Wee1激酶及其抑制劑研究進(jìn)展

楊玥婧，土振霖，唐偉方，陳亞東

（中國藥科大學(xué)理學(xué)院，江蘇 南京 211198）

1 Wee1激酶概述

Wee1激酶最早發(fā)現(xiàn)于裂殖酵母中，是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的重要成員之一[1]，屬于細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白。人類Wee家族包括髓鞘轉(zhuǎn)錄因子1（myelin transcription factor 1，Myt1）、Wee1、Wee2[2]。Wee1激酶是一種高度保守的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，人類Wee1基因編碼647個(gè)氨基酸組成的蛋白，主要包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域（見圖1A）：N-端結(jié)構(gòu)域、中心激酶結(jié)構(gòu)域和1個(gè)短的C-端結(jié)構(gòu)域。N-端結(jié)構(gòu)域是Wee1激酶的激活結(jié)構(gòu)域，也是抑制周期蛋白依賴性激酶1-周期蛋白B（cyclin-dependent kinase 1-cyclin B，CDK1-CyclinB）復(fù)合物去磷酸化的潛在位點(diǎn)，包含1個(gè)富甘氨酸環(huán)（殘基序列306 ~ 311）和3段富含脯氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氦酸的序列（殘基序列24 ~ 126），這些泛素化識別位點(diǎn)可以嚴(yán)格控制Wee1的細(xì)胞內(nèi)半衰期；C-端結(jié)構(gòu)域主要包含催化段（殘基序列422 ~ 433）和活化段（殘基序列462 ~ 486）[3]。

細(xì)胞周期包括間期和分裂期，間期包括合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2期），DNA復(fù)制和蛋白質(zhì)合成在間期完成。在細(xì)胞增殖過程中，多種原因?qū)е翫NA損傷和染色體變異，為保證基因組的完整，間期主要通過3個(gè)細(xì)胞周期檢查點(diǎn)（G1/S檢查點(diǎn)、S檢查點(diǎn)、G2/M檢查點(diǎn)）對此進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié)，及時(shí)中斷細(xì)胞周期進(jìn)程[4]，待修復(fù)完成后再恢復(fù)運(yùn)轉(zhuǎn)。生理?xiàng)l件下，在S期，Wee1激酶能磷酸化CDK1的第15位酪氨酸，進(jìn)而抑制CDK1活性。在G2期，DNA復(fù)制完成后，Wee1轉(zhuǎn)而磷酸化組蛋白2B（histone 2B，H2B）的37位酪氨酸，抑制轉(zhuǎn)錄共激活因子核蛋白（nuclear protein ataxia-telangiectasia，NPAT）和RNA聚合酶Ⅱ的結(jié)合，并招募上游組蛋白1（histone 1，Hist1）的分子伴侶HIR組蛋白細(xì)胞周期調(diào)控缺陷同源物A（HIR histone cell cycle regulation defective homolog A，HIRA），下調(diào)H2B表達(dá)，抑制S期末期組蛋白轉(zhuǎn)錄[5]，維系DNA-組蛋白的化學(xué)計(jì)量比。polo樣蛋白激酶1（polo-like kinase 1，PLKl）磷酸化激活周期蛋白25同源蛋白C（cyclin 25 homologous protein C，Cdc25C），Cdc25C通過去磷酸化激活CDK1，活化的CDK1結(jié)合CyclinB形成CDK1-CyclinB 復(fù)合物，驅(qū)動細(xì)胞進(jìn)入分裂期。然而基因毒性應(yīng)激、烷基化劑、輻射等刺激導(dǎo)致DNA發(fā)生單鏈或雙鏈斷裂，DNA損傷反應(yīng)信號通路（DNA damage response signaling pathways，DDR）被 激活[6]，從而激活下游共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張激酶（ataxiat elangiectasia-mutated kinase，ATM）信號通路或共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張Rad3相關(guān)激酶（ataxia telangiectasia and Rad3 related kinase，ATR）信 號通路（見圖1B）。

圖1 Wee1激酶結(jié)構(gòu)（A）及其阻滯有絲分裂的作用機(jī)制（B）Figure 1 Structure of Wee1 kinase and its mechanism of action in blocking mitosis

DNA發(fā)生單鏈斷裂，ATR信號通路激活，細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激酶1（checkpoint kinase 1，Chk1）的317位和345位絲氨酸經(jīng)磷酸化而激活，活化后的Chk1同時(shí)磷酸化Cdc25C和Wee1[7]，抑制Cdc25C、激活Wee1。Wee1激酶通過2條途徑阻滯有絲分裂：1）磷酸化組蛋白H2B的37位酪氨酸，抑制轉(zhuǎn)錄共激活因子NPAT和RNA聚合酶Ⅱ的結(jié)合，并招募了上游組蛋白伴侶HIRA，下調(diào)H2B表達(dá)，產(chǎn)生S期阻滯；2）抑制Cdc25C從而抑制CDK1去磷酸化或直接磷酸化CDK1的第15位酪氨酸，抑制CDK1活性，產(chǎn)生G2/M阻滯，為修復(fù)受損DNA爭取時(shí)間，維持染色質(zhì)的完整性。DNA修復(fù)完成后，PLKl磷酸化Weel激酶，通過泛素連接酶降解Weel，同時(shí)，Chk1對Cdc25C抑制作用喪失[8]，CDK1隨后被Cdc25C去磷酸化并重新激活，驅(qū)動細(xì)胞進(jìn)入分裂期。

DNA發(fā)生雙鏈斷裂，ATM信號通路激活，細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激酶2（checkpoint kinase 2，Chk2）磷酸化Cdc25C的216位絲氨酸，促進(jìn)Cdc25C與14-3-3蛋白結(jié)合，致使Cdc25C與細(xì)胞質(zhì)分離[9]，從而抑制其活性，進(jìn)而抑制CDK1-CyclinB復(fù)合物磷酸化，抑制細(xì)胞進(jìn)入分裂期。

合成致死（synthetic lethality，SL）是指2個(gè)或多個(gè)非致死基因同時(shí)失活導(dǎo)致細(xì)胞死亡的現(xiàn)象[10]。在正常細(xì)胞中，DNA損傷還可通過抑癌基因p53介導(dǎo)的2種通路：ATM/ATR-P53-CDK4/CyclinD和ATM/ATR-P53-CDK2/CyclinE，從而抑制抑癌基因Rb磷酸化，使細(xì)胞阻滯在G1期[11]，完成DNA修復(fù)。然而，在腫瘤細(xì)胞中，抑癌基因p53突變率較高，超過50%的腫瘤細(xì)胞中存在該基因的突變。p53功能缺陷的腫瘤細(xì)胞G1/S檢查點(diǎn)失活，這使得DNA修復(fù)主要依賴于G2/M檢查點(diǎn)[12]，此時(shí)抑制Wee1會進(jìn)一步使G2/M檢查點(diǎn)失活，驅(qū)動細(xì)胞過早進(jìn)入分裂期，導(dǎo)致有絲分裂災(zāi)難，從而產(chǎn)生SL效應(yīng)。然而正常細(xì)胞的p53基因功能正常，能夠在G1/S和G2/M期檢查點(diǎn)分別檢查DNA是否完整，Wee1激酶的活性被抑制時(shí)，其功能上的缺失可以通過p53依賴的DNA損傷修復(fù)機(jī)制得到補(bǔ)償。理論上，抑制Wee1激酶活性能夠選擇性地殺死p53功能缺陷腫瘤細(xì)胞，而不影響正常細(xì)胞，是一種理想的腫瘤治療途徑。相關(guān)研究表明，Wee1激酶在乳腺癌、卵巢癌、肝癌、宮頸癌、肺癌、鱗狀細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、胃癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、橋內(nèi)彌漫性腦膠質(zhì)瘤、惡性黑色素瘤中過表達(dá)且在卵巢癌、黑色素瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)[13]。因此，Wee1激酶在相關(guān)腫瘤治療中的作用機(jī)制及其抑制劑的開發(fā)是當(dāng)下研究熱點(diǎn)。

2 Wee1激酶與相關(guān)疾病

2.1 胃癌

胃癌（gastric carcinoma，GC）是我國最常見的惡性腫瘤之一。許多化療藥物可引起GC中腫瘤細(xì)胞的DNA損傷。腫瘤細(xì)胞缺乏G1/S期，大多數(shù)依賴于G2/M期阻滯[14]。Wee1是G2/M檢查點(diǎn)的一個(gè)關(guān)鍵因素。Kim等[15]首次提出Wee1激酶可能在胃癌中表達(dá)，經(jīng)過一系列實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Wee1在胃癌細(xì)胞和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞中陽性率較高，過表達(dá)Wee1的腫瘤細(xì)胞增殖侵襲能力較強(qiáng)。Zhang等[16]還證實(shí)了Wee1在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)增加，羅哌卡因（ropivacaine，Rop）通過上調(diào)miR-520a-3p基因的表達(dá)使Wee1和磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）失活最終抑制GC中腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，該結(jié)果展現(xiàn)了調(diào)控Wee1通路在GC治療方面的潛力。

2.2 黑色素瘤

惡性黑色素瘤（malignant melanoma，MM）是一種由皮膚和其他器官的黑色素細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤，在我國每年約有2萬新增病例，雖然靶向治療已經(jīng)取得重大進(jìn)展，但存在嚴(yán)重的耐藥性和治療后復(fù)發(fā)的情況。在惡性MM中，無論p53的狀態(tài)如何，Wee1的高表達(dá)均可減少腫瘤細(xì)胞的DNA損傷，并與惡性MM的增殖、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后呈正相關(guān)。研究表明，與大多數(shù)腫瘤不同，p53在惡性MM中表達(dá)呈陽性[17]。Wee1是有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中小鼠肉瘤病毒致癌基因同源基因 B（mouse sarcoma virus oncogene homologous gene B，B-Raf）下游的關(guān)鍵信號分子,可以在細(xì)胞周期中抑制p53-p21-CDK2/CyclinE-Rb通路，從而使細(xì)胞周期在S期被阻斷，因此，Wee1蛋白激酶在MM中的表達(dá)仍呈陽性[18]。在動物實(shí)驗(yàn)中，Wee1的高表達(dá)和微小RNA-155（microRNA-155，miR-155）的缺失有助于惡性MM的轉(zhuǎn)移。研究表明，Wee1抑制劑和AKT3激酶抑制劑聯(lián)用治療MM，比單用AKT3抑制劑更有效[19]。

2.3 胰腺癌

胰腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDA）是一種致死性極高的疾病，生存率低，缺乏有效的靶向治療方案。研究證明，PDA細(xì)胞中RNA結(jié)合蛋白人類抗原R（human antigen R，HuR）沉默使細(xì)胞對DNA 損傷劑敏感，而HuR過表達(dá)則會引起抵抗。當(dāng) DNA出現(xiàn)損傷時(shí)，HuR從細(xì)胞核易位到細(xì)胞質(zhì)與Wee1的mRNA結(jié)合，通過穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)上調(diào)Wee1的表達(dá)，Wee1過表達(dá)促進(jìn)CDK1磷酸化從而激活G2/M檢查點(diǎn)[20]。這種新的應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制解釋了PDA的耐藥性，并證實(shí)了Wee1的快速翻譯可防止PDA細(xì)胞發(fā)生災(zāi)難性DNA損傷。Kausar等[21]發(fā)現(xiàn)，Wee1抑制劑adavosertib可使同源重組（homologous recombination，HR）功能正常的PDA細(xì)胞對吉西他濱化療敏感。

2.4 卵巢癌

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是婦科惡性腫瘤中死亡率最高的癌癥，早期較難診斷，發(fā)病時(shí)多伴隨盆腹腔轉(zhuǎn)移，雖然鉑類化療可緩解癥狀，但復(fù)發(fā)率高且預(yù)后不良，導(dǎo)致患者5年生存率低于40%。目前，卵巢癌的靶向治療藥物聚ADP核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）抑制劑治療范圍僅包括乳腺癌1號基因（breast cancer gene 1，BRCA1）、乳腺癌2號基因（breast cancer gene 2，BRCA2）突變、同源重組修復(fù)基因缺陷（homologous recombination deficiency，HRD）的患者，應(yīng)用存在一定局限性。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，由于超過95%的卵巢癌患者攜帶突變的p53基因，G1/S檢查點(diǎn)基本失活，而抑制Wee1可進(jìn)一步使G2/M檢查點(diǎn)失活，導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞DNA損傷無法修復(fù)而最終凋亡[22]。Wee1通過下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子E2F信號通路抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNA methyltransferase 1，DNMT1）表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分泌干擾素，上調(diào)干擾素信號通路，導(dǎo)致程序性死亡蛋白配體1（programmed death-ligand 1，PD-L1）上調(diào)，最終促進(jìn)腫瘤增殖[23]。

3 Wee1抑制劑研究進(jìn)展

已報(bào)道的Wee1激酶抑制劑按結(jié)構(gòu)類型可分為嘧啶并吡啶酮類、嘧啶并吡唑酮類、咔唑并吡咯二酮類及其他類。本文將分別介紹Wee1激酶抑制劑的結(jié)構(gòu)及臨床研究進(jìn)展，表1為已進(jìn)入臨床階段的Wee1小分子抑制劑的研究進(jìn)展。

表1 進(jìn)入臨床的Wee1小分子抑制劑Table 1 Small molecule inhibitors of Wee1 under clinical trials

3.1 嘧啶并吡啶酮類抑制劑

3.1.1 PD0166285Wang等[24]在2010年經(jīng)高通量篩選得到化合物PD0166285（1），但其選擇性差，對Wee1的IC50為24 nmol · L-1，對細(xì)胞原癌基因酪氨酸蛋白激酶（cell proto-oncogene tyrosineprotein kinase，c-Src）的 IC50為9 nmol · L-1，未進(jìn)入臨床。Hashimoto等[25]發(fā)現(xiàn)，PD0166285在0.5 μmol · L-1濃度下與野生型p53 B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞共同孵育24 h，其表現(xiàn)出明顯的抗增殖效果；當(dāng)PD016628與Hep3B人肝癌細(xì)胞共同孵育6 h可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。機(jī)制研究表明：PD0166285通過抑制CDK1的第15位酪氨酸去磷酸化和抑制CyclinB的表達(dá)消除S期阻滯、使G2/M檢查點(diǎn)失活從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖。

為提高激酶選擇性，Palmer等[26]對PD0166285進(jìn)行優(yōu)化（見圖2A），去除苯胺上的含氧側(cè)鏈及優(yōu)化右側(cè)苯環(huán)得到的化合物2，其活性急劇下降，對Wee1的 IC50為0.99 μmol · L-1，對c-Src的 IC50為14 nmol · L-1；而再次引入含氧側(cè)鏈并在嘧啶并吡啶酮骨架引入甲基得到的化合物3，其對Wee1的 IC50為0.54 μmol · L-1，對c-Src的 IC50為0.36 μmol · L-1，相較于化合物2，化合物3對Wee1的抑制活性略有提升（IC50= 0.54 μmol · L-1），對c-Src的抑制活性則顯著下降（IC50= 0.36 μmol · L-1）。將化合物3分別與Wee1激酶和c-Src激酶對接（見圖2B和圖2C）發(fā)現(xiàn)：1）帶有甲基的苯環(huán)與嘧啶并吡啶酮骨架垂直；2）化合物3苯胺N原子與c-Src激酶的氨基酸殘基Met341形成關(guān)鍵氫鍵，而其與Wee1激酶結(jié)合模式顯示，苯胺N原子和臨近的2位嘧啶N原子均與氨基酸殘基Cys379形成關(guān)鍵氫鍵；3）吡啶酮5位甲基的位阻效應(yīng)影響化合物3與c-Src的結(jié)合；4）與c-Src激酶相比，化合物3右側(cè)苯環(huán)與Wee1激酶的氨基酸殘基Tyr328形成額外的π-π堆積作用。

圖2 嘧啶并吡啶酮類抑制劑結(jié)構(gòu)改造及化合物3與Wee1激酶和c-Src激酶結(jié)合模式圖Figure 2 Structural modification of pyrimidopyridone inhibitors and the binding pattern of compound 3 to Wee1 kinase and c-Src kinase

3.2 嘧啶并吡唑酮類抑制劑

3.2.1 Adavosertib默克公司研發(fā)的adavosertib（4，AZD-1775、MK-177），其對Wee1的IC50為5.2 nmol · L-1，是首個(gè)進(jìn)入臨床的Wee1小分子抑制劑，2012年在歐盟獲批孤兒藥資格，用于治療卵巢癌。2013年，默克公司將該產(chǎn)品的全球開發(fā)和營銷授權(quán)給阿斯利康公司，用于治療實(shí)體瘤。目前已進(jìn)入Ⅱ期臨床，主要用于治療卵巢癌和胰腺癌。

Adavosertib抑制CDK1-CyclinB復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核從而消除S期阻滯，使G2/M期檢查點(diǎn)失活從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。體外研究表明，adavosertib與DNA損傷劑聯(lián)用時(shí)，先給藥DNA損傷劑再使用adavosertib的療效較優(yōu)。在人宮頸腺癌細(xì)胞異種移植小鼠模型中，經(jīng)口給藥卡鉑（50 mg · kg-1），間隔24 h再給予adavosertib（劑量分別為10、20和30 mg · kg-1）可劑量依賴性地增強(qiáng)卡鉑的抑瘤作用[27]。Zhang等[16]證實(shí)在ID8小鼠卵巢上皮癌細(xì)胞中，無論p53是否缺失，adavosertib都可通過抑制Wee1激活CDK1，使G2/M檢查點(diǎn)失活從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；在卵巢癌小鼠模型中，50 mg · kg-1劑量連續(xù)經(jīng)口給藥2周，能明顯降低惡性腹水發(fā)生率。

Adavosertib對Wee1激酶的選擇性低，容易導(dǎo)致耐受性。因此adavosertib常與DNA損傷劑、DNA修復(fù)抑制劑或聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly adenosine diphosphate ribose polymerase，PARP）抑制劑聯(lián)合使用。

Adavosertib可誘導(dǎo)DNA損傷，存在一定細(xì)胞毒性。Li等[28]發(fā)現(xiàn)，鼠雙微體蛋白2（murine double minute2，Mdm2）拮抗劑能通過預(yù)激活p53蛋白而降低adavosertib對野生型細(xì)胞的毒性?？紤]到adavosertib單一用藥的毒性作用，一項(xiàng)涉及202例晚期實(shí)體瘤患者的Ⅰ期臨床研究（NCT00648648）評估了adavosertib單藥及與卡鉑、順鉑、吉他西濱聯(lián)用的療效：單藥組adavosertib分別給藥325、650和1 300 mg，最常見的藥物相關(guān)不良事件（adverse event，AE）是腹瀉（22%）和疲勞（22%），但單藥治療未達(dá)到最大耐受劑量（maximal tolerable dose，MTD）。聯(lián)合治療組MTD為：adavosertib（225 mg，bid）、順鉑（200 mg，bid）、吉他西濱（175 mg，od）[29]。在176例接受聯(lián)合治療的可評估患者中，10%的患者達(dá)到了部分緩解（partial response，PR）。對52例患者的基線腫瘤樣本進(jìn)行分析：19例p53突變的腫瘤患者中有4例（21%）達(dá)到了PR。AE包括：疲勞（58%）、惡心（67%）、嘔吐（35%）和血小板減少（44%）。結(jié)果表明，adavosertib與吉西他濱、順鉑、卡鉑聯(lián)合用藥是可耐受且有效的。

在卵巢癌治療方面，一項(xiàng)涉及94例鉑耐藥的上皮性卵巢癌、輸卵管癌或原發(fā)性腹膜癌患者的Ⅱ期臨床研究（NCT02272790）評估了adavosertib聯(lián)合卡鉑、吉西他濱治療的有效性和安全性：吉西他濱聯(lián)用組客觀緩解率（objective response rate，ORR）和中位無進(jìn)展生存期（progression-free surival，PFS）分別為31.9%和5.5個(gè)月，卡鉑聯(lián)用組療效最好，其ORR為66.7%，中位PFS為12個(gè)月。所有患者都至少產(chǎn)生一次AE，3級AE發(fā)生率為40.4%，4級AE發(fā)生率為41.5%。最常見的不良反應(yīng)包括貧血（33%）、中性粒細(xì)胞減少（45.7%）、血小板減少（31%）、嘔吐（10%）和腹瀉（10%）[30]。一項(xiàng)涉及121例p53突變卵巢癌患者的Ⅱ期臨床研究（NCT01357161）表明化療藥物與adavosertib聯(lián)用可提高臨床抗腫瘤活性：adavosertib組（adavosertib、紫杉醇和卡鉑聯(lián)合治療）患者的中位PFS為10個(gè)月，ORR為81%；而對照組PFS為1個(gè)月，ORR為8%；安慰劑組（安慰劑、紫杉醇和卡鉑聯(lián)合治療）ORR為76%[31]。

在胰腺癌治療方面，一項(xiàng)涉及34例患者的Ⅱ期臨床（NCT02037230）研究表明[32]，adavosertib聯(lián)合吉西他濱和放療是有效和可耐受的：患者總生存期（overall survival，OS）顯著延長至21.7個(gè)月，顯示了adavosertib在胰腺癌治療中的應(yīng)用前景。

3.2.2 ZN-c3針對adavosertib臨床試驗(yàn)中存在的耐受性差，間歇性給藥等問題，Zentalis Pharmaceuticals公司研發(fā)出一種口服小分子 Wee1 抑制劑ZN-c3（5），選擇性好，細(xì)胞毒性較小。2021年ZN-c3在美國獲批孤兒藥資格，用于治療骨肉瘤，目前已進(jìn)入Ⅱ期臨床。

Huang等[33]在對adavosertib結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，對其尾區(qū)的N-甲基哌嗪優(yōu)化（見圖3）得到的化合物6、7，小鼠肝微粒體清除率高，分別為603和1 060 mL · min-1· kg-1，且低劑量下口服暴露量偏低,分別為1和0.7 μmol · L-1· h-1；保留尾區(qū)N-甲基哌嗪結(jié)構(gòu)，優(yōu)化頭區(qū)得到的化合物8， H23細(xì)胞抑制活性顯著降低（IC50= 1 533 nmol · L-1）；將氟替代為羥基的化合物9的細(xì)胞活性下降（IC50= 2 524 nmol · L-1）；考慮到仲醇結(jié)構(gòu)代謝存在潛在毒性，優(yōu)化為叔醇得到的化合物10，其細(xì)胞活性提升了近8倍（IC50= 317 nmol · L-1），維持較低的肝微清除率（CL）為38 mL · min-1· kg-1和血漿蛋白結(jié)合率（PPB）為73%，1 μmol · L-1濃度下化合物10只對4種激酶即Wee1、Polo樣激酶2（Polo-like kinase 2，PLK2）、酵母Sps1/Ste20相關(guān)激酶4（yeast Sps1/Ste20-related kinase 4，YSK4）和表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的抑制率大于90%。將甲基改為乙基得到的ZN-c3，顯示出良好的細(xì)胞效力（IC50= 103 nmol · L-1）和內(nèi)在清除率。1 μmol · L-1濃度下只對5種激酶即Wee1、PLK2、YSK4、EGFR、Polo樣激酶3（Polo-like kinase 3，PLK3）的抑制率大于90%。在小鼠A427非小細(xì)胞肺癌異種移植模型，30 mg · kg-1劑量給藥即可顯著抑制CDK1磷酸化，80 mg · kg-1劑量給藥則表現(xiàn)出與adavosertib相當(dāng)?shù)哪[瘤抑制率。

圖3 嘧啶并吡唑酮類化合物結(jié)構(gòu)改造過程Figure 3 Structural modification process of pyrimidopyrazolones

2019年11月，在美國開展一項(xiàng)涉及39例實(shí)體瘤患者的Ⅰ期臨床試驗(yàn)（NCT04158336）[34]，評估ZN-c3單獨(dú)使用的安全性、耐受性、有效性、藥動學(xué)和藥效學(xué)，在晚期或轉(zhuǎn)移性實(shí)體腫瘤患者中開展單藥Ⅰ期劑量遞增試驗(yàn)（25 ~ 400 mg，qd），口服給藥ZN-c3，有5例患者實(shí)現(xiàn)PR，其中1例Ⅳ期結(jié)直腸癌并轉(zhuǎn)移至肝臟、淋巴結(jié)和胸膜的男性患者，口服ZN-c3（450 mg，qd）后達(dá)到PR，總體腫瘤負(fù)荷降低了42%；1例Ⅳ期卵巢癌并轉(zhuǎn)移到胸膜和腹膜的女性患者，口服ZN-c3（175 mg，bid）后達(dá)到PR，總體腫瘤負(fù)荷降低了56%；1例Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌并轉(zhuǎn)移至肝肺的男性患者口服ZN-c3（350 mg，qd）治療后達(dá)到PR，總體腫瘤負(fù)荷降低了50%。ZN-c3常見不良反應(yīng)包括：腹瀉、嘔吐、貧血、外周水腫、堿性磷酸酶升高、味覺障礙、低磷血癥、發(fā)熱、肝酶升高和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)減少。

2021年6月在澳大利亞、加拿大、格魯吉亞等國開展ZN-c3的Ⅱ期臨床試驗(yàn)（NCT04814108），針對復(fù)發(fā)性或持續(xù)性子宮癌患者，評估ZN-c3在子宮癌患者中的安全性和有效性，目前相關(guān)數(shù)據(jù)并未披露。

2021年8月在美國開展ZN-c3的Ⅱ期臨床試驗(yàn)（NCT04833582），針對復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性骨肉瘤的10歲及以上患者，評估ZN-c3與吉西他濱聯(lián)合治療轉(zhuǎn)移性骨肉瘤患者的安全性和有效性，目前相關(guān)數(shù)據(jù)并未披露。

3.3 咔唑并吡咯二酮類

經(jīng)高通量篩選得到的化合物PD0407824（11）活性較好，其對Wee1的IC50為97 nnmol · L-1、對Chk1的 IC50為47 nnmol · L-1，但其選擇性和溶解性差[35]，未進(jìn)入臨床?；衔颬D0407824與Wee1的結(jié)合模式如下（見圖4A）：1）在鉸鏈區(qū)，1位羰基氧和9位羥基氧與鉸鏈區(qū)Cys379形成氫鍵；2）2位N和3位羰基氧分別與Glu377和Asn376形成氫鍵；3）咔唑環(huán)可與Phe433形成π-π堆積作用；4）C-8伸向溶劑可及區(qū)。體外實(shí)驗(yàn)表明，其抑制活性主要與Wee1基因表達(dá)水平有關(guān)。在Wee1基因高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞系（如宮頸癌和乳腺癌細(xì)胞）中，其可以抑制腫瘤細(xì)胞生長并誘導(dǎo)凋亡，但在Wee1基因低表達(dá)的癌細(xì)胞系（如前列腺癌細(xì)胞）中，其抑制作用較弱。

優(yōu)化右側(cè)苯環(huán)（見圖4B）得到的化合物12，其對Wee1的 IC50為11 nnmol · L-1、對Chk1 的IC50為440 nnmol · L-1，在提升Wee1抑制活性的同時(shí)顯著提升了選擇性，但同樣存在溶解性差的問題。對骨架N取代得到的化合物13，其對Wee1 的IC50為9 nnmol · L-1、對Chk1的 IC50為170 nnmol · L-1，選擇性下降且并未增加溶解度，進(jìn)一步優(yōu)化側(cè)鏈后得到化合物14，其對Wee1的 IC50為58 nnmol · L-1、對Chk1的 IC50為30 nnmol · L-1，溶解度提升但選擇性顯著下降。

圖4 咔唑并吡咯二酮類抑制劑結(jié)構(gòu)改造及PD0407824與Wee1激酶結(jié)合模式圖Figure 4 Structural modification of carbazolopyrrole diketone inhibitors and the binding pattern of PD0407824 to Wee1 kinase

該類化合物雖然存在溶解度差的問題，但提供了一個(gè)與Wee1結(jié)合的全新模式，為后續(xù)抑制劑開發(fā)提供了新的思路。

3.4 其他

Debio-0123是Debiopharm Group公司研發(fā)的一種口服小分子Wee1激酶抑制劑，體外實(shí)驗(yàn)表明其通過抑制CDK1磷酸化，時(shí)間和劑量依賴性地誘導(dǎo)DNA損傷，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，在無胸腺裸鼠的A427皮下異種移植瘤模型中，30 mg · kg-1劑量連續(xù)口服給藥28 d，腫瘤明顯消退[36]。2019年7月，在荷蘭和西班牙開展Ⅰ期臨床試驗(yàn)（NCT03968653），與卡鉑聯(lián)合治療復(fù)發(fā)或難治性局部晚期或轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤，預(yù)計(jì)在2022年12月5日前完成。

SY-4835是由首藥（北京）股份有限公司研發(fā)的一種小分子Wee1抑制劑，2021年6月在中國開展實(shí)體瘤的Ⅰ期臨床試驗(yàn)（CTR20211519）。

IMP-7068是南京英派藥業(yè)有限公司研發(fā)的一種小分子Wee1抑制劑，2021年2月，開展Ⅰ期臨床試驗(yàn)（NCT04768868），評估單藥治療晚期實(shí)體瘤患者的安全性、耐受性和初步抗腫瘤活性。

4 結(jié)語與展望

在細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程中，Wee1激酶在G2/M期檢查點(diǎn)發(fā)揮關(guān)鍵作用，其功能異?？梢l(fā)細(xì)胞有絲分裂災(zāi)難，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。由于腫瘤細(xì)胞多存在p53功能缺陷，而Wee1高表達(dá)，故抑制Wee1可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞SL。雖然Wee1激酶活性對腫瘤細(xì)胞的信號傳導(dǎo)起著至關(guān)重要的作用，但迄今為止，已報(bào)道的Wee1激酶抑制劑絕大部分未能進(jìn)入臨床，即便是進(jìn)入臨床的抑制劑，如adavosertib也因選擇性低、存在脫靶效應(yīng)引發(fā)安全性問題。Adavosertib單藥治療存在一定的細(xì)胞毒性，導(dǎo)致3級或以上的AE。ZN-c3選擇性優(yōu)于adavosertib，但目前臨床數(shù)據(jù)披露較少，其療效和潛在毒性尚不明確。

臨床試驗(yàn)中Wee1抑制劑多與其他抗癌藥物聯(lián)用，然而，還需要進(jìn)一步的研究來確定這些藥物在臨床上潛在的脫靶效應(yīng)和療效。如何保持抑制劑本身的療效，同時(shí)把控Wee1激酶抑制劑和其他藥物或治療之間的平衡，給患者帶來最大的益處是當(dāng)下需要解決的問題。因此，尋找具有高選擇性、低毒性的Wee1抑制劑，并探索與其他藥物聯(lián)用的方式及劑量仍然是今后研究的重點(diǎn)。