春夏季茶樹兒茶素生物合成基因表達(dá)差異

黃芳芳，熊立瑰,3，李 瑩，劉仲華,3，黃建安,3,*，李 娟,3,*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心， 湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.湖南省植物功能成分利用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

類黃酮是植物體內(nèi)主要的次生代謝產(chǎn)物，具有重要的生理作用，如調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素的運(yùn)輸、紫外線防護(hù)、幫助植物防御病原體和抵抗不良環(huán)境等[1-2]，茶樹體內(nèi)豐富的兒茶素類屬于類黃酮類物質(zhì)，兒茶素類在茶樹體內(nèi)的分布和積累受到多方面的調(diào)控，不同發(fā)育階段兒茶素類的含量存在差異且不同器官中呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律[3]；光質(zhì)和光強(qiáng)影響兒茶素類的合成，遮光條件下兒茶素類含量下降[4]；不同茶樹品種兒茶素類含量也具有較高的變異性[5]。苯丙烷生物合成途徑是植物中最典型的次生代謝途徑之一，兒茶素類是苯丙烷生物合成途徑的衍生物[6]。如圖1所示，苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）的作用下脫氨生成反式肉桂酸，反式肉桂酸通過肉桂酸羥化酶（cinnamate 4-hydroxylase，C4H）催化的氧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化成對(duì)香豆酸，4-香豆酸CoA連接酶（4-coumaroyl，4CL）激活硫酯化反應(yīng)將對(duì)香豆酸轉(zhuǎn)化成香豆酰CoA，然后進(jìn)入類黃酮生物合成途徑生成非酯型兒茶素[7]。查耳酮合成酶（chalcone synthase，CHS）可以催化香豆酰CoA和丙二酰CoA轉(zhuǎn)變成查耳酮，查耳酮在查耳酮異構(gòu)酶（chalcone isomerase，CHI）的催化下C環(huán)閉合異構(gòu)化形成黃烷酮，黃烷酮在黃烷酮3-羥化酶（flavanone 3-hydroxylase，F(xiàn)3H）、類黃酮3′-羥化酶（flavonoid 3′-hydroxylase，F(xiàn)3′H）以及類黃酮3′,5′-羥化酶（flavonoid 3′,5′-hydroxylase，F(xiàn)3′5′H）的催化下發(fā)生羥基化反應(yīng)形成二氫黃酮醇，二氫黃酮醇4-還原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）可將二氫黃酮醇還原成無(wú)色花青素，無(wú)色花青素在無(wú)色花色素還原酶（leucoanthocyanidin reductase，LAR）、花青素合成酶（anthocyanidin synthase，ANS）以及花青素還原酶（anthocyanidin reductase，ANR）的作用下形成非酯型兒茶素，進(jìn)一步形成酯型兒茶素[8-9]。茶樹酯型兒茶素的沒食子酰基化合成途徑涉及兩步反應(yīng)，第1步為沒食子酰基的活化，即葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucose:galloyl-1-O-β-D-glucosyltransferase，UGGT）催化沒食子酸（gallic acid，GA）和尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-glucose，UDPG）形成沒食子酰基葡萄糖，第2步是沒食子?；霓D(zhuǎn)移，沒食子?；咸烟呛?,3-順式黃烷-3-醇在表兒茶素沒食子酰基-葡萄糖-O-沒食子?；D(zhuǎn)移酶（epicatechin:1-O-galloyl-β-D-glucose-O-galloyltransferase，ECGT）的作用下形成酯型兒茶素[10-12]。

圖 兒茶素生物合成途徑Fig. 1 Catechin biosynthetic pathways

兒茶素類生物合成酶編碼基因的相對(duì)表達(dá)量在不同嫩度的茶樹鮮葉以及茶樹不同組織中的表達(dá)差異受到了廣泛的關(guān)注[13-15]，白化茶樹葉片發(fā)育不同時(shí)期兒茶素類水平及相關(guān)基因表達(dá)的變化也有報(bào)道[16]，Liu Min等[17]研究了春秋季不同茶樹品種的兒茶素類含量與調(diào)控兒茶素合成酶基因表達(dá)的相關(guān)性，但是春夏季茶樹品種兒茶素生物合成相關(guān)基因表達(dá)的差異尚鮮見報(bào)道。福鼎大白茶、櫧葉齊為國(guó)家級(jí)良種，在全國(guó)范圍內(nèi)推廣面積大，品質(zhì)穩(wěn)定[18-19]，碧香早與白毫早為湖南省主栽茶樹品種，茶樹生長(zhǎng)速度快、適應(yīng)性較強(qiáng)[20]，因此本研究選取福鼎大白茶、白毫早、碧香早、櫧葉齊茶樹品種為原料，研究春夏季茶樹體內(nèi)兒茶素類含量以及兒茶素類生物合成基因表達(dá)的差異，旨在探究春茶和夏茶之間兒茶素類含量與生物合成基因之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

福鼎大白茶、白毫早、碧香早、櫧葉齊茶樹鮮葉，采摘時(shí)間為2020年3月28日和7月24日，采摘標(biāo)準(zhǔn)為一芽二葉，采摘地點(diǎn)為湖南省茶葉研究所高橋?qū)嶒?yàn)茶場(chǎng)。鮮葉采摘后迅速用液氮冷凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

N,N-二甲基甲酰胺（色譜純） 天津市化學(xué)試劑研究所；冰醋酸（色譜純）、甲醇（色譜純）、碳酸鈉、福林-酚試劑 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；GA標(biāo)準(zhǔn)品（90.34%）、兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品、可可堿標(biāo)準(zhǔn)品（95%）、茶堿標(biāo)準(zhǔn)品（99%） 美國(guó)Sigma公司；RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒 天根生化科技有限公司；PrimeScriptTMRT Master Mix（TaKaRa）、TB Green?Premix ExTaq? II（TaKaRa） 上海百賽生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

真空冷凍干燥儀 美國(guó)熱電公司；LC-2010AHT高效液相色譜儀、UV-2250紫外分光光度計(jì) 日本島津公司； MS204TS/00型電子分析天平 美國(guó)Mettler Toledo公司； DSY-2-8水浴鍋 常州國(guó)華有限公司；低速離心機(jī) 北京雷勃爾離心機(jī)有限公司；QuantStudioTM3熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、Nanodrop 2000/2000c核酸濃度測(cè)定儀 賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 兒茶素組分以及茶多酚含量的測(cè)定

茶樹鮮葉真空冷凍干燥后用研磨機(jī)研磨成粉末，用于提取茶湯，茶多酚的測(cè)定參照GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》，測(cè)定兒茶素組分的茶湯采用水提，即稱取0.6 g茶粉（準(zhǔn)確至0.000 1 g）于100 mL錐形瓶中，加入90 mL沸蒸餾水后立即移入沸水浴中，浸提45 min（每隔10 min搖動(dòng)一次），浸提完畢后趁熱過濾，冷卻后定容至100 mL，茶湯過0.45 μm濾膜后，采用高效液相色譜方法測(cè)定兒茶素組分，色譜程序參照文獻(xiàn)[21]。

1.3.2 RNA提取和cDNA的合成

樣品總RNA提取采用RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒（TIANGEN），RNA濃度的測(cè)定通過Nanodrop 2000/2000核酸濃度測(cè)定儀，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。采用PrimeScriptTMRT reagent Kit （TaKaRa）合成cDNA并于-20 ℃保存待用。實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）分析采用TB Green?Premix ExTaqTMII（Tli RNaseH Plus）試劑盒（TaKaRa），每個(gè)樣品重復(fù)3 次。所用引物參照已發(fā)表的文獻(xiàn)，內(nèi)參基因?yàn)镚APDH，序列如表1所示。

表1 real-time PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for real-time PCR

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 8作圖，基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算，SPSS 25.0分析數(shù)據(jù)，春夏季兒茶素組分、茶多酚含量以及基因相對(duì)表達(dá)量比較運(yùn)用t檢驗(yàn)，不同品種茶樹鮮葉基因表達(dá)量的差異采用單因素方差分析，根據(jù)Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，Pearson相關(guān)系數(shù)作相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 春夏季茶樹茶多酚含量分析

茶樹體內(nèi)豐富的多酚類物質(zhì)是茶樹新陳代謝的特征產(chǎn)物，茶多酚含量決定茶葉的品質(zhì)風(fēng)格，本研究測(cè)定不同品種茶樹春夏季茶多酚的含量，圖2結(jié)果表明，夏季茶多酚的含量極顯著高于春季（P＜0.01），這與已有研究中茶樹新梢中茶多酚含量夏梢＞秋梢＞春梢[25-26]結(jié)果相似。隨著夏季氣溫升高，光照增強(qiáng)，茶樹體內(nèi)的碳素代謝增強(qiáng)，因此茶多酚含量較高[26]。

圖2 茶多酚含量Fig. 2 Polyphenol contents of tea shoots from different cultivars

2.2 兒茶素組分含量分析

兒茶素的組成及含量反映茶樹的品質(zhì)[27]，茶樹體內(nèi)主要的兒茶素組分包括：C、EC、EGC、EGCG、ECG、沒食子兒茶素（gallocatechin，GC）、GCG[28]。本研究采用高效液相色譜法測(cè)定以下兒茶素組分的含量，其中包括非酯型兒茶素（EGC、D,L-兒茶素（D,L-catechin，D,L-C）和EC）以及酯型兒茶素（EGCG、GCG、ECG）。如表2所示，酯型兒茶素含量高于非酯型兒茶素，夏季非酯型兒茶素和酯型兒茶素類含量均高于春季，且不同茶樹品種春夏季非酯型兒茶素的差異均具有顯著差異（P＜0.01），由此可知，夏季兒茶素總量（所測(cè)定兒茶素組分含量的總和）也高于春季。春季酯型兒茶素所占比例為79.52%～84.45%，夏季酯型兒茶素所占比例為67.96%～73.81%，夏季酯型兒茶素的比例低于春季，非酯型兒茶素的比例高于夏季。如圖3所示，酯型兒茶素組分中EGCG含量最高，非酯型兒茶素中EGC含量最高，D,L-C以及EC含量較低，這與前人報(bào)道一致[29]。夏季兒茶素組分中EGC、D,L-C、EC及ECG的含量高于春季且春夏季EGC、EC、ECG的含量存在顯著差異，早期研究結(jié)果表明，同位素標(biāo)記的EC滲入茶樹主要轉(zhuǎn)化成EGC，因此這可能是夏季茶樹鮮葉中EGC含量高于春季的原因[8]。

圖3 兒茶素組分含量Fig. 3 Contents of catechins in tea shoots from different cultivars

表2 兒茶素組分含量及比例Table 2 Contents and percentages of catechins in tea shoots from different cultivars

2.3 茶樹兒茶素類生物合成基因相對(duì)表達(dá)量

對(duì)兒茶素生物合成相關(guān)基因PAL、C4H、CHS、

F3H、F3′5′H、F3′H、DFR、LAR、ANS、ANR、4CL、UGT84A、UGGT的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖4 所示。F3H與DFR基因相對(duì)表達(dá)量有春季高于夏季的趨勢(shì)；白毫早LAR基因相對(duì)表達(dá)量夏季顯著高于春季 （P＜0.01），LAR催化無(wú)色花青素形成C，因此這可能是白毫早夏季D,L-C含量顯著高于春季的原因。F3′5′H基因與LAR基因表達(dá)趨勢(shì)一致，相對(duì)表達(dá)量均表現(xiàn)為福鼎大白茶、白毫早、碧香早中夏季極顯著高于春季 （P＜0.01），櫧葉齊中相對(duì)表達(dá)量為春季高于夏季，春季不同品種間相對(duì)表達(dá)量為碧香早＞櫧葉齊＞福鼎大白茶＞ 白毫早，夏季不同品種間相對(duì)表達(dá)量表現(xiàn)為碧香早＞ 福鼎大白茶＞白毫早＞櫧葉齊；PAL與4CL基因表達(dá)趨勢(shì)一致，福鼎大白茶、碧香早、櫧葉齊中相對(duì)表達(dá)量夏季高于春季，白毫早中相對(duì)表達(dá)量春季極顯著高于夏季 （P＜0.01），春季不同品種白毫早的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于其他品種（P＜0.01），夏季不同品種間表達(dá)量為碧香早＞福鼎大白茶＞櫧葉齊＞白毫早；ANS基因與F3′H基因表達(dá)趨勢(shì)一致，福鼎大白茶、櫧葉齊、白毫早中相對(duì)表達(dá)量春季高于夏季，碧香早中相對(duì)表達(dá)量夏季極顯著高于春季（P＜0.01）。

圖4 兒茶素代謝相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量Fig. 4 Relative expression levels of genes related to catechin metabolism

根據(jù)基因相對(duì)表達(dá)量的結(jié)果，以春季白毫早樣品為參照，計(jì)算樣品各基因相對(duì)表達(dá)量的差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C），并進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換（log2FC），結(jié)果如圖5所示，3月28日白毫早樣品ANS、C4H、CHS、UGT84A相對(duì)表達(dá)量與其他樣品存在差異（log2FC≤ -1），其F3′5′H基因相對(duì)表達(dá)量與其他樣品也存在差異（log2FC≥1）。由此可知，基因的表達(dá)不僅受季節(jié)的影響，還受到品種的影響。

圖5 基因相對(duì)表達(dá)量的log2FC值Fig. 5 log2FC values of relative gene expression

對(duì)兒茶素組分及總量與兒茶素生物合成基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果見表3。結(jié)果表明LAR、F3′5′H基因相對(duì)表達(dá)量與EGCG、ECG含量以及兒茶素總量存在極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。此外，F(xiàn)3H基因相對(duì)表達(dá)量與EGC含量存在極顯著正相關(guān) （P＜0.01），ANR、UGT84A基因相對(duì)表達(dá)量與D,L-C含量存在極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），UGGT基因相對(duì)表達(dá)量與其D,L-C含量極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。

表3 兒茶素含量與生物合成基因相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性系數(shù)Table 3 Correlation coefficients between the accumulation of catechin and biosynthesis-related gene expression

3 討 論

茶多酚是茶樹中重要的次生代謝產(chǎn)物，其含量約占茶樹鮮葉的18%～36%。茶多酚由兒茶素類、黃酮類、花青素類、原花青素類以及酚酸類等構(gòu)成，兒茶素不僅是茶葉中主要的澀味物質(zhì)，而且茶多酚總量以及兒茶素組成及比例對(duì)茶樹的品質(zhì)有重要影響[13]，茶樹中多酚類物質(zhì)含量和組成與茶樹生長(zhǎng)的環(huán)境條件、栽培措施、茶樹品種、季節(jié)以及新梢嫩度等密切相關(guān)[26,30]。夏季碳代謝增強(qiáng)，多酚類物質(zhì)總量增加導(dǎo)致夏茶濃度與強(qiáng)度都較高[25]。

茶葉中的兒茶素以2-苯基苯并呋喃為主體，根據(jù)B、C環(huán)3位連接的基團(tuán)不同，可分為EC、EGC、ECG、EGCG，各兒茶素組分中EC及其沒食子?；苌顴GC、ECG、EGCG大約占兒茶素總量的90%，兒茶素類含量約占多酚類物質(zhì)的70%[8,17]，本研究結(jié)果表明EGC、ECG、EC夏季含量極顯著高于春季（P＜0.01），因此夏季兒茶素及茶多酚含量高于春季。Xu Wenping等[31]收集了160個(gè)具有代表性的樣品，檢測(cè)其兒茶素組分含量，結(jié)果表明夏茶EGC含量高于春茶，Liu Min等[17]研究春秋季茶樹兒茶素組分含量差異發(fā)現(xiàn)秋季EGC含量高于春季，且茶葉中的兒茶素多為表兒茶素[24]，因此EGC可能是造成不同季節(jié)間兒茶素總量差異的主要成分之一。EGCG是含量最豐富的兒茶素，不同季節(jié)EGCG含量的變化趨勢(shì)受到關(guān)注，已有研究表明不同季節(jié)EGCG含量表現(xiàn)為夏季＞秋季＞春季[24]，但袁英芳等[32]研究表明不同季節(jié)EGCG含量為夏季＞春季＞秋季，這可能是由于品種間的差異所造成，此外，前人研究多關(guān)注茶多酚含量、不同品種間兒茶素組分的差異，兒茶素組分之間的相互轉(zhuǎn)化以及茶樹不同部位兒茶素含量的差異等[15,25,33-34]，但是春季、夏季、秋季EGC及其他兒茶素組分含量差異還缺乏系統(tǒng)研究，不同季節(jié)間兒茶素組分的變化及原因還有待進(jìn)一步探究。

本研究所測(cè)定的F3H、DFR基因相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)出春季高于夏季的趨勢(shì)，兒茶素總量夏季高于春季，前人研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)3H、DFR基因的表達(dá)量與不同發(fā)育階段葉片兒茶素含量變化趨勢(shì)一致[13,35]，光照條件下茶籽苗和愈傷組織中DFR基因表達(dá)量上調(diào)[36-37]，這體現(xiàn)了類黃酮生物合成的復(fù)雜性。PAL、C4H可以為類黃酮生物合成途徑提供碳通量，在兒茶素類生物合成和苯丙烷與類黃酮途徑之間的串聯(lián)中起關(guān)鍵作用，研究表明PAL、C4H基因表達(dá)與兒茶素類含量之間存在正相關(guān)[8]。本研究的相關(guān)性分析結(jié)果表明PAL、C4H、DFR表達(dá)量與兒茶素類含量之間不存在相關(guān)性，這可能是由于同源基因的存在，特定基因的表達(dá)并不一定意味著與兒茶素類含量的關(guān)系[23]。馬春雷[38]研究結(jié)果表明不同茶樹品種LAR基因表達(dá)量隨兒茶素類含量的增加而增加，本研究結(jié)果也表明LAR與兒茶素總量存在正相關(guān)關(guān)系。

兒茶素不僅是茶葉中主要的澀味物質(zhì)，且具有抗氧化、預(yù)防癌癥、預(yù)防心血管疾病、調(diào)劑脂質(zhì)代謝等保健功效[28,39-40]。不同季節(jié)茶樹基因表達(dá)差異分析為了解兒茶素的合成調(diào)控機(jī)制打下了基礎(chǔ)，但還無(wú)法解釋其分子機(jī)制，目前酯型兒茶素的生物合成途徑中沒食子?；霓D(zhuǎn)移尚未明確[41]，探究?jī)翰杷仡惙肿诱{(diào)控機(jī)理對(duì)改善茶葉品質(zhì)，發(fā)揮其生理作用有重要意義。

4 結(jié) 論

茶樹兒茶素類生物合成基因春夏季的表達(dá)量存在差異，福鼎大白茶、碧香早、櫧葉齊F3H、DFR基因的表達(dá)量有春季高于夏季的趨勢(shì)；根據(jù)兒茶素類含量與生物合成基因相對(duì)表達(dá)量的結(jié)果推測(cè)， F3′5′H可能是EGCG合成的關(guān)鍵酶。