基于TCGA和ICGC數(shù)據(jù)庫構(gòu)建腎透明細胞癌的免疫相關預后模型*

梁德宏，王艷，張全穎，陳燃，謝朝陽，羅海清，李祥勇

(1.廣東醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室/廣東省教育廳醫(yī)學生物活性分子研究重點實驗室，廣東湛江524023；2.廣東醫(yī)科大學醫(yī)學技術(shù)學院，廣東東莞523808；3.廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院腫瘤醫(yī)院，廣東湛江524001)

腎透明細胞癌(kidney clear cell carcinoma，KIRC)起源于腎小管上皮，是腎細胞癌的主要組織病理亞型，具有更高的腫瘤復發(fā)率和轉(zhuǎn)移率[1]。早期KIRC可通過手術(shù)或消融策略成功治愈，但晚期、轉(zhuǎn)移性KIRC患者的總體預后仍然較差[2]。隨著免疫治療的不斷發(fā)展，其應用于KIRC的臨床收益獲得持續(xù)提升，但大多數(shù) KIRC患者仍沒有獲得持久的療效收益，甚至出現(xiàn)免疫相關不良事件，這主要歸因于腫瘤免疫微環(huán)境(tumor microenvironment, TME)的異質(zhì)性和復雜性[3-4]。研究表明，具有強免疫原性的KIRC，其預后模型主要基于病理分期等常規(guī)臨床指標，為最大化免疫治療的臨床獲益，有必要進一步探索KIRC免疫相關生物標志物和TME的特征[5]。因此，在本研究中，筆者擬通過生物信息學的方法篩選出免疫相關的差異表達基因，以此構(gòu)建和驗證KIRC免疫相關預后模型，分析TME特征，以期為KIRC預后管理和免疫治療決策的制定提供重要證據(jù)。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)獲取 基于UCSC Xena平臺( https://xenabrowser.net/datapages/)，下載源自癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)的KIRC隊列(593例樣本)和國際癌癥基因組聯(lián)盟(International Cancer Genome Consortium，ICGC)的KIRC隊列(158例樣本)的mRNA表達數(shù)據(jù)以及對應患者的臨床信息，包括人口統(tǒng)計學指標(年齡、性別等)、預后數(shù)據(jù)(生存時間、死亡狀態(tài)等)和病理參數(shù)等。其中，TCGA的KIRC數(shù)據(jù)集作為目標數(shù)據(jù)集，ICGC的KIRC數(shù)據(jù)集作為驗證數(shù)據(jù)集。

1.2篩選免疫相關的差異表達基因 基于R包limma，對目標數(shù)據(jù)集進行差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)分析，篩選標準為矯正后P值小于0.05和差異倍數(shù)|Fold Change|大于1.5，即被視為DEGs。將得到的DEGs與從免疫學數(shù)據(jù)庫和分析平臺(Immunology Database and Analysis Portal，ImmPort)數(shù)據(jù)庫(https://immport.niaid.nih.gov/)獲取的參考免疫相關基因集取交集，得到免疫相關的DEGs，用于后續(xù)分析。

1.3構(gòu)建免疫相關預后風險模型 基于R包Survival，對免疫相關DEGs與患者總生存時間(overall survival，OS)進行單因子回歸分析，篩選顯著關聯(lián)(P<0.05)的基因作為候選預后因子。接著，通過LASSO cox回歸分析，進一步篩選出重要的預后相關基因及其回歸系數(shù)，以此建立KIRC預后風險評估模型(風險分數(shù)=∑差異基因的回歸系數(shù)λi×歸一化處理后的基因表達量βi)，并利用R包survivalROC繪制ROC曲線來評估預后模型的性能。以真陽性率與假陽性率之間的差值最大處作為最佳風險評分臨界值，將腫瘤樣本分為高風險組和低風險組，通過R包SUR-Miner 繪制兩組的生存曲線。

1.4腫瘤微環(huán)境的評估分析 采用CIBERSORT算法分析22種腫瘤浸潤免疫細胞在高風險組和低風險組的比例，以此評估和比較腫瘤免疫浸潤細胞類型的構(gòu)成和組間差異(通過非配對t檢驗進行)[6]。

1.5構(gòu)建和驗證列線圖 基于R包rms，結(jié)合臨床信息(年齡、性別和腫瘤分期)，對預后風險評分模型進行列線圖模型構(gòu)建，以此分析其在不同患者臨床特征的預后價值。臨床信息、風險評分與OS之間的關系通過森林圖形式展示，其中，一致性指數(shù)(C-index)表明列線圖的預測準確性。

1.6統(tǒng)計學分析 采用R軟件對數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計分析，R包survivalROC繪制ROC曲線并評估預后模型的性能，Wilcoxon檢驗用于檢驗兩組間的差異，生存分析曲線的組間差異采用Log-Rank檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1篩選關聯(lián)預后的免疫相關DEGs 納入TCGA的KIRC隊列為目標數(shù)據(jù)集，共計593個樣本(表1)，對腫瘤組織樣本和癌旁組織樣本的mRNA表達譜進行分析，共發(fā)現(xiàn)694個DEGs，其中326個基因表達上調(diào)(圖1A)。將所得DEGs與ImmPort數(shù)據(jù)庫的參考免疫基因集(1 509個)取交集后，篩選出57個免疫相關的DEGs(圖1B)，進一步通過單因子回歸和LASSO cox回歸分析，得到11個與OS顯著相關的免疫相關DEGs(P<0.05，表2)，以及各個基因?qū)幕貧w系數(shù)(圖1C)。NOS1、ANGPTL3和AVPR1B基因高表達與良好的預后顯著相關，而其他8個基因則相反。根據(jù)多因素回歸分析模型，Akaik信息標準(AIC)為705.42，C指數(shù)為0.71。值得注意的是，僅ANGPTL3與OS顯著相關(P=0.035)，其風險率為0.89(95%CI：0.80～099)，見圖1D。

表1 TCGA KIRC數(shù)據(jù)集的樣本信息[n(%)]

表2 與KIRC預后相關的基因列表(單因素回歸分析)

注：A，TCGA KIRC數(shù)據(jù)集的差異基因分析，橫坐標為差異倍數(shù)的對數(shù)值(以log2為底)，縱坐標為校正后P值的對數(shù)值(以 log10為底)的相反數(shù)；B，差異表達基因(DEGs)和ImmPort參考免疫基因集的交集分析；C，基因的回歸系數(shù)柱狀圖；縱坐標為基因，橫坐標為回歸系數(shù)；D，多因素回歸分析的森林圖；縱坐標為風險因子(基因)，橫坐標為風險因子的風險率。

2.2免疫相關預后模型的搭建 基于11個顯著與OS相關的免疫相關DEGs及其回歸系數(shù)構(gòu)建的免疫相關預后風險模型，將風險得分的閾值設為-0.02，以此將所有KIRC樣本分為高風險組和低風險組(圖2A)。結(jié)合預后數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)高風險組的死亡比例顯著高于低風險組，提示風險評分對評估腎透明細胞癌患者生存狀況具有一定的應用價值(圖2B)。值得注意的是，相比高風險組，低風險組具有更高的總生存時間(P<0.001)，表現(xiàn)出NOS1、ANGPTL3和AVPR1B表達量上調(diào)，而其他8個基因表達量下調(diào)(圖2C～D)。

注：A，高風險組和低風險組的風險曲線，縱坐標代表風險評分，橫坐標代表風險評分等級；B，生存狀況分布，縱坐標代表生存時間(d)，橫坐標代表風險評分等級；C，11個免疫相關DEGs在高風險組和低風險組的比較；D，總生存時間在高風險組和低風險組的比較。

2.3免疫相關預后模型的性能評估和驗證 繪制用于評估免疫相關預后風險模型性能的ROC曲線，發(fā)現(xiàn)該模型在評估3年、4年、5年生存概率的AUCROC分別為0.669、0.707和0.750(圖3A)，且風險評分在KIRC不同腫瘤分期中表現(xiàn)出顯著的差異，傾向于臨床分期越高，則風險評分越高(圖3B)。同時，基于ICGC的KIRC隊列數(shù)據(jù)集，選擇其中具有mRNA表達數(shù)據(jù)和預后信息的腫瘤樣本共158例，以此作為預后模型的驗證集，其中男性100例，女性58例，年齡大于60歲共101例，小于60歲共57例。結(jié)果顯示，在驗證集中，該免疫相關預后風險模型在評估3年、4年、5年生存概率的AUCROC分別為0.628、0.653和0.677(圖3C)，高風險評分與較短生存期顯著相關(P<0.000 1)，見圖3D。

注：A，基于目標數(shù)據(jù)集搭建預后模型用于預測3/4/5年生存率的ROC曲線；B，目標數(shù)據(jù)集中不同臨床分期的腫瘤樣本的風險評分比較；C，預后模型在驗證集中表現(xiàn)出來的預測3/4/5年生存率的ROC曲線；D，基于預后模型給驗證集樣本計算的風險評分的生存分析曲線。

經(jīng)過多因素回歸模型分析，發(fā)現(xiàn)年齡(≥60歲)、腫瘤分期(Ⅲ和Ⅳ期)和基于免疫相關預后模型得到的風險評分均與OS顯著相關，風險評分與腫瘤Ⅲ期的風險率相當，且可通過列線圖估算3年、4年和5年的生存概率(圖4A～B)。通過繪制校準曲線驗證列線圖的性能，可以看出預測曲線接近理想曲線(圖4C)，表明構(gòu)建的列線圖模型性能良好，其預測準確性較先前的免疫相關預后模型得到進一步提高(C指數(shù)：0.78 vs 0.71)。值得注意的是，風險評分對生存時間的風險率(1.93，95%CI：1.59～2.3)比任一單個免疫相關DEGs都高。

注：A，基于目標數(shù)據(jù)集，將患者年齡、性別、病理分期、風險評分分別作為變量預測患者3年、4年和5年生存率的列線圖；B，多因素回歸分析的森林圖；C，分別針對3年、4年和5年的預后模型繪制的校準曲線，灰色直線代表理想狀態(tài)，藍色折線代表實際狀態(tài)。

2.4探索KIRC腫瘤免疫微環(huán)境 基于mRNA表達譜，通過CIBERSORT算法來估算每例KIRC樣本中22種免疫細胞的比例，結(jié)果顯示，12種免疫細胞類型在高風險組和低風險組間的占比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中，漿細胞(plasma cell)、調(diào)節(jié)T細胞(regulatory T cell，Tregs)、單核細胞(Monocyte)等6種細胞的組間差異最為顯著(P<0.000 1，圖5A)。值得注意的是，在高風險組中表現(xiàn)為更高浸潤程度的調(diào)節(jié)T細胞、M0型巨噬細胞(macrophages M0)、活化的記憶CD4+T細胞(T cells CD4 memory activated)與較差的預后相關，同時，在高風險組中浸潤程度更低的休眠樹突狀細胞(dendritic cells resting)則與較好的預后相關(圖5B～E)。

注：A，高風險組(藍色)和低風險組(紅色)免疫細胞浸潤程度的比較，縱坐標為細胞比例，橫坐標為免疫細胞類型；B，M0型巨噬細胞浸潤程度高低在生存時間上的比較分析；C，調(diào)節(jié)T細胞浸潤程度高低在生存時間上的比較分析；D，活化的記憶CD4+T細胞浸潤程度高低在生存時間上的比較分析；E，休眠樹突狀細胞浸潤程度高低在生存時間上的比較分析。

此外，進一步對高風險組和低風險組間免疫檢查點及其配體的表達水平進行分析，結(jié)果表明，相比于低風險組，高風險組中PD-1、CTLA-4和LAG3的表達水平顯著上調(diào)(P<0.000 1),而PD-L1顯著下降(圖6A～D)。

注：A，PD-1的表達量與不同風險評分等級的比較分析；B，PD-L1的表達量與不同風險評分等級的比較分析：C，CTLA-4的表達量與不同風險評分等級的比較分析；D，LAG3的表達量與不同風險評分等級的比較分析。

3 討論

為探索免疫相關分子標志物在KIRC預后中的預測價值，筆者從TCGA的KIRC數(shù)據(jù)集中篩選出11個顯著關聯(lián)KIRC患者總生存時間的免疫相關DEGs。其中包括鮮有被報道的ANGPTL3，在本研究中無論單因素還是多因素回歸分析結(jié)果，均表現(xiàn)出與KIRC預后顯著的關聯(lián)性，且其高表達被證實可抑制腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，進而關聯(lián)更好的預后[7-8]。此外，單因素回歸分析結(jié)果顯示，NOS1和AVPR1B基因的高表達均與良好的預后相關，但在多因素回歸分析中不存在相關性，表明這2個基因?qū)IRC預后的預測價值仍需進一步探索。

鑒于單個免疫相關DEGs對預后結(jié)果的影響程度有限，筆者以這11個免疫相關DEGs構(gòu)建了預后模型，并通過ICGC的KIRC數(shù)據(jù)集進行驗證。結(jié)果顯示，基于該模型得到的風險評分越高，腫瘤分期等級越高，生存時間越短，且風險評分在評估3年、4年、5年生存概率上也表現(xiàn)出一定的預測性能。同時，風險評分對KIRC預后的影響程度相比于單個免疫相關DEGs更強(風險率：1.93 vs 1.37)，且與腫瘤分期Ⅲ期相當(風險率：1.93 vs 1.97)，這進一步支持該模型的臨床應用潛力。

鑒于KIRC中TME異質(zhì)性和復雜性可影響免疫治療的臨床獲益，故而筆者進一步分析了風險評分與TME的關聯(lián)。結(jié)果表明，組間顯著差異的免疫細胞類型高達12種，其中，漿細胞、調(diào)節(jié)T細胞和M0型巨噬細胞在高風險組中表現(xiàn)出更高的浸潤程度，且均與較差的預后相關。其中，調(diào)節(jié)T細胞被認為是KIRC中有效抗腫瘤免疫的主要障礙，可通過負調(diào)節(jié)腫瘤內(nèi)部或外部的免疫和非免疫細胞，限制抗腫瘤免疫反應，進而不利于KIRC患者的預后結(jié)果[9]。同時，相比低風險組，在高風險組中，浸潤程度更高的活化的記憶CD4+T細胞和M0型巨噬細胞與較差的預后相關，而浸潤程度較低的休眠樹突狀細胞，則與較好的預后相關，這與先前的研究結(jié)論相一致[10]。此外，筆者還分析了免疫檢查點及其配體的表達情況，發(fā)現(xiàn)高風險組中PD-1、CTLA-4和LAG3顯著上調(diào)，而PD-L1顯著下調(diào)。以上結(jié)果表明與風險評分相關聯(lián)的調(diào)節(jié)T細胞、休眠樹突狀細胞、記憶CD4+T細胞、M0型巨噬細胞和免疫檢查點可能是KIRC的獨立預后因素，有望為預后管理和免疫治療提供證據(jù)。

本研究存在以下局限性，一是研究數(shù)據(jù)均源自TCGA數(shù)據(jù)庫，樣本來源以白人為主，該結(jié)果是否適用于黃種人尚需驗證；二是研究數(shù)據(jù)的來源人群以60歲以上的男性為主，或許僅限這小部分人群可得到結(jié)果復現(xiàn)和應用；三是該模型的應用價值還需要進一步的臨床研究驗證。

綜上所述，本研究聚焦于KIRC患者群體，基于11個關聯(lián)OS的免疫相關DEGs構(gòu)建和驗證了1個性能良好的KIRC免疫相關預后風險模型，并在此基礎上，探索不同風險評分下的TME特征，有望為KIRC患者的臨床風險分層和免疫治療決策提供支持。