側腦室注射microRNA-200c經(jīng)PI3K/Akt/mTOR通路保護腦缺血再灌注損傷大鼠的機制*

黎玉環(huán) 熊光潤 鄭永強 李 敏

（宜昌市第二人民醫(yī)院神經(jīng)內科，宜昌 443000）

腦卒中是由于血管堵塞或破裂導致大腦供血不足引起腦損傷的一種急性腦血管疾病[1]，包括缺血性和出血性兩大類，其中缺血性腦卒中占80%以上[2]。缺血性腦卒中是一個復雜的生理病理過程，線粒體損傷、興奮性氨基酸毒性、氧化應激、炎癥反應等均會導致腦缺血損傷[3]?，F(xiàn)階段治療急性腦出血的主要手段是在合適時間窗內溶栓，但此方案可能會進一步加重腦缺血所致的炎癥及谷氨酸興奮毒性，導致腦缺血再灌注損傷[4]。近十幾年來，隨著對缺血性腦損傷的不斷探索，學者們發(fā)現(xiàn)，多種分子與缺血再灌注損傷過程中的炎癥反應和神經(jīng)元細胞凋亡有關[5]。磷酯酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是細胞內經(jīng)典的促炎、促腫瘤通路，被先前的研究發(fā)現(xiàn)可通過調控氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡等生理過程參與不同的神經(jīng)保護機制[6]。MicroRNA-200c（miR-200c）作為小非編碼RNA家族的一員，被證實與代謝性疾病以及惡性腫瘤疾病的進展有關[7]。李蓋天[8]的研究表明，過表達miR-200c可通過調控PI3K/Akt信號通路抑制胃癌上皮間質轉化過程，并影響胃癌細胞對阿霉素等藥物的抵抗性。然而，目前尚不清楚miR-200c調控PI3K/Akt/mTOR通路在腦缺血再灌注損傷過程中的作用機制。本研究探討側腦室注射miR-200c對腦缺血再灌注損傷大鼠腦保護作用，并研究其潛在調控機制，為腦缺血再灌注損傷提供更多治療靶點。

1 材料和方法

1.1 動物

40只雄性SD大鼠由武漢大學動物實驗室提供[動物許可證號：SYXK（鄂）2017-0065]，體質量220～260 g。所有大鼠均飼養(yǎng)于恒溫的飼養(yǎng)籠中，保持相對濕度為55%左右，給予充足的光照和經(jīng)紫外線消毒后的水源，適應性喂養(yǎng)1周。本次實驗經(jīng)本院動物保護委員會審查及批準。倫理編號：YC.20210114S0321510

1.2 模型制作及分組

40只大鼠隨機分為假手術組、模型組、miRNC組和miR-200c組，每組10只。除假手術組外，模型組、miR-NC和miR-200c組均采用線栓法構建腦缺血再灌注損傷模型，具體操作如下：首先用10%的水合氯醛以腹腔注射的方式將各組大鼠進行麻醉，由頸部正中切開皮膚，分離肌肉組織后暴露頸動脈，夾緊頸總動脈近心端和頸內動脈遠心端，中間剪斷將直徑為0.26 mm的魚線沿頸內動脈方向輕柔插入，當遇到阻力時停止，并在頸內動脈近心端結扎動脈，縫合切口，線頭留置約3 cm于體外。缺血2 h后拔出魚線約10 min以達到再灌注的目的。假手術組大鼠插線深度維持在10 mm以下，其他處理與上述一致。手術過程順利且出現(xiàn)大鼠死亡，當大鼠清醒后出現(xiàn)爬行追尾情況，提尾時左前肢內收屈曲視為模型制作成功，手術結束后，各組大鼠仍保持單籠常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3 側腦室注射載體

模型制作成功3 d后，假手術組大鼠不做任何處理，其余各組大鼠用10%水合氯醛以腹腔注射的方式將各組大鼠進行麻醉，將各組大鼠以俯臥位固定于腦立體定位儀上，切開頭皮，暴露頭骨，由前囪向右方及后方各平移3.5 mm，于顱骨處開孔后進針3.8 mm，模型組、miR-NC組和miR-200c組分別經(jīng)側腦室注射生理鹽水、miR-NC和miR-200c，劑量均為2 μL，注射速率為0.25 μL/min，注射完畢后停留約10 min后緩慢拔出注射器，以防外溢，封閉顱骨處開孔。消毒后縫合頭皮，小鼠清醒后仍保持單籠常規(guī)飼養(yǎng)。

1.4 神經(jīng)行為學評分

模型制作成功24 h后依據(jù)改良的Longa法[9]對各組大鼠神經(jīng)行為功能進行評分，總分為0～5分，得分越高，神經(jīng)功能缺陷越嚴重。0分：大鼠行為正常，不存在神經(jīng)功能缺陷；1分：大鼠右前爪無法完全伸展；2分：大鼠表現(xiàn)為向右單側轉圈；3分：大鼠表現(xiàn)為向右單側傾倒及翻轉；4分：大鼠不能行走或爬行，喪失意識；5分：大鼠死亡。

1.5 腦組織含水量

模型制作成功24 h處死小鼠，切除小腦、腦干，清洗后稱重大腦濕重，干燥后稱大腦干重，按照干濕重比值計算腦組織含水量。

1.6 腦梗死體積

模型制作成功24 h后取腦組織保存于-20℃冷凍30 min，采用2，3，5－三苯基氯化四氮唑染色法測定各組大鼠腦梗死體積，將冰凍過的腦組織制成厚度約為2 mm的冠狀片，采用2%的2，3，5－三苯基氯化四氮唑溶液（上海齊源生物科技有限公司；貨號：26-729）進行染色，福爾馬林固定后拍照，采用Image-Pro Plus 6.0軟件按照“腦梗死體積=（病灶體積/腦總體積）× 100%”計算各組大鼠的腦梗死體積。

1.7 熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測

取各組大鼠腦組織，眼科剪剪碎后組織液進行裂解，TRIzol提取腦組織內的總RNA，并將其逆轉錄成cDNA，GeneAmp PCR儀（美國ABI公司；型號：9700型）檢測各組大鼠腦組織中以U6作為標準化內參后miR-200c的相對mRNA表達水平，設置反應條件為：95℃ 10 min，95℃ 5 s，60℃ 20 s，共循環(huán)40次，95℃ 60 s、95℃ 30 s、95℃ 30 s解離。miR-200c上游引物：5'-CGTCTT ACCCAGCAGTGTTT-3'，下游引物：5'-ATACTGCC GGGTAATGATGGA-3'。

1.8 氧化應激反應檢測

采用分光光度法[10]測定大鼠腦組織中氧化應激指標超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSHPX）的水平。首先將各組大鼠腦組織從-20℃的冰箱內取出，低溫條件下以生理鹽水稀釋，混勻后3 000 r/min高速離心20 min，收集上清液。以黃嘌呤氧化酶法檢測上清液中SOD含量，硫代巴比妥酸法檢測上清液中MDA含量，化學比色法檢測上清液中GSH-PX含量，嚴格按照說明書要求操作。以上試劑盒均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

1.9 炎癥因子水平檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附法[11]測定大鼠腦組織中炎癥因子白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的水平。取1.8中收集的腦組織上清液，采用IL-6、IL-1β和TNF-α試劑盒分別檢測IL-6、IL-1β、TNF-α的含量，嚴格按照說明書要求操作。以上試劑盒均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

1.10 神經(jīng)細胞凋亡及PI3K/Akt/mTOR通路檢測

收集各組大鼠腦組織，在預冷的緩沖液中進行勻漿，高速離心后收集上清液。采用BCA法檢測蛋白濃度，裂解液充分裂解后將各組蛋白質濃度調整為等量，SDS-PAGE凝膠電泳后轉膜，與凋亡相關蛋白B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl2）、Bcl-2關聯(lián)X蛋白（recombinant Bcl2 associated X protein，Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteine aspartic protease-3，caspase 3）、PI3K、Akt和mTOR等一抗兔抗大鼠（1∶1 000，武漢三鷹生物技術有限公司）4℃孵育過夜，再與辣根過氧化物酶標記的二抗羊抗兔（1∶10 000，武漢三鷹生物技術有限公司）共同孵育1 h，采用GelDoc-2000 Imagine軟件進行化學發(fā)光檢測，以β-actin作為標準化內參對各組蛋白條帶進行定量。

1.11 統(tǒng)計學處理

本次實驗中采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料均以±s表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較以單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 神經(jīng)功能評分、腦含水量、腦梗死體積

與假手術組相比，其他3組神經(jīng)功能評分、腦含水量和腦梗死體積均顯著升高（P＜0.05），miR-200c組神經(jīng)功能評分、腦含水量和腦梗死體積顯著低于模型組和miR-NC組（P＜0.05）（表1）。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分、腦含水量、腦梗死體積差異（n=10，±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分、腦含水量、腦梗死體積差異（n=10，±s）

*P＜0.05 vs假手術組； #P＜0.05 vs模型組；△P＜0.05 vs miR-NC組

組別神經(jīng)功能評分（分）腦含水量（%）腦梗死體積（%）假手術組072.43±1.590模型組3.02±0.68*87.68±2.43*32.07±4.33*miR-NC組2.89±0.71*85.94±2.26*30.88±3.56*miR-200c組2.04±0.36*#△75.36±1.63*#△16.49±2.11*#△P＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 大鼠腦組織中miR-200c表達

與假手術組、模型組和miR-NC組相比，miR-200c組miR-200c表達顯著上調（P＜0.05）（圖1）。

圖1 各組大鼠腦組織內miR-200c表達

2.3 神經(jīng)細胞凋亡相關分子表達

與假手術組相比，其他3組Bax、caspase 3蛋白表達顯著上調，Bcl2蛋白表達顯著下調（P＜0.05）；miR-200c組Bax、caspase 3蛋白表達顯著低于模型組和miR-NC組，Bcl2蛋白表達顯著高于模型組和miR-NC組（P＜0.05）（圖2）。

圖2 各組大鼠神經(jīng)細胞凋亡相關分子表達差異

2.4 氧化應激反應

與假手術組相比，其他3組SOD和GSH-PX含量顯著降低，MDA含量顯著升高（P＜0.05）；miR-200c組SOD和GSH-PX含量較模型組和miR-NC組顯著升高，MDA含量顯著降低（P＜0.05）（表2）。

表2 各組大鼠氧化應激指標差異（n=10，±s，pg/mL）

表2 各組大鼠氧化應激指標差異（n=10，±s，pg/mL）

*P＜0.05 vs假手術組； #P＜0.05 vs模型組；△P＜0.05 vs miR-NC組

組別SODMDAGSH-PX假手術組135.62±15.33123.15±28.71121.23±16.08模型組 27.84±4.57* 1683.27±251.46* 32.46±5.12*miR-NC組 28.11±5.85* 1705.16±214.85* 30.87±4.95*miR-200c組 69.77±7.94*#△ 724.81±148.74*#△ 69.18±7.47*#△P＜0.001＜0.001＜0.001

2.5 炎癥因子水平

與假手術組相比，其他3組IL-6、IL-1β、TNF-α含量顯著增多（P＜0.05），miR-200c組IL-6、IL-1β、 TNF-α含量顯著低于模型組和miR-NC組（P＜0.05）（表3）。

表3 各組大鼠炎癥指標差異（n=10，±s，pg/mL）

表3 各組大鼠炎癥指標差異（n=10，±s，pg/mL）

*P＜0.05 vs假手術組； #P＜0.05 vs模型組；△P＜0.05 vs miR-NC組

組別IL-6IL-1βTNF-α假手術組12.46±1.4718.45±2.1516.31±1.25模型組34.27±4.02*42.16±4.45*37.34±3.84*miR-NC組35.43±3.72*41.73±4.29*38.02±3.75*miR-200c組25.04±2.61*#△29.05±3.22*#△22.45±2.86*#△P＜0.001＜0.001＜0.001

2.6 PI3K/Akt/mTOR通路分子表達

與假手術組相比，其他3組PI3K/Akt/mTOR通路被顯著抑制（P＜0.05），miR-200c組PI3K/Akt/mTOR的活化水平顯著高于模型組和miR-NC組（P＜0.05）（圖3）。

圖3 各組大鼠PI3K/Akt/mTOR通路分子表達差異

3 討論

本研究采用線栓法構建大鼠腦缺血再灌注損傷模型，觀察側腦室注射miR-200c對模型大鼠神經(jīng)損傷的保護作用及潛在機制，結果顯示模型大鼠神經(jīng)功能評分、腦含水量和腦梗死體積顯著升高，表明該方法建模成功。側腦室注射miR-200c后，miR-200c通過調控PI3K/Akt/mTOR通路顯著改善模型大鼠的腦損傷，為腦缺血再灌注損傷的診斷和治療提供新的分子靶點。

本研究結果顯示，miR-200c通過調控PI3K/Akt/mTOR通路顯著減輕腦組織內氧化應激反應和炎癥反應，抑制神經(jīng)細胞凋亡，發(fā)揮顯著的腦保護作用。與既往國外文獻結論并不完全一致，Tang等[12]研究表明，緩激肽1受體拮抗劑可阻斷緩激肽1受體，抑制小膠質細胞微囊泡miR-200c向神經(jīng)細胞進行信號傳遞，進而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。究其原因，可能與miR-200c靶向的下游分子不同有關，本研究中miR-200c作用于PI3K/Akt/mTOR信號通路，上調其表達，減少促氧化應激指標MDA的含量，增加抗氧化應激指標SOD和GSH-PX的含量，同時抑制炎癥因子IL-1β、TNF-α的水平，改善神經(jīng)功能評分、腦含水量和腦梗死體積，下調促凋亡蛋白Bax和caspase 3的表達，上調抑凋亡蛋白Bcl2的表達，減輕神經(jīng)細胞凋亡[13]，為腦缺血再灌注導致的腦損傷提供新的有效治療和改善方案，對于腦卒中患者的臨床治療而言意義重大。

PI3K/Akt/mTOR信號通路是廣泛存在于細胞內參與影響細胞生成、分化、增殖、遷移、侵襲和凋亡的經(jīng)典通路，參與多種惡性腫瘤疾病、急慢性炎癥疾病和損傷疾病的發(fā)生發(fā)展[14-15]。有研究顯示，miR-200c可通過調控PI3K/Akt通路促進乳腺癌細胞的體外增殖、遷移和侵襲，與乳腺癌細胞的惡性生物學行為有關[16]。關于miR-200調控PI3K/Akt在神經(jīng)元及腦組織中發(fā)揮的效應也有國外學者曾報道過。Du等[17]研究表明，miR-200c-3p在癲癇大鼠海馬組織中高表達，miR-200c-3p通過激活Akt信號通路降低海馬組織中炎癥介質的含量，減輕氧化應激反應，抑制癲癇大鼠馬海神經(jīng)元凋亡，減輕神經(jīng)元損傷，這與本研究結果較為相符。本研究結果也顯示，側腦室注射miR-200c通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路的磷酸化水平，顯著抑制腦缺血再灌注大鼠氧化應激反應和炎癥反應，抑制神經(jīng)細胞凋亡，降低神經(jīng)功能評分、腦含水量和腦梗死體積。其機制可能與miR-200c對PI3K/Akt/mTOR通路的調控作用有關，miR-200c通過酪氨酸激酶激活PI3K的磷酸化，并在丙酮酸脫氫酶激酶同工酶1的作用下活化Akt信號[18]，再與磷酸化的結節(jié)性硬化復合物2結合，增強腦中富含的Ras同源蛋白活性，上調mTOR的磷酸化水平[19]，發(fā)揮顯著的神經(jīng)保護作用。本研究結果進一步說明miR-200c上調PI3K/Akt/mTOR信號級聯(lián)在腦缺血再灌注腦保護中發(fā)揮關鍵的生物學效應。

綜上所述，miR-200c可通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路，顯著抑制腦缺血再灌注大鼠腦組織內氧化應激反應和炎癥反應，改善神經(jīng)細胞凋亡，減輕模型大鼠神經(jīng)功能評分、腦含水量和腦梗死體積，發(fā)揮顯著的腦保護作用。本研究結果提示miR-200c和PI3K/Akt/mTOR信號通路在腦缺血再灌注患者的治療中擁有廣闊應用前景，臨床可考慮將PI3K/Akt/mTOR通路作為改善缺血性腦卒中的重要靶點，以減少患者腦卒后腦損傷。