黃花草木樨苗期耐鹽性綜合評(píng)價(jià)

田小霞，毛培春，鄭明利，孟 林

（北京市農(nóng)林科學(xué)院草業(yè)花卉與景觀生態(tài)研究所,北京 100097）

土壤鹽漬化是世界上最重要和最廣泛的環(huán)境問(wèn)題之一[1]。目前，全球有超過(guò)800 萬(wàn)hm2的土地受鹽漬化影響[2]，包括15%的干旱和半干旱土地，及40%的灌溉土地[3]。土壤鹽漬化是造成土壤板結(jié)，限制植物生長(zhǎng)的重要非生物脅迫之一，其影響滲透平衡，干擾植物新陳代謝進(jìn)而直接破壞植物生長(zhǎng)發(fā)育。近年來(lái)，由于過(guò)度放牧和水利工程的不合理建設(shè)，致使草地退化，鹽堿化日漸嚴(yán)重[4-5]。采用耐鹽牧草改良鹽漬土不僅是目前減緩或防治土地鹽漬化的主要研究熱點(diǎn)，而且能夠通過(guò)畜牧業(yè)生產(chǎn)獲得經(jīng)濟(jì)效益。因此，篩選適宜鹽堿地種植的牧草品種已成為生態(tài)文明建設(shè)、鄉(xiāng)村振興、草牧業(yè)持續(xù)發(fā)展的重要內(nèi)容。

草木樨(Melilotus)是豆科一年生或二年生草本植物，原產(chǎn)于歐亞大陸和北非[6]，廣泛分布于我國(guó)西北、東北和華北地區(qū)[7-8]。黃花草木樨(M.officinalis)和白花草木樨(M.albus)為該屬最常見(jiàn)的栽培利用種[9]。黃花草木樨植株粗壯，主根發(fā)達(dá)，可以利用其他草本植物無(wú)法利用的土壤深層營(yíng)養(yǎng)元素，富含蛋白質(zhì)，具有較強(qiáng)的固氮能力，是重要的牧草綠肥植物，且適應(yīng)多重土壤，包括鹽堿土和鹽漬土，但不耐酸性土壤[10]；耐瘠薄能力強(qiáng)于紫花苜蓿(Medicago sativa)和白花草木樨，具有同白花草木樨一樣肥田沃土的功效[11-12]。目前關(guān)于黃花草木樨的研究主要集中于對(duì)氮素的礦化[13]、生物活性成分的檢測(cè)[14-15]、應(yīng)用其改良退化土壤和修復(fù)重金屬土壤[16-17]等方面，這些研究對(duì)于黃花草木樨的開(kāi)發(fā)及利用具有指導(dǎo)意義，但對(duì)黃花草木樨在鹽堿地的種植不能提供科學(xué)支持。黃花草木樨種質(zhì)資源是培育草木樨優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的基礎(chǔ)，然而不同的種質(zhì)資源對(duì)鹽的敏感性可能不同[18]。在耐鹽植物育種工作中，溫室耐鹽種質(zhì)材料的篩選是建立耐鹽品種選擇的第一步，且不同種質(zhì)地區(qū)的植物材料其耐鹽性也存在差異。因此，篩選耐鹽性高的種質(zhì)資源、確定合適的耐鹽性測(cè)定指標(biāo)，是利用黃花草木樨改良鹽堿地的基礎(chǔ)性工作。基于此，本試驗(yàn)以68 份黃花草木樨種質(zhì)為試驗(yàn)材料，在溫室條件下采用水培法模擬鹽脅迫條件，通過(guò)測(cè)定其苗期生長(zhǎng)和生理指標(biāo)，應(yīng)用多元統(tǒng)計(jì)分析方法，比較不同種質(zhì)材料的耐鹽性，綜合評(píng)價(jià)方法和篩選指標(biāo)可以應(yīng)用于耐鹽草木樨品種的選育實(shí)踐工作。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為從俄羅斯瓦維洛夫植物研究所引進(jìn)的68 份黃花草木樨種質(zhì)材料，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所提供。材料編號(hào)分別為05-1042、05-1149、05-1198、09P-6011、09P-6021、09P-6045、05-1066、05-1093、09P-6051、09P-6074、09P-6125、10P-7589、05-1449、09P-5609、09P-5938、10P-7618、10P-7772、10P-7794、05-1207、05-1189、06P-2342、09P-5875、09P-5999、10P-7656、05-1428、06P-2398、09P-5828、10P-7676、10P-7684、10P-7742、05-1365、05-1406、05-1495、05-1333、10P-7804、05-1310、05-1286、05-1377、06P-2297、06P-2357、06P-2364、09P-5835、05-1137、05-1249、05-1275、06P-2276、06P-2386、06P-2436、10P-7883、11P-8390、11P-8479、11P-8490、11P-8499、11P-8510、10P-7837、10P-7911、10P-7945、11P-8505、08P-5329、08P-5363、08P-5455、11P-8401、08P-5479、11P-8513、11P-8429、07P-3544、07P-3624、08P-5410。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料培養(yǎng)與脅迫處理

種子發(fā)芽在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行，設(shè)置白天光照時(shí)間16 h，光照強(qiáng)度選擇3 000 lx。黃花草木樨種子經(jīng)過(guò)篩選和消毒后，每100 粒種子播種至3 層濾紙的培養(yǎng)皿中，3 層濾紙每天澆10 mL 蒸餾水，重復(fù)4 次。黃花草木樨種子展開(kāi)兩片子葉后，移栽至水培容器中(長(zhǎng)×寬×高=35 cm×27 cm×10.5 cm)，幼苗用薄海綿條包裹并固定在96 孔泡沫板上，每個(gè)水培盒移栽6 份樣本，每份樣本16 株；培養(yǎng)盒內(nèi)裝入Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液，每7 d 更換一次，每隔3 h 通氣1 h。鹽處理選用NaCl 溶液，設(shè)置NaCl 濃度為0、50、100、150、200 mmol·L-1，緩苗至三葉期時(shí)用相應(yīng)濃度的NaCl 溶液代替Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液，重復(fù)3 次。每培養(yǎng)盒需NaCl 溶液9 L，7 d 更換一次處理溶液。pH在整個(gè)處理期間保持在5.8～6.0，處理14 d 后取樣。

1.2.2 測(cè)定指標(biāo)與方法

處理14 d 后記錄存活植株數(shù)，并用于計(jì)算存活率；記錄單株植株綠葉數(shù)(葉片綠色占整片葉2/3 以上為標(biāo)準(zhǔn))；開(kāi)始NaCl 處理時(shí)株高(H0)和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)株高(H)使用直尺測(cè)定；葉綠素總含量采用直接浸提法；試驗(yàn)結(jié)束后蒸餾水清洗植株4～5 次，烘干至恒重，測(cè)定生物量。生長(zhǎng)速率(cm·d-1)=(H-H0)/14；存活率=(試驗(yàn)結(jié)束后存活植株數(shù)/總株數(shù))×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

1.3.1 單項(xiàng)指標(biāo)耐鹽系數(shù)ω

1.3.2 綜合指標(biāo)隸屬函數(shù)值

式中：μ(Xj)表示第j個(gè)指標(biāo)隸屬函數(shù)值；Xj表示第j個(gè)指標(biāo)值；Xmin表示第j個(gè)指標(biāo)最小值；Xmax表示第j個(gè)指標(biāo)最大值。

1.3.3 各綜合指標(biāo)的權(quán)重

式中：Wj表示第j個(gè)綜合指標(biāo)在所有綜合指標(biāo)中的重要程度即權(quán)重；Vj表示經(jīng)主成分分析所得各材料第j個(gè)綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率[18-19]。

1.3.4 耐鹽綜合評(píng)價(jià)值

式中：D為鹽脅迫下綜合指標(biāo)評(píng)價(jià)所得耐鹽性綜合評(píng)價(jià)值。

應(yīng)用Excel 2010 計(jì)算平均值，SPSS 19.0 進(jìn)行相關(guān)分析、主成分分析、聚類分析和逐步回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 各單項(xiàng)指標(biāo)的耐鹽系數(shù)及相關(guān)性分析

68 份黃花草木樨種質(zhì)材料經(jīng)NaCl 處理后，材料05-1406 (序號(hào)32)和09P-6125 (序號(hào)11)的植株干重(DW)和材料05-1286 (序號(hào)37)和10P-7589 (序號(hào)12)的單株綠葉數(shù)(NGL)耐鹽系數(shù)大于1 (ω＞1)，即測(cè)定值均高于對(duì)照；其他種質(zhì)材料的植株生長(zhǎng)速率(GR)、葉綠素總含量(Chl)、苗高(SH)、存活率(SR)、植株干重和單株綠葉數(shù)的耐鹽系數(shù)均小于1 (ω＜1)，即測(cè)定值均低于對(duì)照(表1)。

表1 NaCl 脅迫下68 份黃花草木樨種質(zhì)材料生長(zhǎng)和生理指標(biāo)的耐鹽系數(shù)(ω)Table 1 Salt tolerant coefficient (ω) of growth and physiological indices of 68 Melilotus officinalis germplasms under NaCl stress

NaCl 處理后，68 份種質(zhì)材料中，指標(biāo)生長(zhǎng)速率耐鹽系數(shù)最高的是材料09P-6125 (序號(hào)11)，為0.740；最低的是材料07P-3624 (序號(hào)67)，為0.303；葉綠素總含量中耐鹽系數(shù)大于0.8 的材料有5 份，生長(zhǎng)速率中耐鹽系數(shù)沒(méi)有高于0.8 的材料。生長(zhǎng)速率、苗高、植株干重和單株綠葉數(shù)的耐鹽系數(shù)分別在0.303～0.740、0.456～0.864、0.330～1.095、0.500～1.077，4 個(gè)指標(biāo)中均沒(méi)有耐鹽系數(shù)值小于0.3 的材料。

對(duì)供試材料進(jìn)行相關(guān)性分析(表略)，結(jié)果表明，68 份種質(zhì)材料植株生長(zhǎng)速率、葉綠素總含量、苗高、植株存活率、植株干重和單株綠葉數(shù)的耐鹽系數(shù)間均呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)。

2.2 不同指標(biāo)耐鹽系數(shù)的主成分分析

對(duì)68 份黃花草木樨6 項(xiàng)指標(biāo)耐鹽系數(shù)進(jìn)行主成分分析(表2)，結(jié)果表明第1、第2、第3 主成分的貢獻(xiàn)率分別為62.17%、12.56%和9.33%，累計(jì)貢獻(xiàn)率84.07%，可代表6 項(xiàng)指標(biāo)的大部分信息。此外，存活率、植株干重和苗高在第1 主成分代表信息中的特征向量是0.463、0.450 和0.412，表明存活率、植株干重和苗高在第1 主成分中作用較大；葉綠素總含量和植株干重在第2 主成分中的特征向量是0.936 和-0.239，表明葉綠素總含量和植株干重在第2 主成分中起主要作用。單株綠葉數(shù)在第3 主成分中的特征向量是0.768，表明單株綠葉數(shù)在第3 主成分中起主要作用。

表2 供試黃花草木樨種質(zhì)苗期耐鹽指標(biāo)的主成分分析Table 2 Principal component analysis for salt tolerance indices at the seedling stage of the tested Melilotus officinalis germplasms

2.3 供試材料的耐鹽性綜合評(píng)價(jià)

根據(jù)各生長(zhǎng)和生理指標(biāo)耐鹽系數(shù)和主成分分析結(jié)果綜合指標(biāo)的特征向量，計(jì)算得出NaCl 脅迫下68 份黃花草木樨種質(zhì)材料的綜合指標(biāo)值CIx，依據(jù)公式(2)計(jì)算綜合指標(biāo)值的隸屬函數(shù)值μ(x)，依據(jù)公式(3)計(jì)算出綜合指標(biāo)值的權(quán)重，最后依據(jù)公式(4)得出綜合評(píng)價(jià)值D 值。根據(jù)D 值作為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)評(píng)價(jià)各供試種質(zhì)材料耐鹽能力的大小，并對(duì)其進(jìn)行排序(表3)。其中，排名前5 名的種質(zhì)材料為09P-6125(序 號(hào)11)、10P-7589 (序 號(hào)12)、09P-5875 (序 號(hào)22)、09P-6074 (序號(hào)10)和05-1093 (序號(hào)8)，其D 值均在0.850 以上，D 值最高的09P-6125 (序號(hào)11)綜合耐鹽能力最強(qiáng)；低D 值種質(zhì)材料為08P-5363 (序號(hào)60)、11P-8401 (序號(hào)62)、08P-5479 (序號(hào)63)、11P-8479(序 號(hào)51)和11P-8390 (序 號(hào)50)，D 值 均在0.200 以下，耐鹽性相對(duì)較弱，種質(zhì)材料08P-5363 (序號(hào)60)的D 值最低，說(shuō)明其耐鹽能力最弱。

表3 68 份黃花草木樨幼苗的綜合指標(biāo)值CIx、隸屬函數(shù)值μ(x)、綜合評(píng)價(jià)D 值及耐鹽類型Table 3 Comprehensive index (CIx),subordinative function value [μ(x)],salt tolerance comprehensive valuation (D value),and salt tolerance of seedlings for the 68 Melilotus officinalis germplasms tested

續(xù)表 3Table 3 (Continued)

聚類分析可將68 份黃花草木樨分為4 種耐鹽類型(圖1)，第Ⅰ類為強(qiáng)耐鹽型，總計(jì)6 份材料，包括09P-6125 (序號(hào)11)、10P-7589 (序號(hào)12)、09P-5875(序號(hào)22)等；第Ⅱ類為中耐鹽型，總計(jì)20 份材料，包 括09P-6011 (序 號(hào)4)、09P-5828 (序 號(hào)27)、09P-6021 (序號(hào)5)等；第Ⅲ類為弱耐鹽型，總計(jì)27 份材料，包括05-1042 (序號(hào)1)、09P-5609 (序號(hào)14)、09P-6045 (序號(hào)6)等；第Ⅳ類為敏鹽型，總計(jì)15 份材料包 括11P-8401 (序 號(hào)62)、08P-5479 (序 號(hào)63)、11P-8479 (序號(hào)51)等。

圖1 68 份黃花草木樨種質(zhì)材料聚類樹(shù)狀圖Figure 1 Dendrogram of clusters for 68 Melilotus officinalis accessions

2.4 回歸模型建立及鑒定指標(biāo)篩選

將68 份黃花草木樨各指標(biāo)耐鹽系數(shù)(ω)為自變量(X)，綜合評(píng)價(jià)值D 值為因變量(Y)，應(yīng)用逐步回歸分析建立回歸方程Y=-0.583+0.510XSR+0.551XChl+0.537XNGL(R2=0.955)，式中的存活率(XSR)、葉綠素總含量(XChl)和單株綠葉數(shù)(XNGL) 3 項(xiàng)指標(biāo)對(duì)黃花草木樨耐鹽性起顯著作用，在試驗(yàn)條件相同時(shí)，可選擇存活率、葉綠素總含量和單株綠葉數(shù)指標(biāo)來(lái)測(cè)定其耐鹽性。通過(guò)回歸方程計(jì)算得出的預(yù)測(cè)值與D 值差值為-0.087～0.093，相關(guān)性分析表明，D 值與預(yù)測(cè)值存在極顯著相關(guān)性(R2=0.977，P＜0.01)。

3 討論

鹽脅迫導(dǎo)致植物生長(zhǎng)遲緩和生物量降低，而培育耐鹽植物品種可以減輕鹽脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)和生產(chǎn)的影響。研究表明，苗期是植物對(duì)鹽脅迫最敏感的階段[20-22]。因此，本研究選擇了黃花草木樨的三葉期進(jìn)行不同種質(zhì)材料的耐鹽性評(píng)價(jià)。鹽脅迫下，不同種質(zhì)材料的生長(zhǎng)或者生理指標(biāo)對(duì)鹽脅迫的反應(yīng)不同，用單一生長(zhǎng)和生理指標(biāo)來(lái)反映植株的耐鹽性存在片面性。本研究結(jié)果表明，NaCl 處理后，68 份黃花草木樨種質(zhì)材料的生長(zhǎng)速率、葉片葉綠素含量、苗高、存活率4 個(gè)指標(biāo)值均低于對(duì)照；植物干重和單株綠葉數(shù)指標(biāo)中各只有2 份材料高于對(duì)照，其他種質(zhì)材料干重和單株綠葉數(shù)均低于對(duì)照。相關(guān)性分析結(jié)果也表明，供試材料各指標(biāo)間均呈極顯著正相關(guān)，指標(biāo)間信息存在重疊性，因此，本研究為消除指標(biāo)間固有差異，選擇了各指標(biāo)耐鹽系數(shù)的綜合評(píng)價(jià)值來(lái)科學(xué)評(píng)價(jià)植株耐鹽性[23-24]。

在植物耐鹽性評(píng)價(jià)中使用多元統(tǒng)計(jì)方法，可以同時(shí)分析多個(gè)指標(biāo)且計(jì)算得分并排序來(lái)提高評(píng)價(jià)的全面性，同時(shí)可以在不同的鹽脅迫水平(例如中度和高鹽水平)下對(duì)種質(zhì)材料的耐鹽性進(jìn)行排序，提高耐鹽性評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性。本研究應(yīng)用主成分分析法將多項(xiàng)指標(biāo)轉(zhuǎn)化成綜合指標(biāo)，結(jié)合隸屬函數(shù)法求得相應(yīng)的隸屬函數(shù)值，進(jìn)而結(jié)合各綜合指標(biāo)值的相對(duì)重要性進(jìn)行加權(quán)求得綜合評(píng)價(jià)值D 值，再者D 值是一個(gè)[0,1]閉區(qū)間上的純數(shù)[19,25]，因而，根據(jù)D 值大小能科學(xué)有效地對(duì)68 份黃花草木樨種質(zhì)材料的耐鹽性進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)價(jià)。通過(guò)對(duì)綜合評(píng)價(jià)值D值進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，將68 份黃花草木樨種質(zhì)材料劃分為4 種類型，分為強(qiáng)耐鹽型、中等耐鹽型、弱耐鹽型和敏鹽型，其中強(qiáng)耐鹽型材料6 份，中等耐鹽型材料20 份，弱耐鹽型材料27 份，敏鹽型材料15 份。耐鹽性強(qiáng)的黃花草木樨供試材料表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鹽能力，在質(zhì)量濃度150 mmol·L-1NaCl 處理下的苗高、幼苗存活率、綠葉數(shù)等與對(duì)照無(wú)顯著差異；而敏鹽型材料則出現(xiàn)鹽害癥狀。采用綜合評(píng)價(jià)方法，科學(xué)客觀地從供試材料中篩選出耐鹽性極強(qiáng)和耐鹽性極弱的種質(zhì)材料，可為進(jìn)一步研究草木樨植物的耐鹽機(jī)制及耐鹽基因的挖掘提供科學(xué)依據(jù)。

本研究中，對(duì)D 值和耐鹽系數(shù)進(jìn)行逐步回歸分析表明存活率、葉綠素含量和單株綠葉數(shù)3 個(gè)指標(biāo)可較好地用于黃花草木樨的耐鹽性評(píng)價(jià)，在同等試驗(yàn)條件下，可以利用這3 項(xiàng)指標(biāo)預(yù)測(cè)其耐鹽性。劉春華和張文淑[26]研究得出植株存活率可作為評(píng)價(jià)苜蓿品種耐鹽性的指標(biāo)。田小霞等[20]也指出植株存活率是評(píng)價(jià)紫花苜蓿耐鹽性的重要指標(biāo)。謝楠等[27]發(fā)現(xiàn)綠葉數(shù)是評(píng)價(jià)飼用小麥(Secale cereale)和小黑麥(Secale sylvestre)耐鹽性的重要指標(biāo)。張軍等[28]指出葉綠素總含量是小麥苗期耐鹽性評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)之一。本研究建立了水培系統(tǒng)的黃花草木樨耐鹽性篩選方法，減少了田間耐鹽性實(shí)驗(yàn)的不確定因素，加快了耐鹽性評(píng)價(jià)進(jìn)度，進(jìn)而加快了黃花草木樨耐鹽品種的育種速度。此外，我們建立了比較容易評(píng)價(jià)的表型特征，例如植株存活率、葉綠素含量和單株綠葉數(shù)等評(píng)價(jià)黃花草木樨耐鹽性，不需要記錄大量數(shù)據(jù)和成本，因此，可以比較簡(jiǎn)單快速地評(píng)價(jià)同等試驗(yàn)條件下植株的耐鹽性。

黃花草木樨繁殖力強(qiáng)、抗旱、耐鹽、防風(fēng)固沙，能夠固定大氣中的氮，增加土壤腐殖質(zhì)和氮素，改善土壤環(huán)境，改良貧瘠土壤，提高土地生產(chǎn)力等多種功能[29-30]，因此黃花草木樨可用于鹽漬地的改良，但不同種質(zhì)材料的耐鹽性和對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性不同，因此實(shí)際人工栽植黃花草木樨時(shí)應(yīng)根據(jù)種植區(qū)的水文和氣候條件，選擇適應(yīng)當(dāng)?shù)丨h(huán)境且較耐鹽的種質(zhì)材料，以獲得較高的生態(tài)、社會(huì)和環(huán)境效益。植物的耐鹽性是多種性狀相互作用的綜合表現(xiàn)，同種植物不同種源甚至不同發(fā)育階段其耐鹽機(jī)制不同，因此，篩選可以應(yīng)用于實(shí)際鹽堿地改良的種質(zhì)材料，還需要進(jìn)行各個(gè)發(fā)育階段的試驗(yàn)研究。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)供試68 份黃花草木樨苗期生長(zhǎng)速率、葉綠素總含量、苗高等6 個(gè)生長(zhǎng)生理指標(biāo)進(jìn)行比較，依據(jù)單項(xiàng)指標(biāo)的耐鹽系數(shù)，進(jìn)行相關(guān)性分析、主成分分析和綜合評(píng)價(jià)值D 值，對(duì)供試種質(zhì)材料的耐鹽性進(jìn)行了準(zhǔn)確的篩選和排序；通過(guò)聚類分析，可將68 份種質(zhì)材料分為強(qiáng)耐鹽型、中等耐鹽型、弱耐鹽型和敏鹽型4 類；通過(guò)對(duì)D 值和各單項(xiàng)指標(biāo)逐步回歸分析建立黃花草木樨種質(zhì)材料耐鹽性預(yù)測(cè)回歸方 程Y=-0.583+0.510XSR+0.551XChl+0.537XNGL(R2=0.955)，可以較快且準(zhǔn)確地對(duì)其耐鹽性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，在相同試驗(yàn)條件下，可通過(guò)測(cè)定存活率、葉綠素含量和單株綠葉數(shù)進(jìn)行黃花草木樨種質(zhì)材料耐鹽性強(qiáng)弱的預(yù)測(cè)。