組0.24±0.03*#0.37±0.02*#2.64±0.27*#2.58±0.26*#1.25±0.18*#1.28±0.14*#敲除LRG-1組0.26±0.02*#0.40±0.03*#2.61±0.32*#2.56±0.30*#1.21±0.23*#1.25±0.18*#轉(zhuǎn)染SPHK1組0.27±0.02*#0.39±0.03*#2.67±0.24*#2.53±0.34*#1.18±0.34*#1.23±0.21*#P＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

3 討論

近年來口腔鱗癌的發(fā)病率逐年增長，每年新增病例近30萬人[12]。口腔鱗癌對于患者的生命威脅不大，但其轉(zhuǎn)移能力較強，會浸潤肺部等組織，危及生命安全，因此，對于口腔鱗癌的治療至關(guān)重要。有研究表明，miR-193a-3p具有一定的抑癌作用，因此本文研究miR-193a-3p通過LRG-1/SPHK1信號通路介導(dǎo)對口腔鱗狀細(xì)胞癌的作用及相關(guān)機制。

癌細(xì)胞侵襲主要是指癌細(xì)胞通過不同方式破壞周圍正常組織并分散至其中。腫瘤的侵襲是其發(fā)生各種部位遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的前提條件。miRNAs是重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，參與各種生理和病理過程，包括細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生發(fā)展過程。miR-193a-3p是miRNA家族成員之一，是一種抑癌基因[13]。本研究根據(jù)PCR檢測結(jié)果提示，口腔鱗癌中miR-193a-3p的水平較癌旁組織低，經(jīng)過轉(zhuǎn)染其模擬物后，癌細(xì)胞的增殖及侵襲受到抑制，這一結(jié)果可以表明其是抑癌基因的一種，對口腔鱗癌具有一定的抑制作用。有關(guān)研究表明，miR-193a-3p在食管鱗癌、卵巢癌中為低表達(dá)，且王培蓓等[14]對喉癌細(xì)胞的研究中，運用RT-PCR檢測顯示miR-193a-3p在癌細(xì)胞中為低表達(dá)，在經(jīng)過轉(zhuǎn)染其模擬物后，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的miR-193a-3p可抑制癌細(xì)胞的增殖及侵襲。本研究經(jīng)過轉(zhuǎn)染miR-193a-3p后，口腔鱗癌細(xì)胞的增殖及侵襲同樣受到抑制。

腫瘤的產(chǎn)生及發(fā)展是多基因間復(fù)雜作用的過程。LRG-1是富亮氨酸重復(fù)序列中的一員，對腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活性具有一定的調(diào)控作用，有研究表明，LRG-1在卵巢癌、胰腺癌中為高表達(dá)[15]。劉欣[16]等運用免疫組織化學(xué)檢測喉癌LRG-1陽性表達(dá)率高達(dá)86%，經(jīng)過治療后陽性表達(dá)下降。SPHK1是一種脂質(zhì)激酶，是參與鞘脂代謝平衡的關(guān)鍵限速酶，并參與細(xì)胞的增殖、分化以及遷移，在乳腺癌、肝癌等癌癥中均存在高表達(dá)[17-18]。舌癌是口腔鱗癌中常出現(xiàn)的一種癌，有關(guān)研究表明，SPHK1在舌癌中通過抑制表皮生長因子在腫瘤的浸潤以及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。高路[19]基于大鼠口腔鱗癌模型的研究表明，LRG-1、SPHK1呈正相關(guān)關(guān)系。本研究運用免疫印跡檢測SPHK1、LRG-1水平，結(jié)果顯示SPHK1、LRG-1水平在癌細(xì)胞中均呈現(xiàn)高表達(dá)，轉(zhuǎn)染miR-193a-3p后SPHK1、LRG-1水平與敲除LRG-1及轉(zhuǎn)染SPHK1抑制劑后水平較為接近，表明轉(zhuǎn)染miR-193a-3p可降低SPHK1、LRG-1蛋白水平，在經(jīng)過轉(zhuǎn)染miR-193a-3p+敲除LRG-1、轉(zhuǎn)染miR-193a-3p+轉(zhuǎn)染SPHK1干預(yù)后效果更好。提示轉(zhuǎn)染miR-193a-3p后可能通過抑制SPHK1、LRG-1，從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲及增殖。

Caspase 是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志蛋白[20]；p53是一種促凋亡基因[21]；Bcl-2、survivin是抗凋亡分子，Bcl-2能夠拈抗線粒體途徑凋亡，survivin則能夠拮抗多種 caspase分子的促凋亡作用[22-23]。miRNAs在轉(zhuǎn)錄后具有調(diào)控細(xì)胞因子水平，異常的miRNAs表達(dá)可能會影響大量細(xì)胞因子的水平。miRNAs的表達(dá)在組織特異性中受到高度調(diào)控，可通過參與不同的途徑，對細(xì)胞生存、生長和增殖產(chǎn)生不同的作用。Liu等[24]對肺癌的研究中提出，miR-193a-3p通過提高p53的水平促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡。潘新平等[25]對胃癌的研究中表明，miR-193a-3p可通過提高caspase-3的水平促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。本實驗結(jié)果顯示，在癌細(xì)胞中caspase-3、p53水平較低，survivin、Bcl-2水平較高，在經(jīng)過轉(zhuǎn)染miR-193a-3p后caspase-3、p53水平升高、survivin、Bcl-2水平降低。提示，轉(zhuǎn)染miR-193a-3p后可能通過調(diào)控Bcl-2、survivin、caspase-3、p53水平，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，從而延緩口腔鱗癌的發(fā)展。

綜上所述，本文運用過表達(dá)的miR-193a-3p，通過降低SPHK1、LRG-1的水平，抑制口腔鱗癌細(xì)胞的增殖及侵襲。