楊檳伊 劉小梅 陳鑫 陳偉明 范煦 李富江 鹿洪亭
1 青島大學附屬醫(yī)院小兒外科,青島 266000; 2 青島大學,青島 266071; 3 勝利油田中心醫(yī)院兒科,東營 257034; 4 青島大學附屬婦女兒童醫(yī)院小兒外科,青島 266011
神經(jīng)母細胞瘤(neuroblastoma,NB)是交感神經(jīng)系統(tǒng)的胚胎性顱外實體瘤,是兒童交感神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤[1-2]。NB的平均診斷年齡約17個月,臨床表現(xiàn)多樣,預后個體差異較大[3-5]。NB因病死率高、預后差而被視為一種高風險的兒童惡性腫瘤[3,6-7]。目前大量研究表明,長鏈非編碼RNA (long noncoding RNAs,lncRNA)在腫瘤進展中起著關(guān)鍵作用[8]。LncRNA一般超過200個核苷酸,缺乏蛋白質(zhì)編碼能力[9]。此外,lncRNA能夠調(diào)節(jié)與腫瘤異常增殖、凋亡、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達[9-10]。lncRNA SNHG7全長2176 bp,位于染色體9q34.3上。SNHG7具有促進多種腫瘤細胞增殖和抑制細胞凋亡的作用。例如,lncRNA SNHG7與miR-34a相互作用,通過PI3K/Akt/mTOR通路上調(diào)結(jié)直腸癌中GALNT7的表達水平[11]。LncRNA SNHG7通過上調(diào)FAIM2蛋白的表達水平,促進細胞增殖,抑制癌細胞凋亡[12]。雖然SNHG7被認為是多種癌癥的重要調(diào)控因子,但其在神經(jīng)母細胞瘤進展中的作用及機制尚未明確。
miRNA長度通常為20~22個核苷酸,缺乏蛋白編碼潛能,通過結(jié)合靶mRNA上的互補序列,在轉(zhuǎn)錄后下調(diào)基因表達[13]。越來越多的研究表明,lncRNA可以通過miRNA的海綿作用調(diào)控多種癌癥中mRNA的表達[14-15]。例如,lncRNA FTH1P3可通過miR-206/ABCB1激活乳腺癌患兒的紫杉醇耐藥[16]。有報道SNHG7在多種癌癥中作為miRNA發(fā)揮海綿樣作用[17]。例如,SNHG7通過分泌miR-503經(jīng)cyclin D1促進前列腺癌的增殖和周期進展[18]。MiR-653-5p是以前從未被研究過的miRNA之一,miR-653-5p是否參與NB的進展仍有待闡明。本研究旨在探索SNHG7在神經(jīng)母細胞瘤進展中的作用,并進一步探討SNHG7中的分子機制對NB的潛在影響。
一、研究對象
從青島大學附屬醫(yī)院收治的NB患兒體內(nèi)獲得92對NB組織及相鄰非腫瘤組織。樣品獲取后即置于-80℃低溫冰箱保存。所有患兒未接受術(shù)前治療,患兒家屬簽署書面知情同意書,本研究獲得青島大學附屬婦女兒童醫(yī)院倫理委員會批準(QYFYWZLL25816)。
二、研究方法
1.細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染:人神經(jīng)母細胞瘤細胞系[SK-N-AS,SK-N-SH,SH-SY5Y,IMR-32,SK-N-BE(2)-C]購于美國ATCC公司。細胞的培養(yǎng)液(dulbecco’s modified eagle medium,DMEM)及100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素購于美國默賽飛世爾公司,10%的滅活胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)購于美國Hyclone公司,然后置于含有5%CO2,37℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以SNHG7為靶點的shRNA和相應的對照組shRNA (sh-NC)由上海吉瑪基因制藥技術(shù)有限公司提供。合成STAT2序列,亞克隆到pcDNA3.1載體(pcDNA/STAT2)購于英杰公司。從上海吉瑪公司獲得miR-653-5p模擬物和miR-653-5p抑制。SK-N-SH細胞和SH-SY5Y細胞與質(zhì)粒使用lipofectamine 2000進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后,收集細胞并保存,以備后續(xù)研究。
2. RNA提取和實時熒光定量PCR:采用Trizol試劑(美國默賽飛世爾公司)從患兒組織和NB細胞中提取RNA。采用分光光度法測定RNA樣品的濃度和純度。純化后的RNA經(jīng)相應逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自德國德商寶公司)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。基因的相對表達水平用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(中國大連的寶生物公司)進行驗證。用U6作為內(nèi)參,每組實驗重復3次。
3. 比色法實驗:將SK-N-SH和SH-SY5Y兩種細胞(2×105)分別在96孔板中培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h。 向每個孔中加入3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2、5-二苯基-2-H-四唑溴化物(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT,0.5 mg/mL)溶液。 將細胞依次孵育4 h,除去剩余的MTT溶液,再向每個孔中加入二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)以溶解晶體。 此后,使用ELX-800光譜儀讀數(shù)器(美國寶特儀器有限公司)測量490 nm處的吸光度。 每組實驗重復3次。
4. 集落形成實驗:轉(zhuǎn)染后,將SK-N-SH和SH-SY5Y兩種細胞(1×103細胞/孔)接種到12孔板中。 培養(yǎng)基每3天更換1次。 2周后,用PBS輕輕洗滌細胞,甲醇固定10 min后用0.1%結(jié)晶紫染色5 min,最后手動計數(shù)含有超過50個細胞的集落。每組實驗重復3次。
5. 細胞的侵襲和遷移實驗:利用Transwell小室實驗(美國的康寧公司)檢測上述兩種細胞,SK-N-SH和SH-SY5Y兩種細胞(2×104)置于有200 μL新鮮DMEM培養(yǎng)基的上室中,將含有10%FBS的800 μL培養(yǎng)基加入下室。 孵育24 h后,用4%多聚甲醛固定細胞20 min,并用0.1%結(jié)晶紫染色5 min。 然后通過光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司,型號BX51)放大200倍對膜底部侵入或遷移的細胞進行計數(shù)。每組實驗重復3次。
6. 熒光素酶報告實驗:將含有預測的miR-653-5p結(jié)合位點和SNHG7的全長序列的STAT2的3’-UTR序列克隆到psiCHECK-2載體(普洛麥格公司,美國)上來產(chǎn)生野生型STAT2報告基因(STAT2-Wt)和野生型SNHG7報告基因(SNHG7-Wt)。 突變型STAT2報告基因(STAT2-Mut)和突變型SNHG7報告基因(SNHG7-Mut)由定點突變試劑盒(購于默賽飛世爾公司)產(chǎn)生。 用HEK-293T細胞與miRNA(miR-NC,miR-653-5p模擬物)以及miRNA抑制物(miR-NC,miR-653-5p抑制物)一起轉(zhuǎn)染這些構(gòu)建的分子報告基因。 在轉(zhuǎn)染48 h后,用雙熒光素酶報告系統(tǒng)(普洛麥格系統(tǒng),美國)測量熒光素酶活性。每組試驗重復3次。
7. RIP測定法(RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀法):運用蛋白質(zhì)免疫沉淀試劑盒對SK-N-SH和SH-SY5Y細胞進行處理。將細胞裂解物(SK-N-SH和SH-SY5Y)在含有磁珠的RIP緩沖液中孵育,所述磁珠與人抗-Ago2抗體結(jié)合,正常IgG和Input分別充當對照組。用蛋白酶K分離免疫沉淀的RNA。最后,提取純化的RNA,通過實時PCR測量。每組實驗重復3次。
(3)加強風險規(guī)范管理。強化數(shù)據(jù)分析應用,推進財產(chǎn)行為稅風險管理,加強信息比對,完善各稅種風險特征庫、管理模型和指標體系,建立財產(chǎn)行為稅風險管理機制,不斷提高風險管理的規(guī)范化水平。
8.RNA下拉測定法:Bio-SNHG7-WT,Bio-SNHG7-Mut和Bio-NC由中國上海吉瑪公司生物素化所得。 將生物素標記的RNA轉(zhuǎn)染到SK-N-SH和SH-SY5Y細胞中。 轉(zhuǎn)染48 h后,收集細胞并裂解。 將細胞裂解物與含有抗-Ago2或抗-IgG的珠子一起孵育10 min。 通過qRT-PCR分析純化的RNA復合物。每組實驗重復3次。
三、統(tǒng)計學處理
一、SNHG7在NB組織和細胞中表達明顯上調(diào)
為了探討SNHG7在NB進展中的作用,首先用qRT-PCR檢測92對NB組織中SNHG7的表達。如圖1A所示,與相應的非腫瘤組織相比,SNHG7在腫瘤組織中的表達明顯上調(diào)。檢測NB細胞[SK-N-SH,SH-SY5Y,IMR-32,SK-N-AS,SK-N-BE(2)-C]中SNHG7的表達水平發(fā)現(xiàn),SNHG7在SK-N-SH和SH-SY5Y細胞中高表達(圖1B),提示SNHG7可能參與NB的發(fā)生發(fā)展。
二、SNHG7表達與NB臨床預后的關(guān)系
為了進一步確定SNHG7對NB的影響,分析臨床病理特征與NB患兒SNHG7表達水平之間的關(guān)系,根據(jù)實時PCR分析得到SNHG7的平均表達水平,將所有患兒分為高表達組和低表達組。如表1所示,SNHG7的高表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=4.843,P=0.035)、INSS分期(χ2=5.101,P=0.034)、視神經(jīng)侵犯(χ2=10.163,P=0.003)有關(guān),但SNHG7的表達與年齡、性別、分化程度無關(guān)(P>0.05)。Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn),SNHG7高表達的患兒預后較差(圖1C)。此外,SNHG7的表達(P=0.042)可以作為NB患兒預后的獨立預測因子(表2),NB患兒SNHG7的表達水平可能與預后有關(guān)。
圖1 SNHG7在NB組織和細胞中表達上調(diào)相關(guān)結(jié)果圖 注 A:與配對的非腫瘤組織相比,92例NB組織中SNHG7表達上調(diào); B:SNHG7在5株NB細胞中的表達情況; C:Kaplan-Meier分析低(n=39)和高(n=53) SNHG7表達的NB患兒總生存期(*代表P<0.05,**代表P<0.01)
表1 SNHG7表達等級與臨床特征的關(guān)聯(lián)性(n=92)Table 1 Correlation between SNHG7 expression and clinical features (n=92)變量分類SNHG7表達等級低高χ2值P值年齡(歲)<2.5≥2.5241535180.1980.667性別(例)男女261333200.1890.826淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是否162334194.8430.035INSS分期(例)1~2A2B~4S241520335.1010.034分化程度好差112813400.1580.811視神經(jīng)侵犯否是2415153810.1630.003
為了探討SNHG7在NB進展中的作用,使用特異性shRNA來沉默具有SNHG7高表達的兩個NB細胞系SK-N-SH和SH-SY5Y。 如圖2A所示,在SK-N-SH和SH-SY5Y細胞中,shSNHG7有效降低了SNHG7的表達。 MTT測定顯示SNHG7的下調(diào)明顯抑制了SK-N-SH和SH-SY5Y細胞的活力(圖2B)。 此外,SNHG7下調(diào)顯著減少了SK-N-SH和SH-SY5Y細胞中的集落數(shù)(圖2C)。
圖2 SNHG7在體外抑制NB細胞增殖、體內(nèi)抑制腫瘤生長的相關(guān)結(jié)果圖 注 A:采用qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染shCtrl或shSNHG7后SK-N-SH和SH-SY5Y細胞中SNHG7的相對表達水平; B:通過MTT法檢測SNHG7下調(diào)對SK-N-SH和SH-SY5Y細胞存活和增殖的作用; C:菌落形成法檢測答案顯示SNHG7下調(diào)對SK-N-SH和SH-SY5Y細胞存活和增殖有明顯抑制作用
表2 NB患兒預后相關(guān)因素的Cox回歸分析結(jié)果Table 2 Multivariate analysis of prognostic parameters in NB children by Cox regression 變量分類P值年齡(歲)<2.5≥2.50.360性別男女0.765淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是否0.031分期1~2A2B~4S0.041分化程度好中/差0.881視神經(jīng)侵犯否是0.076SNHG7表達等級高低0.042
四、SNHG7的下調(diào)抑制NB細胞的遷移、侵襲
為了進一步研究SNHG7對NB轉(zhuǎn)移的影響,應用Transwell測定法驗證SK-N-SH和SH-SY5Y細胞的細胞遷移和侵襲能力。 從圖3A和圖3B可以看出,SNHG7的下調(diào)明顯抑制了SK-N-SH和SH-SY5Y細胞遷移和侵襲的能力,這表明沉默SNHG7可抑制NB細胞轉(zhuǎn)移。
圖3 SNHG7基因敲除抑制NB細胞遷移、侵襲能力的相關(guān)結(jié)果圖 注 A和B:Transwell試驗結(jié)果表明,敲低SNHG7可明顯抑制SK-N-SH和SH-SY5Y細胞的細胞遷移和侵襲能力 (**代表P<0.01)
五、SNHG7在NB細胞中與miR-653-5p的相互作用及相關(guān)性
最近,越來越多的證據(jù)表明,lncRNA含有與miRNA互補的序列,并且對miRNA的表達和活性具有抑制作用[18-19]。我們通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn),SNHG7 RNA含有一個保守元件,可能是miR-653-5p的靶位點。為了確保這種可能性,本研究分別用SNHG7的野生型序列(SNHG7-WT)和突變型序列(SNHG7-Mut)構(gòu)建了兩個pMIR熒光素酶報告基因(圖4A)。 如圖4B所示,miR-653-5p模擬物僅能降低SNHG7-WT的熒光素酶活性,但不能降低SNHG7-Mut的熒光素酶活性,而對miR-NC則沒有影響。 此外,RIP測定結(jié)果顯示,與對照IgG免疫沉淀物相比,SNHG7和miR-653-5p均含來自SK-N-SH和SH-SY5Y提取物的Ago2沉淀(圖4C)。 另外,miR-653-5p與SNHG7之間存在一定的相互作用并受其影響,其促進作用可被SNHG7抑制(圖4D)。
為了進一步證實SNHG7與miR-653-5p的相關(guān)性,本研究分析了它們在NB組織中的表達情況。 qRT-PCR結(jié)果顯示,與非腫瘤組織相比,miR-653-5p在NB組織中表達下調(diào)(圖4E)。Spearman相關(guān)分析顯示,miR-653-5p表達與SNHG7的表達呈負相關(guān)(r=-0.281,P=0.007),詳見圖4F。
圖4 SNHG7在NB細胞中與miR-653-5p結(jié)合的相關(guān)結(jié)果圖 注 A:miR-653-5p與SNHG7序列的預測結(jié)合位點; B:熒光素酶報告基因測定用于檢測轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞的熒光素酶活性; C:RIP法檢測珠子中SNHG7和miR-653-5p的qRT-PCR結(jié)果; D:采用qRT-PCR檢測SK-N-SH和SH-SY5Y細胞中RNA下拉法拉低復合物中miR-653-5p的相對表達情況; E:NB組織中miR-653-5p表達的qRT-PCR結(jié)果; F:Spearman相關(guān)顯示NB組織中SNHG7與miR-653-5p呈負相關(guān)(**代表P<0.01)
六、STAT2是受SNHG7和SNHG7/miR-653-5p 軸調(diào)控的靶基因
使用StarBase 2.0發(fā)現(xiàn),STAT2是miR-653-5p的一個假定靶點(圖5A) 。熒光素酶報告基因檢測顯示,miR-653-5p模擬物可降低STAT2-WT的熒光素酶活性,而其他組的熒光素酶活性變化不大,說明miR-653-5p與STAT2-WT存在特異性的相互作用(圖5B)。Spearman相關(guān)分析表明,STAT2表達與miR-653-5p水平呈負相關(guān)(r=-0.295,P=0.004),而與NB組織中的SNHG7表達呈正相關(guān)(r=0.296,P=0.004),見圖5C和5D 。這些數(shù)據(jù)說明SNHG7通過調(diào)節(jié)miR-653-5P/STAT2途徑在NB進展中發(fā)揮作用。
圖5 STAT2是SNHG7調(diào)控miR-653-5p的靶點,以及SNHG7/miR-653-5p/STAT2軸在NB進展中的作用 注 A:miR-653-5p與STAT2序列的預測結(jié)合位點; B:采用HEK-293T細胞熒光素酶報告基因檢測miR-653-5p與STAT2的結(jié)合; C、D:Spearman相關(guān)分析揭示了STAT2的表達與NB組織中miR-653-5p或SNHG7水平存在相關(guān)性
越來越多的證據(jù)表明,lncRNA在多種惡性腫瘤(包括神經(jīng)母細胞瘤)的進展中起著至關(guān)重要的作用。 例如,新型長非編碼RNA的linc-NeD125攜帶miR-125b-1,并負向控制人神經(jīng)母細胞瘤細胞的增殖[20]。CASC15在神經(jīng)母細胞瘤中起腫瘤抑制劑的作用[21]。SNHG7是一種lncRNA,已被鑒定為幾種癌癥的致癌基因[12,18,22]。然而,其在神經(jīng)母細胞瘤發(fā)展中的作用和調(diào)節(jié)機制尚不清楚。 本研究發(fā)現(xiàn)NB組織和細胞系中,SNHG7的表達水平顯著升高,而SNHG7的表達具有重要的臨床意義,可以預測NB患兒的預后。 隨后,細胞功能實驗驗證SNHG7的下調(diào)會抑制NB細胞增殖,并抑制細胞遷移、侵襲。
越來越多的證據(jù)表明,與miRNA序列互補的lncRNA能夠抑制miRNA的表達和活性[19,23]。例如,長鏈非編碼RNA GAPLINC作為miR-378分子的靶基因可通過海綿作用調(diào)控MAPK1表達,促進胃癌細胞增殖[24]。LncRNA CCAT1通過下調(diào)miR-143在FTC-133甲狀腺癌細胞株中的表達,促進細胞增殖、遷移和侵襲[25]。本研究通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn),miR-653-5p與SNHG7和STAT2含有預測的結(jié)合位點,提示SNHG7通過類似機制調(diào)控神經(jīng)母細胞瘤進展。本研究證實了miR-653-5p與SNHG7或STAT2的相互作用。此外,STAT2表達與miR-653-5p水平呈負相關(guān),但與NB組織中SNHG7水平呈正相關(guān)。
信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子(signal transduction and activator of transcription, STATs)是JAKs-STATs信號通路中常見的轉(zhuǎn)錄因子。經(jīng)常參與多種細胞因子信號通路的調(diào)控[26]。STAT2是著名的STAT家族蛋白之一,在調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄方面發(fā)揮重要作用[27]。諸多文獻報道STAT2參與了某些癌癥的發(fā)生[28-29]。例如,與宮頸炎和發(fā)育不良組織相比,宮頸癌組織中STAT2上調(diào)[28]。與這些研究一致,本研究發(fā)現(xiàn)NB組織中STAT2水平較非腫瘤組織顯著上調(diào),說明STAT2與NB腫瘤進展有關(guān)。此外,STAT2過表達和miR-653-5p抑制shSNHG7誘導的細胞增殖、遷移和侵襲的恢復表明,SNHG7通過調(diào)控miR-653-5p/STAT2通路參與NB的進展。
綜上所述,本研究初步闡明了SNHG7-miR-653-5p-STAT2信號通路在調(diào)節(jié)NB進展中的作用,為進一步探索新的NB治療靶點和預后生物標志物提供了依據(jù),后續(xù)會通過蛋白印跡及免疫組化等試驗進一步驗證此實驗的準確性,未來還需要更多的NB動物實驗以及臨床實驗來證實本研究結(jié)果。
利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突
作者貢獻聲明文獻檢索為楊檳伊、陳偉明,論文調(diào)查設(shè)計為楊檳伊、劉小梅、陳鑫,數(shù)據(jù)收集與分析為楊檳伊、范煦、陳偉明、李富江、陳鑫、劉小梅,論文結(jié)果撰寫為楊檳伊、陳偉明、范煦、鹿洪亭,論文討論分析為楊檳伊,劉小梅,鹿洪亭