富馬酸替諾福韋二吡呋酯聯(lián)合聚乙二醇化干擾素對肝硬化大鼠肝細(xì)胞凋亡、免疫功能及內(nèi)毒素水平的影響*

閃海霞 盧瑞杰 顏成果 王 英 和青森 范崇桂

（南陽市中心醫(yī)院感染性疾病科，南陽 473000）

在國內(nèi)，肝硬化以乙型肝炎病毒為主[1]。該病早期無特異性特征，不易發(fā)現(xiàn)，一經(jīng)確診，多數(shù)已為晚期，治療難度大，并伴有多種并發(fā)癥產(chǎn)生[2-3]。肝硬化產(chǎn)生后會(huì)使腸道內(nèi)的細(xì)菌過度生長，導(dǎo)致內(nèi)毒素增加，加之腸黏膜機(jī)械屏障、免疫及生物屏障等功能破壞，內(nèi)毒素吸收增多，肝對內(nèi)毒素清除能力下降，從而加劇肝損傷[4]。因此改善腸黏膜損傷對阻止肝硬化發(fā)展具有一定的作用。目前，干擾素被廣泛應(yīng)用于慢性乙肝的治療中，且效果較為顯著，它具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)的雙重作用，但其療效有限，眾多學(xué)者認(rèn)為多種有效的抗病毒藥的有效組合，是治療慢性乙型肝炎的重要方案[5]。富馬酸替諾福韋二吡呋酯（tenofovir disoproxil fumarate，TDF）是抗病毒藥物的一種，常用于治療慢性乙肝病毒[6]。因此采用TDF聯(lián)合聚乙二醇化α干擾素-2b（PEGIFNα-2b）對肝硬化（代償期）大鼠肝細(xì)胞凋亡、免疫功能及內(nèi)毒素水平的影響進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SPF級健康SD大鼠55只，體質(zhì)量220～300 g，由長沙天勤公司提供[生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）-2019-0001]，常規(guī)飼養(yǎng)，自由取食、水。隨機(jī)分為對照組（健康大鼠常規(guī)飼養(yǎng)）、模型組（肝硬化模型組）、TDF治療組（肝硬化模型+TDF）、干擾素治療組（肝硬化模型+PEG-IFNα-2b）、聯(lián)合治療組（肝硬化模型+TDF+PEG-IFNα-2b），每組11只。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

TDF（成都倍特公司）；PEG-IFNα-2b（廈門特寶生物工程股份有限公司）；核苷酸混合緩沖液（珠海泛海公司）；無熱源肝素鈉抗凝真空采血管（蘇州靈巖公司）；流式細(xì)胞儀（常州必達(dá)公司）；枸櫞酸修復(fù)液（南京巴傲得公司）；烏拉坦（武漢夢奇公司）。

1.3 模型建立及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

采用四氯化碳復(fù)合因素方法制造肝硬化模型[7]，造模持續(xù)8周時(shí)間。建模成功次日對照組與模型組大鼠無處理，TDF治療組大鼠給予27 mg·kg-1·d-1TDF灌胃；干擾素治療組大鼠給予PEGIFNα-2b皮下注射16.2 μg/kg；聯(lián)合治療組大鼠給予PEG-IFNα-2b皮下注射16.2 μg/kg及27 mg·kg-1·d-1TDF灌胃，各藥物干預(yù)組連續(xù)治療12周，每周1次。

1.4 組織提取

各組于取材前12 h禁食水，末次給藥后脫頸處死大鼠，于腹主動(dòng)脈采集血液，后注入大量生理鹽水灌流，剝離肝，取大鼠距回盲部15～20 cm處回腸組織，剔除周圍多余組織，將肝組織與腸組織置于多聚甲醛液中固定備用。

1.5 鯊試劑顯色基質(zhì)法檢測各組大鼠血清內(nèi)毒素水平

各組大鼠用烏拉坦（25 %）麻醉后，用無熱源肝素鈉抗凝真空采血管取大鼠腹主動(dòng)脈血2 mL，離心10 min（3 000 r/min），取上層血漿，鯊試劑顯色基質(zhì)法檢測內(nèi)毒素水平，實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.6 H-E染色檢測各組大鼠肝及腸組織病理形態(tài)

取各組大鼠肝組織及腸組織各50 mg，4%多聚甲醛溶液固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，常規(guī)切片，厚度為4 μm，后進(jìn)行H-E染色。顯微鏡下觀察病理形態(tài)。

1.7 脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)缺口末端標(biāo)記法檢測各組大鼠肝細(xì)胞凋亡

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%雙氧水甲醇中浸泡10 min，PBS沖洗5 min×3次；蛋白酶K（15 μg/mL）37℃溫箱中孵育7 min；20%胎牛血清室溫下封閉20 min；用濾紙吸去殘留液后滴加反應(yīng)液50 μL（TdT3 μL，熒光素連接的核苷酸混合緩沖液47 μL，陰性對照片不加TdT），37℃溫箱中孵育45 min，PBS沖洗5 min×3；20%山羊血清室溫下封閉20 min，加POD轉(zhuǎn)換劑（原液1∶2稀釋），置于37℃溫箱中孵育30 min，顯微鏡下DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。陽性部位在細(xì)胞核，顯棕黃色或棕褐色。計(jì)數(shù)5個(gè)高倍鏡視野下100個(gè)肝細(xì)胞核中陽性細(xì)胞的個(gè)數(shù)，取其均值為肝細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組大鼠肝組織免疫功能指標(biāo)CD3+、CD4+、CD8+ T淋巴細(xì)胞數(shù)

取大鼠肝組織50 mg，剪碎，PBS清洗后收集清洗液80目篩網(wǎng)過濾，再用PBS洗滌離心重懸，接種于培養(yǎng)皿中，收集細(xì)胞，傳代培養(yǎng)，將各組第3代肝細(xì)胞接種于5孔板中，48 h后收集細(xì)胞，PBS清洗，加入10%山羊血清4℃無光孵育0.5 h，PBS清洗，加入CD3、CD4、CD8抗體（1∶100），遮光孵育15 min，緩沖液洗滌。重懸后，檢測指標(biāo)表達(dá)。

1.9 免疫組織化學(xué)檢測各組大鼠肝組織Bax、Bcl-2蛋白水平

取各組大鼠肝組織于10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋，4 μm厚切片。切片，常規(guī)脫蠟至水，甲醇浸泡10 min。枸櫞酸修復(fù)液微波爐中高火修復(fù)至冒泡后再低火修復(fù)20 min，冷卻至室溫，加Bax、Bc1-2一抗，置于4℃冰箱過夜。次日PBS沖洗5 min×3次，滴加二抗（兩步法），37℃孵育30 min，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)陽性部位在細(xì)胞質(zhì)，顯棕黃色。每張標(biāo)本切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野區(qū)域，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽性表達(dá)率。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血漿內(nèi)毒素水平檢測

對照組大鼠內(nèi)毒素水平低于模型組（P＜0.05），模型組內(nèi)毒素水平高于TDF治療組與干擾素治療組（P＜0.05）。TDF治療組與干擾素治療組內(nèi)毒素水平比較無差異（P＞0.05），聯(lián)合治療組內(nèi)毒素水平低于干擾素治療組及TDF治療組（P＜0.05）（圖1）。

圖1 各組大鼠內(nèi)毒素水平對比

2.2 各組大鼠肝組織形態(tài)

H-E染色結(jié)果顯示，對照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整（圖2A）。模型組大鼠肝細(xì)胞排列紊亂并發(fā)生壞死，有明顯炎癥細(xì)胞浸潤（圖2B）。與模型組肝組織病變相比，TDF治療組（圖2C）、干擾素治療組（圖2D）與聯(lián)合治療組（圖2E）肝組織結(jié)構(gòu)較為完整，肝細(xì)胞壞死減少，匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤也較模型組減輕，且以聯(lián)合治療組效果較為顯著（圖2，見封三）。

圖2 各組大鼠肝組織形態(tài)對比，×200。A：對照組；B：模型組；C：TDF治療組；D：干擾素治療組；E：聯(lián)合治療組.

對照組大鼠回腸上皮結(jié)構(gòu)完整（圖3A）；模型組大鼠回腸黏膜上皮細(xì)胞壞死，大量絨毛脫落，上皮下囊狀間隙擴(kuò)大，中央乳糜管擴(kuò)張，固有層裸露，并伴有毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血（圖3B）；TDF治療組（圖3C）與干擾素治療組（圖3D）大鼠回腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)較完整，少數(shù)絨毛頂端脫落，上皮下囊狀間隙較模型組有所改善，固有層仍見水腫。聯(lián)合治療組（圖3E）大鼠回腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)較完整，絨毛頂端上皮下可見囊狀間隙，并伴有毛細(xì)血管充血（圖3，見封三）。

圖3 各組大鼠腸組織形態(tài)對比，×200。。A：對照組；B：模型組；C：TDF治療組；D：干擾素治療組；E：聯(lián)合治療組.

2.3 各組大鼠肝細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

對照組大鼠肝細(xì)胞AI值低于模型組（P＜0.05），模型組AI值高于TDF治療組（P＜0.05）。TDF治療組與干擾素治療組AI值比較無差異（P＞0.05），聯(lián)合治療組大鼠肝細(xì)胞AI值低于TDF治療組、干擾素治療組（P＜0.05）（圖4，見封三）。

圖4 各組大鼠肝細(xì)胞AI指數(shù)對比

2.4 各組大鼠免疫功能指標(biāo)

與對照組相比，模型組大鼠肝組織中CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)、CD4+/CD8+降低，CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)升高（P＜0.05）；與模型組相比，TDF治療組、干擾素治療組CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)、CD4+/CD8+升高，CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)降低（P＜0.05）；TDF治療組與干擾素治療組大鼠免疫功能水平比較無差異（P＞0.05）；與干擾素治療組及TDF治療組相比，聯(lián)合治療組CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)、CD4+/CD8+升高，CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)降低（P＜0.05）（表1）。

表1 各組大鼠免疫功能指標(biāo)對比（n=11， ±s）

表1 各組大鼠免疫功能指標(biāo)對比（n=11， ±s）

*P＜0.05 vs 對照組；#P＜0.05 vs模型組；△P＜0.05 vs TDF治療組；￡P(guān)＜0.05 vs干擾素治療組

組別CD3+ T淋巴細(xì)胞百分率（%）CD4+ T淋巴細(xì)胞百分率（%）CD8+ T淋巴細(xì)胞百分率（%）CD4+/CD8+對照組78.62±8.4158.31±5.9221.35±1.872.14±0.27模型組59.26±4.37*33.21±2.47*37.52±3.68*0.73±0.06*TDF治療組65.24±6.06*#39.45±4.06*#30.41±3.12*#1.25±0.08*#干擾素治療組66.37±5.18*#38.74±4.42*#29.68±3.54*#1.24±0.05*#聯(lián)合治療組70.45±6.72*#△￡46.28±5.59*#△￡26.41±2.79*#△￡1.84±0.11*#△￡

2.5 各組大鼠肝組織Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)比較

與對照組相比，模型組Bax蛋白升高、Bcl-2蛋白降低（P＜0.05）。與模型組相比，TDF治療組與干擾素治療組Bax蛋白降低、Bcl-2蛋白升高（P＜0.05）。TDF治療組與干擾素治療組指標(biāo)水平無差異（P＞0.05）。與干擾素治療組相比，聯(lián)合治療組TDF治療組與干擾素治療組Bax降低、Bcl-2升高（P＜0.05）（圖5，見封三，表2）。

圖5 各組大鼠Bax（A1～E1）、Bcl-2（A2～E2）水平對比。A：對照組；B：模型組；C：TDF治療組；D：干擾素治療組；E：聯(lián)合治療組.

表2 各組大鼠Bax、Bcl-2水平對比（n=11， ±s， %）

表2 各組大鼠Bax、Bcl-2水平對比（n=11， ±s， %）

*P＜0.05 vs 對照組；#P＜0.05 vs模型組；△P＜0.05 vs TDF治療組；￡P(guān)＜0.05 vs干擾素治療組

組別BaxBcl-2對照組31.42±3.1538.46±2.87模型組87.65±7.41*32.15±2.19*TDF治療組57.81±6.40*#48.43±4.12*#干擾素治療組56.94±5.15*#49.38±3.74*#聯(lián)合治療組45.71±3.94*#△￡57.26±4.85*#△￡

3 討論

在中國[8]，肝硬化是消化系統(tǒng)的常見病，年發(fā)病率為17/10萬，且多見于20～50歲的男性患者中，其中城市男性50～60歲的患病者的病死率高達(dá)112/10萬。我國的肝硬化患者多為乙肝病毒感染所致，對于肝硬化的治療仍至關(guān)重要。因此，本研究運(yùn)用TDF聯(lián)合PEG-IFNα-2b治療肝硬化大鼠，并檢測其對肝細(xì)胞凋亡、免疫功能及內(nèi)毒素水平的影響。肝受到損傷因素影響后，原本存在于體內(nèi)的肝細(xì)胞死亡程序可能被激活，進(jìn)而引起肝細(xì)胞的程序性死亡（凋亡）。Bcl-2家族是目前研究較多的凋亡相關(guān)基因，Bax是該家族中促凋亡因子，常出現(xiàn)在肝細(xì)胞、血管平滑肌中。Bcl-2是抑凋亡因子，主要分布在細(xì)胞膜內(nèi)表面、線粒體外膜等[9]。目前對于肝臟疾病的治療，給予抗病毒持續(xù)治療可阻止慢性肝病的發(fā)展，TDF是目前應(yīng)用于慢性肝炎等疾病中較為廣泛的抗病毒類藥物，臨床上已有多位研究者證實(shí)其通過改善患者肝功能水平，治療乙型肝炎患者的病情嚴(yán)重程度。近年來干擾素對于肝硬化（代償期）的治療逐漸興起，有研究表明[10]，干擾素能夠抑制成纖維細(xì)胞的增殖，降低轉(zhuǎn)化生長因子β及I和Ⅲ型前膠原mRNA的表達(dá)，減少膠原的合成，從而具有抗纖維化作用，并已成功應(yīng)用于肝纖維化等的治療。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，在經(jīng)過TDF、PEG-IFNα-2b干預(yù)后，肝細(xì)胞凋亡及Bax降低、Bcl-2升高，且以兩者聯(lián)合治療的效果更為顯著。在劉浩等[11]對肝硬化大鼠的實(shí)驗(yàn)中提出，通過降低Bax、升高Bcl-2水平，減少肝細(xì)胞的凋亡，從而保護(hù)大鼠肝。Bcl-xl是Bcl-2家族成員之一，在夏六兵等[12]對腎癌細(xì)胞的研究中提出，PEG-IFNα-2b通過降低Bcl-xl，抑制環(huán)氧化酶-2的水平，加快腎癌細(xì)胞凋亡、抑制其增殖，減少腫瘤血管新生，改善病情嚴(yán)重程度。本研究與上述研究結(jié)果相似，因此筆者推測，聯(lián)合治療組效果更佳是由于聯(lián)合了TDF所致，兩者聯(lián)合通過促進(jìn)Bcl-2水平，抑制Bax表達(dá)，減少肝細(xì)胞凋亡。

機(jī)體在遭受手術(shù)或創(chuàng)傷后，會(huì)發(fā)生全身性的應(yīng)激反應(yīng)，這種應(yīng)激反應(yīng)除使機(jī)體蛋白質(zhì)分解加速，產(chǎn)生負(fù)氮平衡外，還將造成機(jī)體的免疫抑制。機(jī)體免疫功能主要由T、B淋巴細(xì)胞控制，T細(xì)胞包括CD3+、CD4+、CD8+亞群，T淋巴細(xì)胞亞群在肝細(xì)胞損害，機(jī)體抗腫瘤免疫中起重要作用，為活躍的免疫活性細(xì)胞之一，不僅是細(xì)胞免疫的效應(yīng)細(xì)胞，還有調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫的作用[13]。免疫抑制表現(xiàn)為外周血中CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)減少，這2個(gè)亞群均參與機(jī)體特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，抑制淋巴細(xì)胞亞群CD8+增多，CD4+/CD8+比例降低[14]。CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)是機(jī)體發(fā)揮免疫抑制的關(guān)鍵，CD4+/CD8+是可客觀體現(xiàn)肝癌術(shù)后患者免疫抑制程度的高低。PEG-IFNα-2b是重要的免疫調(diào)節(jié)劑，能夠誘導(dǎo)Thl型細(xì)胞因子反應(yīng)。它可以促進(jìn)T細(xì)胞分泌Thl型細(xì)胞因子干擾素，并抑制其分泌白細(xì)胞介素5等Th2型細(xì)胞因子。已有研究證實(shí)[15]，TDF聯(lián)合PEGIFNα-2b通過改善肝功能，提高機(jī)體免疫水平，對乙型肝炎起到治療的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，在經(jīng)過TDF、PEG-IFNα-2b干預(yù)后，CD4+/CD8+水平升高，CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)水平降低。金國賢等[16]在運(yùn)用中藥治療肝硬化肝癌大鼠的實(shí)驗(yàn)中提出，通過降低CD8+水平并提高CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)、CD4+/CD8+水平后，改善了大鼠的免疫功能。馬忠玉等[17]報(bào)道，PEG-IFNα-2b可有效抑制病毒復(fù)制，通過促進(jìn)機(jī)體的免疫功能恢復(fù)，提高患兒的臨床痊愈率。吳文豪等[18]對慢性乙型肝炎的研究中提出，中藥聯(lián)合TDF可有效改善腎功能，并通過降低CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)提高CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)、CD4+/CD8+水平，提高機(jī)體免疫能力，預(yù)防肝纖維化。本研究與上述研究結(jié)果相似。

肝硬化時(shí)，患者腸道菌群紊亂，革蘭陰性菌過度增殖，內(nèi)毒素產(chǎn)生增多，通過受損黏膜進(jìn)入體循環(huán)，形成內(nèi)毒素血癥。一方面，過表達(dá)的內(nèi)毒素會(huì)損傷腸道黏膜，致使腸道菌群失衡，加重肝硬化損傷，另一方面，腸道過量的內(nèi)毒素直接進(jìn)入血液，可誘導(dǎo)一些炎癥細(xì)胞因子的分泌，加劇對肝的損傷，對肝形成“二次打擊”，進(jìn)而加速了肝纖維化的發(fā)展。小腸黏膜的病理改變能夠反應(yīng)肝硬化內(nèi)毒素血癥的嚴(yán)重程度。因此調(diào)節(jié)肝硬化腸道微生態(tài)，將有助于改善肝硬化的進(jìn)展和預(yù)后。付青青等[19]研究表明，去乳糖飲食聯(lián)合重組人干擾素α1b可有效提高臨床治療效果，通過降低內(nèi)毒素水平，減少腸粘膜損傷。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，在經(jīng)過TDF、PEG-IFNα-2b干預(yù)后，內(nèi)毒素水平降低?？苡冷h等[20]在肝硬化大鼠的研究顯示，香胃聯(lián)合方組通過改善腸黏膜損傷，降低內(nèi)毒素水平，改善肝硬化嚴(yán)重程度。唐光群等[21]報(bào)道，聚乙二醇化干擾素可保護(hù)患兒的心肌功能，通過降低內(nèi)毒素以及二胺氧化酶等水平，改善患兒腸粘膜損傷狀態(tài)。本文研究與上述研究結(jié)果相似。對于TDF與內(nèi)毒素或腸黏膜的關(guān)系，目前尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，因此推測，聯(lián)合治療組效果更佳可能是PEG-IFNα-2b聯(lián)合TDF通過改善腸黏膜損傷，降低內(nèi)毒素水平，緩解肝硬化病情嚴(yán)重程度所致。本研究H-E染色結(jié)果也可證實(shí)上述結(jié)論。

綜上所述，TDF聯(lián)合PEG-IFNα-2b通過提高免疫功能、降低內(nèi)毒素水平以及減少肝細(xì)胞凋亡，改善肝硬化病情程度。