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    水分子在藥物設(shè)計中的作用

    2022-03-06 09:11:24周洋陸小云
    藥學進展 2022年1期
    關(guān)鍵詞:靶標氫鍵水分子

    周洋,陸小云

    (暨南大學藥學院,廣東 廣州510632)

    隨著結(jié)構(gòu)生物學的快速發(fā)展,大量與疾病密切相關(guān)的蛋白結(jié)構(gòu)得到解析,極大地促進了基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(structure-based drug design,SBDD)的發(fā)展。利用SBDD進行化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化迭代,已經(jīng)在藥物研發(fā)過程中發(fā)揮不可替代的重要作用。大量的蛋白晶體結(jié)構(gòu)表明,在藥物結(jié)合口袋中,經(jīng)常有水分子出現(xiàn),這些水分子對于化合物與靶標的結(jié)合起到關(guān)鍵作用。然而在以往的大多數(shù)SBDD中,對于利用這些水分子指導藥物設(shè)計的應用還不夠廣泛[1]。

    近年來,通過替換口袋中的水分子,或設(shè)計化合物與水分子形成相互作用,指導化合物設(shè)計改造,已經(jīng)在提高化合物親和力、選擇性以及改善其藥動學性質(zhì)等方面有了越來越多的應用,如Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog,KRAS)G12C突變蛋白抑制劑MRTX849[1]、布魯頓酪氨酸激酶(Bruton's tyrosine kinase,BTK)抑制劑[2]、血小板衍生生長因子受體β(platelet-derived growth factor receptor β,PDGFRβ)抑制劑[3]以及前列腺素合成酶(prostaglandin synthase,PGDS)抑制劑的研發(fā)等[4]?;诎袠私Y(jié)合口袋的水分子對于化合物優(yōu)化的重要作用以及在SBDD中水分子的作用,已受到越來越多的關(guān)注和研究,如結(jié)合口袋水網(wǎng)絡對于配體結(jié)合能力的影響[5]、替換水分子對于鹵鍵的貢獻等方面[6]。由于并不是所有結(jié)構(gòu)中水分子的替換都是有利的,有時候替換水分子可能造成能量損失,化合物的活性減弱或選擇性降低。對此一系列基于不同原理的水分子計算軟件和方法,也被開發(fā)用于預測水分子的作用,如WaterMap[7]、3D-RISM[5]、SZMAP[6]等。在這些軟件以及對于軟件的測評中,也報道了一些藥物設(shè)計的實例作為方法的驗證[8-9]。然而,目前對于水分子的作用,特別是結(jié)合藥物設(shè)計實例分析結(jié)構(gòu)改造中替換水分子對于化合物的影響,還缺乏系統(tǒng)地總結(jié)介紹。

    本文結(jié)合近年來藥物設(shè)計中的代表性研究實例,較系統(tǒng)地對藥物設(shè)計中基于替換水分子進行化合物優(yōu)化的研究進行總結(jié)和展望,并對水分子和配體親和力的關(guān)系以及預測水分子的軟件和方法進行簡要介紹,以期為基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計和新型藥物分子的研發(fā)提供參考。

    1 替換水分子指導藥物設(shè)計的基本理論和方法

    1.1 基本理論

    絕大部分生物化學過程都在溶液中發(fā)生,在藥物分子與靶標的結(jié)合過程中,除兩者之間相互作用之外,溶液中的水分子狀態(tài)也發(fā)生了改變。當藥物和靶標發(fā)生結(jié)合時,一方面藥物分子從溶液進入靶標結(jié)合口袋,另一方面結(jié)合口袋中原有的水分子被替換到溶液中,兩者周圍的水分子狀態(tài)都發(fā)生了改變。

    水分子對于化合物結(jié)合活性的貢獻,可以從熱力學的角度,根據(jù)化合物與靶標結(jié)合自由能的變化做出解釋?;衔锱c靶標的解離平衡常數(shù)Kd,可以根據(jù)定義表示為化合物與靶標的結(jié)合自由能ΔG:

    其中ΔG是結(jié)合自由能,R和T分別為氣體常數(shù)和溫度。ΔG越低,Kd越小,表明化合物與靶標的結(jié)合能力越強。由于ΔG是狀態(tài)函數(shù),根據(jù)熱力學循環(huán)(見圖1),ΔG分解為真空中化合物與蛋白的結(jié)合自由能變化ΔGvac,以及這一過程中溶劑的自由能變化ΔGsol:

    圖1 化合物與靶標結(jié)合自由能的熱力學循環(huán)分解示意圖Figure 1 Schematic diagram of the thermodynamic cycle decomposition of the free energy of binding between a ligand and a protein

    由此可以看出,ΔG不僅取決于化合物與靶標相互作用,也受到這一過程中溶劑水分子狀態(tài)改變的影響?;衔锏慕Y(jié)構(gòu)優(yōu)化,可以簡單看作是替換蛋白口袋中的水的過程。由于基團的引入,在增加與蛋白口袋相互作用的同時,也替換了蛋白口袋中的水。這一過程水分子總的貢獻ΔGsol由各個水分子(i)的貢獻加和而得到:

    其中,ΔGsol,i是替換蛋白口袋中的水分子的自由能貢獻。通過替換水分子i,ΔGsol,i將影響到化合物與蛋白的結(jié)合自由能,從而改變化合物與蛋白的結(jié)合活性。對于此部分水分子自由能的貢獻,是藥物設(shè)計過程中考慮水分子作用的核心。該項能量很難通過實驗測量,通常只能通過理論計算得到。圍繞該能量項有大量的相關(guān)理論計算研究,已經(jīng)發(fā)展了一系列方法和軟件,例如基于非均相流體理論(inhomogeneous fluid theory,IFT)的WaterMap等,此外還有基于其他計算方法的軟件,如MOE的3D-RISM[5]、OpenEye的SZMAP[6]以及JAWS[10]等,將在本文進行簡要介紹。值得注意的是,盡管許多軟件可以重現(xiàn)晶體結(jié)構(gòu)中的結(jié)構(gòu)水,例如Aldeghi等[11]使用巨正則蒙特卡洛(grand canonical Monte Carlo,GCMC)方法對溴結(jié)構(gòu)域蛋白(bromodomain,BRD)的大規(guī)模分析中發(fā)現(xiàn),口袋中的結(jié)構(gòu)水可以在計算中得到很好的重現(xiàn),但由于晶體和計算條件環(huán)境的差異,以及計算方法的描述,兩者是有所不同的,例如WaterMap實際上計算的是水位點,而非某個特定結(jié)構(gòu)水分子的自由能。

    1.2 設(shè)計方法

    通過替換結(jié)合口袋中的水分子,或者與水分子形成相互作用,可以增強化合物結(jié)合能力、提高其選擇性、改善其藥動學性質(zhì)?;谖墨I調(diào)研,筆者總結(jié)了常見的幾種利用口袋中水分子的藥物設(shè)計方法。如圖2所示,當結(jié)合口袋小分子附近出現(xiàn)水分子時,有以下幾種利用水分子改造化合物的方法:1)引入疏水基團,替換口袋中的水分子??诖写嬖诓环€(wěn)定的水分子,這些水分子通常位于口袋中的疏水區(qū)域,沒有和周圍的蛋白氨基酸殘基形成相互作用,自由能較高,化合物替換這些水分子到溶液是自由能減小的過程(ΔGsol,i<0),有利于提高結(jié)合活性。這一方法已經(jīng)在諸如KRAS G12C抑制劑MRTX849[1]、BTK激酶抑制劑[2]等多個化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化中得到應用。2)引入如羥基等氫鍵給體或受體,替代水分子在這一位置的作用。當口袋中水分子與蛋白形成氫鍵,或者是與口袋中其他水分子構(gòu)成穩(wěn)定的氫鍵網(wǎng)絡時,水分子能量較低,不容易被替換。替換這一水分子有可能造成能量損失,反而會減弱分子的結(jié)合活性(ΔGsol,i>0)。在PDGFRβ抑制劑[3]和PGDS抑制劑[4]的改造中,都發(fā)現(xiàn)了這樣的例子。對于穩(wěn)定的低能水分子,可以使用羥基等氫鍵給體或受體基團占據(jù)這種水分子的位置,同時與周圍的殘基或水網(wǎng)絡形成氫鍵相互作用,替代這一水分子的作用,以增強或維持化合物的結(jié)合能力。另外,在酪氨酸蛋白激酶2(tyrosine kinase 2,TYK2)選擇性抑制劑BMS986165的研究中[12],盡管替換水分子后化合物的活性沒有得到顯著提高,但改善了其藥動學性質(zhì)。此外,還存在一些情況,同源蛋白口袋周圍殘基的相似性很高,而口袋水分子的性質(zhì)有所差異,這時通過水分子的替換可以提高化合物的選擇性[13]。3)與水分子形成氫鍵相互作用。當口袋中水分子的自由能很低,替換水分子對結(jié)合不利時,也可以考慮不替換這一水分子,而是設(shè)計化合物與該水分子形成氫鍵。這種方式可以避免替換水分子造成的能量損失,也是一種利用口袋中水分子指導化合物改造的方法。例如在泛酪氨酸蛋白激酶(pan-tyrosine kinase,pan-TRK)抑制劑的研究中,通過與水分子形成鹽橋而非替換水分子,起到了提高選擇性的效果[14]。

    圖2 藥物設(shè)計中利用口袋中水分子的策略示意圖Figure 2 Schematic diagram of the strategy using water molecules in the pocket in drug design

    在利用水分子指導化合物改造過程中,由于水分子自由能的高低無法單純從觀察晶體結(jié)構(gòu)得知,理論計算成為了預測水分子位點及其性質(zhì)的重要手段,目前已發(fā)展了多種方法和相關(guān)軟件工具。這些方法和軟件已經(jīng)得到廣泛應用,例如WaterMap已經(jīng)在雙特異性酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶(dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase,DYRK)[15]、β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1(β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1,BACE-1)[13]、PDGFR-β[3]和TRK[16]等靶標指導其抑制劑的結(jié)構(gòu)優(yōu)化;JAWS已應用在p38α絲裂原蛋白激酶(p38α mitogen-activated protein kinase,p38α MAP)[17]、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)[18]等的 抑 制劑 優(yōu) 化中;SZMAP在周期蛋白依賴性蛋白激酶-1(cyclin-dependent kinase 1,CDK1)抑制劑的設(shè)計中解釋了激酶選擇性問題[11];3D-RISM在BACE-1高選擇性抑制劑研究[11]和N9神經(jīng)氨酸酶的研究中得到了應用[19]。

    2 利用水位點進行藥物設(shè)計

    2.1 替換水分子增強結(jié)合活性

    2.1.1 KRAS G12C抑制劑MRTX849的發(fā)現(xiàn)KRAS被認為是癌癥中最常見的突變癌基因,在22%的癌癥患者中均發(fā)現(xiàn)了KRAS突變,包括肺癌(17%)、結(jié)腸癌(33%)和胰腺癌(61%)。為了滿足臨床要求,需要直接靶向KRAS蛋白。然而,由于KRAS與內(nèi)源性配體三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate,GTP)具有較強的結(jié)合能力,蛋白表面較淺且結(jié)合域柔性較大,因此,KRAS曾一度被認為是“不可成藥”的靶點[20]。直到近年來KRAS G12C抑制劑出現(xiàn),為選擇性靶向KRAS突變提供了一個新的方向。其中,F(xiàn)ell等[2]發(fā)現(xiàn)KRAS G12C共價抑制劑化 合 物1,其IC50為(4 400±73)nmol · L-1(見圖3A),在結(jié)構(gòu)改造過程中,晶體結(jié)構(gòu)表明在結(jié)合口袋內(nèi),有1個水分子與Thr58側(cè)鏈羥基以及Gly10羰基形成氫鍵(見圖3B)。嘗試在化合物1的哌嗪環(huán)上引入取代基,以替換這一水分子。當取代基為羥基甲基或羥基乙基時,活性并沒有得到顯著改善。當取代基為腈甲基替換水分子時,化合物1的活性提高了約100倍。進一步區(qū)分手性后發(fā)現(xiàn),腈甲基S-構(gòu)型異構(gòu)體MRTX849(2)比R-構(gòu)型活性高100倍,其IC50為(10±2) nmol · L-1。MRTX849與KRAS G12C復合物晶體結(jié)構(gòu)表明(見圖3C),腈甲基S-構(gòu)型取代物替換了Thr58側(cè)鏈羥基與Gly10羰基之間的水分子。這一水分子的替換,使得MRTX849的活性較化合物1提高了約400倍。

    圖3 KRAS G12C抑制劑MRTX849的發(fā)現(xiàn)過程Figure 3 Discovery of KRAS G12C inhibitor MRTX849

    2.1.2 布魯頓酪氨酸激酶抑制劑的設(shè)計BTK是非受體酪氨酸激酶家族的成員,在B淋巴細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突細胞、紅細胞、血小板和造血干細胞中表達。研究表明BTK是B細胞抗原受體(B-cell receptor,BCR)信號傳導和激活的關(guān)鍵信號蛋白。抑制BTK有望治療類風濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病[21]。武田制藥公司研究人員通過基于片段的藥物設(shè)計得到化合物3(IC50= 0.1 μmol · L-1)[3](見圖4A),根據(jù)化合物3與BTK的復合物結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)吡啶與P-loop上Phe413和Gly414氨基酸殘基形成水分子介導的氫鍵作用(見圖4B)。據(jù)此設(shè)計了一系列雙環(huán)雜環(huán)取代該水分子。其中,吲哚取代的化合物4活性減弱(IC50= 850 nmol · L-1),而吡唑環(huán)取代的化合物5活性提高(IC50= 0.012 nmol · L-1)。在吡唑環(huán)的5位上進一步引入甲基,得到化合物6,IC50活性又提高至4 nmol · L-1?;衔?對淋巴細胞特異性蛋白酪氨酸激酶(lymphocyte-specific protein tyrosine kinase,Lck)的選擇性達到了100倍以上,對RAJI細胞中BTK自磷酸化的抑制作用,化合物5和6細胞活性分別為92和28 nmol · L-1。從化合物6與BTK復合物晶體結(jié)構(gòu)(見圖4C)表明,吡唑環(huán)取代了水分子,環(huán)上的2個氮原子分別與Phe413和Gly414形成氫鍵相互作用。值得注意的是,相較于吡唑環(huán)取代的化合物5,吲哚取代的化合物4僅缺少1個氮原子形成的氫鍵,在替換水分子后活性不但沒有提升,反而下降。當化合物為吡唑環(huán)時,替代水分子并形成氫鍵,才提高了化合物的活性。

    圖4 布魯頓酪氨酸激酶抑制劑的結(jié)構(gòu)改造過程Figure 4 Structural modification of BTK inhibitors

    2.1.3 血小板衍生生長因子受體β抑制劑的發(fā)現(xiàn)PDGFR是酪氨酸激酶家族中開發(fā)臨床有效抑制劑的主要靶標之一。Horbert等[4]在PDGFRβ抑制劑化合物7的結(jié)構(gòu)優(yōu)化過程中,用同源模建方法構(gòu)建了PDGFR激酶結(jié)構(gòu)域的蛋白結(jié)構(gòu),通過分子對接研究先導化合物結(jié)合模式,并合成了化合物進行驗證。在構(gòu)效關(guān)系分析中,發(fā)現(xiàn)僅從分子對接結(jié)合模式,并不能解釋化合物在PDGFR疏水口袋I(PDGFR hydrophobic pocket I,PDGFR HPI)的構(gòu)效關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn),分析這種現(xiàn)象可以用取代水分子的熱力學貢獻來解釋。通過WaterMap軟件計算發(fā)現(xiàn),在HPI有一系列的水位點尚未被利用(見圖5A)。其中,位于苯環(huán)間位的3個水位點自由能,分別為5.5、9.9和25.8 kJ · mol-1,屬于高能的水位點,而在對位的水位點是低自由能的水位點,其自由能為-15.9 kJ · mol-1。在化合物7的苯環(huán)上的間位和對位進行取代,嘗試替換水位點。研究發(fā)現(xiàn)在對位引入氯或甲氧基得到化合物8和9,替換低自由能的穩(wěn)定水位點,化合物8和9的活性反而下降,分別為31和228 μmol · L-1。當取代基為羥基得到化合物10,由于可以替代穩(wěn)定水分子的作用,化合物10的活性提高了80倍,IC50為0.1 μmol · L-1。引入氯或甲氧基替換間位的高能水時,都可以起到增強活性的效果,化合物11和12的活性提高5 ~ 10倍。在對位引入羥基替代低能量的水分子,在間位引入甲氧基替換高能不穩(wěn)定的水分子,優(yōu)化得到化合物13,活性提高了40倍,IC50為20 nmol · L-1。綜上所述,由于位于化合物鄰位的水分子的自由能高,化合物的鹵素或甲氧基取代后增加了活性,位于對位的水分子自由能低,只有被羥基替代,才能降低結(jié)合自由能,提升化合物的結(jié)合能力。

    圖5 血小板衍生生長因子受體β抑制劑的結(jié)構(gòu)優(yōu)化過程Figure 5 Structural optimization of PDGFRβ inhibitors

    2.2 替換水分子增強選擇性

    阿爾茨海默病常見的病理特征是淀粉樣β肽(amyloid β,Aβ)組成的淀粉樣斑塊,而Aβ是由BACE1和淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)產(chǎn)生[22]。BACE1是治療阿爾茨海默病的極具前景的靶標之一。BACE2是BACE1的同源蛋白,研究表明BACE2在外周組織和大腦中有多種作用,長期抑制BACE2可能會引起一系列的副作用。然而,序列分析表明,BACE2與BACE1的序列一致性和相似性分別為55%和71%,配體結(jié)合口袋周圍殘基的一致性和相似性更是高達78%和88%,這給選擇性抑制BACE1的 研發(fā)帶來了難題。Fujimoto等[14]通過MOE軟件溶劑分析模塊計算,發(fā)現(xiàn)在BACE1中,Ser35和Tyr71間的區(qū)域有2個水分子能量較高,自由能分別為5.6和1.4 kcal · mol-1。然而在BACE2中,這2個水分子的自由能較低,分別為-2.3和-0.2 kcal · mol-1。依據(jù)此項計算,將二氫-1,3-嗪類化合物14進行頭部改造(見圖6A),在4位增加線性的丙炔基取代,得到化合物15,盡管其對于BACE1的活性略微降低,但選擇性大幅提升,對BACE2的活性從166 nmol · L-1降低至1 778 nmol · L-1?;衔?4與15與BACE1的復合物晶體結(jié)構(gòu)表明,化合物15的丙炔基成功取代了S2’口袋中的1個水分子(見圖6B和6C),除此之外并沒有和氨基酸殘基形成相互作用。盡管BACE1和BACE2在S2’口袋的殘基類似,但其中的水位點自由能有明顯差異,BACE2的水分子與殘基緊密結(jié)合,屬于低能水,而BACE1的結(jié)合比較松散,屬于高能水分子。從水位點的自由能可以解釋化合物15選擇性大幅提高的原因。在后續(xù)的結(jié)構(gòu)優(yōu)化中,保留了丙炔基取代,將腈替換為氟甲氧基,并引入螺環(huán)以穩(wěn)定生物活性構(gòu)象,得到的化合物16,其對BACE1的IC50為24 nmol · L-1,對BACE2 的IC50為2 570 nmol · L-1,選擇性從原來的5.2倍提高到107倍[14]。

    圖6 β位淀粉樣前體蛋白裂解酶1抑制劑的發(fā)現(xiàn)過程Figure 6 Discovery of BACE1 inhibitors

    2.3 替換水分子改善親脂效率

    化合物17(見圖7A)是酪氨酸蛋白激酶A(tyrosine kinase A, TRKA)變構(gòu)抑制劑,對于TRKA具有良好的活性及選擇性,但親脂效率(lipophilic efficiency,LipE)僅為2.2,有較大的提升空間。Bagal等[17]通過使用WaterMap軟件分析其共晶結(jié)構(gòu)(PDB ID:6D1Y),發(fā)現(xiàn)在激酶的鉸鏈區(qū)有一系列自由能較高的水分子,而在吡唑甲基位置,Arg738附近有一系列自由能低的穩(wěn)定水分子(見圖7B)??紤]以上2個因素,設(shè)計了7 000個分子進行分子對接,選擇并合成了打分較高的100個分子并進行細胞實驗,發(fā)現(xiàn)了化合物18的活性較17顯著提高,對TRKA的IC50達到50 nmol · L-1,并保持了比TRKB/C高80倍的TRKA選擇性。同時由于親水基團的取代,油水分配系數(shù)增加(logD = 2.3),化合物18的親脂效率得到了提高(LipE = 5.0)?;衔?8與TRKA的共晶結(jié)構(gòu)表明(見圖7C),吡啶上的甲基被甲酰胺取代后,與側(cè)鏈形成氫鍵相互作用,替換了Arg738附近穩(wěn)定的水分子。

    圖7 酪氨酸蛋白激酶A變構(gòu)抑制劑的結(jié)構(gòu)改造過程Figure 7 Structural modification of TRKA allosteric modulator

    2.4 通過替換水分子優(yōu)化化合物藥動學性質(zhì)

    酪氨酸激酶2(tyrosine kinase 2,TYK2)是JAK激酶家族(Janus kinase,JAK)成員之一,該家族還包括JAK1、JAK2和JAK3。JAK非受體酪氨酸激酶家族在介導引起炎癥的多種細胞因子的信號傳導中起關(guān)鍵作用。JAK激酶的小分子抑制劑有望治療各種嚴重炎癥和自身免疫性疾病。大部分JAK抑制劑都是與激酶的腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)結(jié) 合 位 點JH1結(jié)構(gòu)域結(jié)合,通過阻斷ATP下游磷酸化,以及由此產(chǎn)生的信號通路轉(zhuǎn)導來阻止激酶的催化活性[23]?;衔?9(見圖8A)選擇性地與TYK2的假激酶(pseudokinase)JH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合,抑制TYK2的功能。這種別構(gòu)位點的結(jié)合,使得化合物19在實現(xiàn)最大功效的同時,具有對于其他激酶的高選擇性。化合物19對TYK2 JH2結(jié)構(gòu)域有良好的親和力(IC50= 0.5 nmol · L-1),對TYK2、JAK1、JAK2和JAK3的JH1結(jié)構(gòu)域具有良好的選擇性(IC50>10 000 nmol · L-1),對其他激酶家族成員也有很好的選擇性?;衔?9在進入臨床前的結(jié)構(gòu)優(yōu)化過程中,研究人員通過分析化合物19與TYK2的晶體復合物結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)(見圖8B),化合物19的甲基砜占據(jù)了由Pro694與Leu741的側(cè)鏈,以及Asn739主鏈形成的疏水口袋。在甲基砜的側(cè)面,Gln597和Arg738之間有1個水分子,與化合物的N-氘代甲基甲酰胺羰基氧和砜基上的氧形成氫鍵。針對這一結(jié)構(gòu)特點,嘗試替換分子。設(shè)計思路是將氫鍵受體連接到砜基的鄰位,替換水分子并與Arg738形成氫鍵相互作用。首先用甲氧基替換砜基得到化合物20(IC50= 5.2 nmol · L-1),盡管20活性比19低,但由于化合物20的極性表面積更小,是探索替換水更佳的起點。在化合物20的基礎(chǔ)上,在甲氧基的鄰位嘗試不同取代基。當甲氧基的鄰位是氰基、羧基、酰胺以及甲酰胺時,活性都得到了提升,與化合物19的抑制活性相當,但人全血(human whole blood,hWB)結(jié)合能力依然不高(IC50= 3 270 nmol · L-1)。盡管酰胺取代的化合物在后續(xù)的實驗中發(fā)現(xiàn)微粒體穩(wěn)定性差以及滲透性差,酰胺取代類化合物與TYK2 JH2晶體復合物的結(jié)構(gòu)表明(見圖8C),酰胺取代基通過與Arg738形成氫鍵,成功替換了Gln597和Arg738之間的結(jié)構(gòu)水分子,且沒有降低化合物的親和力。在后續(xù)的優(yōu)化中,繼續(xù)保留了與Arg738的相互作用并優(yōu)化與酰胺相關(guān)的微粒體穩(wěn)定性及滲透性問題,最終得到化合物BMS-986165(21),在保持TYK2 JH2活性的基礎(chǔ)上,與起始化合物19相比,細胞活性IC50提高了5倍;對hWB的IC50為13 nmol · L-1,活性提高了10倍[19]。

    圖8 酪氨酸蛋白激酶2 JH2抑制劑BMS-986165的發(fā)現(xiàn)過程Figure 8 Discovery of TYK2 JH2 inhibitor BMS-986165

    2.5 替換水分子導致化合物活性或選擇性下降

    并不是所有水分子的替換都是有利的,有時候替換水分子也會帶來相反效果,可能造成化合物活性的下降,或選擇性降低。以下是2個替換水分子造成活性減弱,以及選擇性降低的案例:1)研究人員對PGDS抑制劑進行結(jié)構(gòu)改造,以替換口袋中的水分子,雖然晶體結(jié)構(gòu)表明成功替換了結(jié)合口袋中的水分子,但活性測試卻發(fā)現(xiàn)水分子的替換造成了化合物活性的顯著降低。2)pan-TRK抑制劑對激酶家族的選擇性不高,研究人員選擇的是不替換水分子的策略,以提高抑制劑的選擇性,如果替換口袋中的水分子,雖然化合物活性略微提高,但其選擇性將大幅下降。

    2.5.1 替換水分子減弱前列腺素合成酶抑制劑活性PGDS將環(huán)氧合酶(cyclooxygenase,COX)產(chǎn)生的前列腺素H-2(prostaglandin H-2,PGH-2)轉(zhuǎn)化為前列腺素D-2(PGD-2),介導細胞的過敏和炎癥反應。PGDS分為造血性前列腺素合成酶(hematopoietic PGDS,H-PGDS)和脂蛋白性前列腺素合成酶(lipocalin PGDS,L-PGDS)2種類型,選擇性H-PGDS抑制劑被認為是潛在的抗過敏和抗炎藥[24-25]。H-PGDS的晶體結(jié)構(gòu)表明,抑制劑的結(jié)合口袋氨基酸殘基Thr159側(cè)鏈羥基與Leu199主鏈之間,有1個保守的水分子(w1),與抑制劑的氮形成氫鍵,w1與第2個水分子(w2)形成氫鍵,介導了第3個水分子(w3)與Ile155主鏈形成的鹽橋并構(gòu)成氫鍵網(wǎng)絡(見圖9)。輝瑞公司在化合物22的構(gòu)效關(guān)系探索過程中(見圖9A)[5],嘗試在異喹啉環(huán)引入取代基,替換口袋中的水分子。隨后在異喹啉的3位上引入甲基后,化合物23的結(jié)合活性較22略微降低,從原來的2.34 nmol · L-1變?yōu)?.26 nmol · L-1。從在化合物23與H-PGDS的晶體結(jié)構(gòu)中(見圖9B),甲基替換了水網(wǎng)絡的水分子w2。將異喹啉環(huán)改為萘環(huán)并在原來氮的位置上加上取代基,以替換水網(wǎng)絡的水分子w1。晶體結(jié)構(gòu)表明,羥基甲基(化合物24)和氨基甲基(化合物25)均能夠起到替換w1水分子的作用,替代原來的水分子與Thr159、Leu199以及w2形成氫鍵(見圖9C和9D)。然而,盡管成功替換了水分子w1,化合物的活性卻大大降低,化合物24的活性(IC50= 1 480 nmol · L-1)相較化合物22降低,化合物25的活性(IC50= 845 nmol · L-1)相較化合物22降低[5](見圖9C和9D)。

    圖9抑制劑22~25與造血性前列腺素合成酶的構(gòu)效關(guān)系探索Figure 9 Exploration of the structure-activity relationship of H-PGDS inhibitors 22~25

    2.5.2 替換水分子導致泛酪氨酸激酶受體原肌球蛋白激酶抑制劑選擇性降低由于慢性疼痛疾病的神經(jīng)營養(yǎng)因子(nerve growth factor,NGF)通過TRK家族發(fā)出信號,TRK激酶抑制劑有望成為調(diào)節(jié)慢性疼痛的靶標[26]。輝瑞公司研發(fā)的化合物26[20](見圖10A),對TRK家族具有良好的抑制活性,對TRKA、TRKB、TRKC的細胞活性IC50分別為6、2和1 nmol · L-1。但化合物26的選擇性不佳,對于其他激酶也有結(jié)合,其激酶選擇性基尼分數(shù)(Gini score,GS)為0.59。為了提高化合物的激酶選擇性,設(shè)計減少化合物與鉸鏈區(qū)的氫鍵作用。從晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)化合物26的氨基吡咯并嘧啶環(huán)與Glu590產(chǎn)生氫鍵相互作用(見圖10B)。與TRKA未結(jié)合抑制劑化合物21的晶體結(jié)構(gòu)對比(見圖10C),發(fā)現(xiàn)化合物26氨基吡咯并嘧啶環(huán)上的氨基,替換TRKA蛋白中該位置的1個保守水分子(見圖10C)。研究人員設(shè)計將氨基去除,不替換保守水分子而只形成1個由該水分子介導的氫鍵。去除氨基的化合物27,其抑制活性略微降低,而激酶選擇性顯著提高,GS提高到0.82。如果選擇替換水分子,雖然可以略微提高化合物結(jié)合能力,但化合物激酶選擇性將降低。

    圖10 泛酪氨酸激酶受體原肌球蛋白抑制劑的結(jié)構(gòu)改造過程Figure 10 Structural modification of pan-TRK inhibitors

    3 計算水位點性質(zhì)相關(guān)方法及軟件

    發(fā)現(xiàn)口袋中水位點,并評價位點中的水分子是否適宜于被替換,對于利用替換水的方法進行SBDD至關(guān)重要。盡管蛋白口袋中的水分子位置可以從晶體結(jié)構(gòu)中得知,但晶體結(jié)構(gòu)中的水分子有時并不準確,特別是在分辨率不高的情況下,有可能只是假象或錯誤指認的電子密度[27-28]。隨著計算方法的發(fā)展以及計算機性能的提高,許多計算方法都可以較為準確地放置水分子,一些軟件在測試中已經(jīng)可以與高分辨率的晶體水分子相符[10-12]。值得注意的是由于晶體與實際溶液狀態(tài)的差異,一些計算軟件預測的并不是晶體狀態(tài)下水分子的分布。此外,僅從晶體結(jié)構(gòu),也無法判斷出替換活性口袋中的水分子是否能夠增強小分子的結(jié)合活性。

    理論計算是預測水分子位點及其性質(zhì)的重要手段,已發(fā)展了多種方法和相關(guān)軟件工具。包括簡單地基于晶體結(jié)構(gòu)中的水分子進行評分、基于格點的取樣方法以及基于分子動力學模擬的方法等。這些方法和軟件的計算速度不同,計算準確度也各有差異,有著不同的適用范圍。

    其中,基于知識的方法直接通過評價晶體里水與周圍環(huán)境的相互作用,預測該水分子是否容易被替換,其代表性的程序有Rossato等[29]開發(fā)的AQUARIUS、Raymer等[30]開 發(fā) 的Consolv、Verdonk等[31]開發(fā)的SuperStar以及Kellogg等[32]開發(fā)的WaterRank等。這些方法直接計算晶體結(jié)構(gòu)中現(xiàn)有水的性質(zhì),但不能預測水位點的位置。

    基于格點方法的程序通常使用格點來分析單個水放置的最佳位點,計算速度也比較快,代表程序有3D-RISM[15]、 SZMAP[33]、 WaterFLAP[34]等。其中3D-RISM根據(jù)液體在巨正則系綜的密度泛函理論,在蛋白周圍產(chǎn)生近似的溶劑分布,通過對自洽方程的評估給出水分子可能的位置。SZMAP在格點上計算泊松-玻爾茲曼的有效勢,然后用單個水分子作為探針在不同方向上取樣,通過這種方法來計算轉(zhuǎn)動和平動熵的貢獻。WaterFLAP使用格點分子相互作用場來定位水分子的位點,并使用一系列經(jīng)驗參數(shù)來計算水位點的能量。由于基于格點的方法把水分子近似為獨立的粒子,并不嘗試生成多個水的所有可能位置?;诟顸c的方法通常不需要耗費較大的計算資源,因此在平臺軟件以及當計算任務很多時被廣泛采用。

    基于模擬采樣的方法是通過數(shù)值計算生成多個水分子所有可能的構(gòu)象,并通過統(tǒng)計分析方法找到最低的能量以及位置,代表性的軟件有薛定諤的WaterMap[35],通過將蛋白置于水盒子中進行分子動力學(molecular dynamics,MD)模擬,分析軌跡找出水位點,然后通過非均相溶劑化理論(inhomogeneous solvation theory,IFT)[36]計算這些水位點的自由能。除了MD模擬方法,還可以采用蒙特卡洛方法,如GCMC方法[37]、雙重解耦-蒙特卡洛[38]等。基于模擬的方法優(yōu)勢在于可以描述出復雜的水分子網(wǎng)絡,并解析出水分子的熱力學性質(zhì)。這個過程中需要MD模擬或者蒙特卡洛方法對水分子進行采樣,因此需要耗費較大的計算資源,但有研究表明比前2種方法具有更高的準確性[16]。

    4 結(jié)語與展望

    通過替換靶標結(jié)合口袋中的水分子指導藥物設(shè)計,近年來在一系列分子的結(jié)構(gòu)優(yōu)化中,已經(jīng)成功地指導結(jié)構(gòu)改造,提高了配體結(jié)合能力、選擇性以及藥動學等性質(zhì)。此外,隨著結(jié)構(gòu)生物學、計算機科學的發(fā)展,通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),預測水位點自由能的計算方法變得越來越準確快速,也大力推動了水分子替換這一方法在SBDD中的應用。

    盡管利用水分子指導藥物設(shè)計目前取得了一系列進展,但還有很大的發(fā)展空間。首先,目前大部分研究中對于口袋中的水分子考慮較少,在SBDD過程中僅考慮化合物和蛋白的相互作用。其次,僅晶體結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)水分子,而較少計算這些水分子的自由能性質(zhì),因此只能通過實驗嘗試不同類型的基團,嘗試對水分子進行替換或形成相互作用。最后,利用計算軟件預測水分子自由能,多是在結(jié)果分析用于解釋化合物構(gòu)效,前期用于指導化合物改造較少??傊?,結(jié)合藥物化學、結(jié)構(gòu)生物學和計算機輔助藥物設(shè)計等多種技術(shù),利用口袋中的水分子進行藥物設(shè)計,在未來新藥研發(fā)中將發(fā)揮更為重要的作用。

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