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    牛蛙源弗氏檸檬酸桿菌的分離鑒定和藥敏分析

    2022-03-04 13:12:24黃志藝謝麗琴許嘉龍劉琦濤楊培奎
    關(guān)鍵詞:弗氏牛蛙檸檬酸

    黃志藝,謝麗琴,許嘉龍,劉琦濤,楊培奎

    (韓山師范學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,廣東 潮州 521041)

    牛蛙(Rana catesbeiana)原產(chǎn)于北美洲和墨西哥等地,其肉質(zhì)鮮美,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高,且其皮、油和腺體等可作為工業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)和醫(yī)藥業(yè)的原料[1-2].自上世紀(jì)60年代引入我國(guó)以來(lái),經(jīng)過(guò)多年的推廣已成為我國(guó)主要水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)之一,其年產(chǎn)量已超過(guò)15 萬(wàn)噸[3].然而,近年來(lái)由于牛蛙養(yǎng)殖密度增大、水質(zhì)惡化,病害也日益突出.目前已報(bào)道的病害主要有寄生蟲(chóng)病、病毒性疾病以及由變形菌(Proteus vulgaris)、鏈球菌(Streptococcus)、達(dá)卡氣單胞菌(Aeromonas dhakensis)、金黃桿菌(Chryseobacterium sp.)等引起的細(xì)菌性疾?。?-8].其中,細(xì)菌性疾病由于致病菌種類多、致病的病因復(fù)雜、發(fā)病和致死率高等原因經(jīng)常給牛蛙養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失,因此一直以來(lái)都是牛蛙養(yǎng)殖中病害防控的重點(diǎn)[9].

    在養(yǎng)殖過(guò)程中,水體環(huán)境的污染、富營(yíng)養(yǎng)化等導(dǎo)致水體中致病菌大量繁殖,嚴(yán)重危害水生動(dòng)物的生存,致使病害頻發(fā).因此,養(yǎng)殖環(huán)境中致病微生物的防治對(duì)于健康養(yǎng)殖、病害防控具有重要意義.為此,本研究運(yùn)用傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)方法,從牛蛙養(yǎng)殖場(chǎng)的廢水中分離細(xì)菌,結(jié)合理化特性以及16SrRNA 擴(kuò)增和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析,鑒定病原.同時(shí),對(duì)分離細(xì)菌的耐藥性以及致病力進(jìn)行分析,以期為牛蛙養(yǎng)殖過(guò)程中環(huán)境致病菌的科學(xué)防治提供理論依據(jù).

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    牛蛙池塘廢水采自廣東省汕頭市澄海區(qū)鹽鴻鎮(zhèn)牛蛙養(yǎng)殖場(chǎng);成體幼蛙購(gòu)自同一地區(qū)的種苗繁育基地,開(kāi)展實(shí)驗(yàn)前在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)5-7 天.陳皮、麻黃、虎杖、廣藿香、苦參根、野菊花、蛇床子、丁香、黃柏、艾葉、黃芩、烏梅、五味子等中藥材均購(gòu)自廣東省潮州市湘橋區(qū)大森林藥房.

    1.2 主要試劑和儀器

    腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管、藥敏紙片,杭州微生物試劑有限公司;2×Taq PCR StarMix、瓊脂糖,北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司;細(xì)菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’),由華大基因科技有限公司合成.SHP-150 型生化培養(yǎng)箱,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;博日LifeECO 基因擴(kuò)增儀,杭州博日科技有限公司;Gel DOCTM XR+凝膠成像系統(tǒng)、PowerPac basic 電泳儀,美國(guó)Bio-Rad 公司;DYCP-31E 型水平電泳槽,北京六一儀器廠.

    1.3 培養(yǎng)基

    LB 培養(yǎng)基:蛋白胨1%,酵母膏1%,氯化鈉0.5%,pH 值7.2. LB 固體培養(yǎng)基是在LB 液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入1.5%~2.0%的瓊脂,121 ℃20 min[10].

    1.4 中草藥水提取液的制備

    分別取陳皮、麻黃、虎杖、廣藿香、苦參根、野菊花、蛇床子、丁香、黃柏、艾葉、黃芩、烏梅、五味子等十三種中藥30 g,加入500 mL 蒸餾水置于超聲波提取器處理提取30 min,隨后將各中草藥水提取液再加熱煮沸1 h,以無(wú)菌紗布趁熱過(guò)濾煎液,并將濾液加熱濃縮到50 mL.取1 mL濃縮液測(cè)定干物質(zhì)質(zhì)量,其余保存于-80 ℃?zhèn)溆?

    1.5 病原菌的分離純化及菌懸液制備

    將采集的水樣,在無(wú)菌條件下利用0.7%無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行一系列稀釋后,取100 μL 稀釋液均勻涂布于LB瓊脂平板,28 ℃,培養(yǎng)24 h.挑選形態(tài)特征相似的優(yōu)勢(shì)菌落,通過(guò)2-3代的劃線分離純化,獲得一株優(yōu)勢(shì)的純培養(yǎng)菌株W6,4 ℃保存待用.將W6菌接種至LB液體培養(yǎng)基,28 ℃,150 rpm/min,培養(yǎng)24 h,隨后離心收集菌體并用0.7%的無(wú)菌生理鹽水重懸菌體制成菌懸液.

    1.6 病原菌的形態(tài)觀察和生理生化鑒定

    觀察純化后菌株W6 的單菌落形態(tài)特征,挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色,顯微鏡觀察其形態(tài)特征.將W6 接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,28 ℃,150 rpm/min,培養(yǎng)24 h,隨后收集菌體并用0.7%的無(wú)菌生理鹽水制成菌懸液后接種于生化反應(yīng)管中,28 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察結(jié)果,生理生化鑒定采用杭州微生物試劑有限公司的腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定試劑盒,并按照相應(yīng)的操作進(jìn)行.

    1.7 病原菌16SrRNA基因擴(kuò)增及其序列分析

    利 用 細(xì) 菌 通 用 引 物27F (5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' ) 和1492R (5' -TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3' )對(duì)菌株S15 基因組DNA 進(jìn)行16SrRNA 基因序列的擴(kuò)增.16SrRNA 基因PCR 反應(yīng)體系(10 μL):2×Taq MasterMix(Dye)5 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL,模板1 μL,ddH2O 2 μL;PCR 反應(yīng)條件:96 ℃3 min;96 ℃30s ,55 ℃1 min,72 ℃2 min,30 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10min.隨后,取2 μL的PCR產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),將單一且符合目的大小的PCR產(chǎn)物送廣州華大基因科技有限公司完成測(cè)序.

    將所獲得的16SrRNA 基因序列上傳至NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù),并利行BLAST 進(jìn)行序列相似性比對(duì),選取與所測(cè)序列同源性高的已知菌株的16SrRNA 基因序列.采用MEGA7.0 軟件,Neighbor-Joining 法進(jìn)行聚類分析和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[5].

    1.8 抗生素敏感性試驗(yàn)

    參照KB紙片擴(kuò)散法[11],即以涂布法接種0.1 mL1.0×107CFU/mL 的菌懸液于LB培養(yǎng)基平板上,然后將藥敏紙片(杭州微生物試劑有限公司)貼于培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)24 h 后,測(cè)定其抑菌圈直徑(mm),每種藥物平行重復(fù)三次,確定分離菌株對(duì)抗生素的敏感性.

    1.9 中草藥水提取液對(duì)W6菌株抑菌活性分析

    參照課題組此前的方法[12],在LB 培養(yǎng)基平板上涂布接種0.1 mL1.0×10?CFU/mL 的菌懸液.隨后,放置直徑為6 mm 的滅菌濾紙,并用20 μL 的中草藥水提取液浸潤(rùn).將培養(yǎng)皿置于28 ℃培養(yǎng)24 h,隨后測(cè)定抑菌圈直徑.以頭孢霉素(20 μL,0.1 mg/mL)為陽(yáng)性對(duì)照,以蒸餾水20 μL為陰性對(duì)照,所有的分析進(jìn)行三次重復(fù).

    用二倍稀釋法測(cè)定中槽藥水提取物對(duì)W6 菌株的MIC 和MBC.首先,在96 孔板中按照每孔100 μL的量加入LB液體培養(yǎng)基.隨后,在每一排的第一孔中加入100 μL中草藥水提取液(100 μg/mL),充分混勻后取100 μL 至第二孔,并依次稀釋至第11 孔,第12 列孔作為空白對(duì)照.每個(gè)孔接種加入1 μL 稀釋至1.0×103CFU/ml 的菌液,28 ℃培養(yǎng)24 h,觀察并記錄MIC、MBC,平行重復(fù)3 次,每組數(shù)值取平均值.

    1.10 細(xì)菌致病性試驗(yàn)

    為了檢測(cè)分離菌株W6 的致病性,以牛蛙為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行細(xì)菌致病性實(shí)驗(yàn).將W6 接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)24 h后收集菌體,用0.7%的無(wú)菌生理鹽水制成濃度為1×109cell/mL的菌懸液.采用腹腔注射的方法進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn),其中實(shí)驗(yàn)組每只牛蛙注射100 μL 菌懸液,對(duì)照組注射同等劑量的無(wú)菌生理鹽水.注射之后的牛蛙放入塑料桶中暫養(yǎng),隨后每隔24 h 觀察并記錄一次牛蛙的死亡情況,實(shí)驗(yàn)為期168 h.

    2 結(jié)果

    2.1 病原菌的形態(tài)特征

    菌株W6在LB培養(yǎng)基上形成的菌落呈圓形、中間隆起、邊緣整齊、表面光滑.革蘭氏染色的結(jié)果表明,該菌株為革蘭氏陰性菌株,鏡檢觀察其為兩端鈍圓的短桿菌(圖1).

    圖1 革蘭氏染色后病原菌的形態(tài)特征

    2.2 病原菌的生理生化特性

    菌株W6 生理生化特性見(jiàn)表1.參考《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》,菌株W6的生理生化特性與弗氏檸檬酸桿菌的基本一致.對(duì)菌株W6 在甲基紅、硫化氫、動(dòng)力瓊脂、山梨醇、木糖、葡萄糖等的檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性;在靛基質(zhì)、側(cè)金盞花醇、尿素、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、苯丙氨酸脫氫酶等的檢測(cè)結(jié)果均為陰性,上述生理生化特性鑒定結(jié)果與弗氏檸檬酸桿菌參考菌株的生理生化特性一致.

    表1 W6革蘭氏陰性桿菌生理生化鑒定結(jié)果

    2.3 16SrRNA基因序列分析

    分離菌株W6 的16SrRNA 基因PCR 擴(kuò)增后,分別獲得大小為1 401 bp 的片段,

    與預(yù)期結(jié)果一致.將測(cè)序結(jié)果在NCBI 上采用BLAST 進(jìn)行同源性比對(duì)分析,結(jié)果顯示分離菌株W6 的16SrRNA弗氏檸檬酸桿菌同源性均為99% 以上.采用MEGA7.0軟件,通過(guò)Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2),結(jié)果顯示該菌株與弗氏檸檬酸桿菌同一進(jìn)化分支.根據(jù)細(xì)菌形態(tài)觀察、生理生化鑒定結(jié)果及16SrRNA基因基因序列分析,可確定分離菌株W6 為弗氏檸檬酸桿菌.

    圖2 W6菌株16SrRNA基因序列與部分相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

    2.4 病原菌的耐藥性

    采用藥敏紙片法測(cè)試分離菌株W6對(duì)30種抗菌藥物的敏感性,結(jié)果如表2所示.分離菌株W6 僅對(duì)呋喃唑酮和頭孢他定2 種抗生素高度敏感;對(duì)丁胺卡那、頭孢哌酮、哌拉西林、多粘霉素B 等4 種藥物中度敏感;對(duì)麥迪霉素、青霉素、諾氟沙星、苯唑西林、氧氟沙星、氨芐西林、環(huán)丙沙星、慶大霉素、羧芐西林、萬(wàn)古霉素、卡那霉素、新霉素、頭孢氨芐、復(fù)方新諾明、四環(huán)素、頭孢唑啉、多西環(huán)素、頭孢拉定、氯霉素、米諾環(huán)素、頭孢呋辛、克林霉素、紅霉素、頭孢曲松等24種抗生素不敏感.

    表2 抗生素敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果(單位:mm)

    2.5 中草藥對(duì)病原菌的抑菌作用

    由表3可知,五味子、烏梅、黃芩、艾葉等4種草藥水提取液對(duì)分離菌株W6 具有一定抑菌作用.進(jìn)一步分析上述中草藥水提取液對(duì)分離菌株W6 的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC).具體結(jié)果如表4 所述,黃芩水提取液、烏梅水提取液、五味子水提取液、艾葉水提取液對(duì)分離菌株W6 的MIC 分 別 是23.0 mg/mL、1.6 mg/mL、2.4 mg/mL 和6.3 mg/mL;MBC 分別是46.0 mg/mL、3.1 mg/mL、4.9 mg/mL和12.5 mg/mL.

    表3 中草藥水提取液對(duì)菌株W6的抑菌活性

    表4 中草藥水提取液對(duì)菌株W6的MIC和MBC

    2.6 致病性試驗(yàn)

    對(duì)牛蛙進(jìn)行人工感染實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖3 所示.試驗(yàn)組的牛蛙在24 h 內(nèi)即出現(xiàn)死亡,并在48 h 內(nèi)累積死亡率即超過(guò)50%,在72 h 內(nèi)累積死亡率達(dá)到60%.而對(duì)照組僅在48 h時(shí)出現(xiàn)1個(gè)個(gè)體死亡的情況.這表明該分離菌株具有較強(qiáng)致病性.

    圖3 牛蛙注射W6菌株的累積死亡率

    3 討論

    3.1 弗氏檸檬酸桿菌的鑒定

    弗氏檸檬酸桿菌是一種革蘭氏陰性短桿菌屬腸桿菌科、枸櫞酸桿菌屬[13-14].一般而言,不同菌株來(lái)源的弗氏檸檬酸桿菌,其理化特性可能存在差異.劉張淮等[15]分離的克氏原螯蝦源弗氏檸檬酸桿菌與陳綺梨等[16]分離的加州鱸源弗氏檸檬酸桿菌,蘇英等[17]分離的大鯢源致病性弗氏檸檬酸桿菌以及本研究發(fā)現(xiàn)的分離菌株W6 其利用尿素的特性存在差異.有研究指出,同種不同來(lái)源菌株的生理生化特性差異可能與不同菌株的來(lái)源地區(qū)、氣候、實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件等差異有關(guān)[18].因此,細(xì)菌的鑒定通常需要在生理生化分析的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步結(jié)合分子鑒定加以確認(rèn)[19].

    3.2 弗氏檸檬酸桿菌的致病性

    弗氏檸檬酸桿菌作為一種水產(chǎn)動(dòng)物常見(jiàn)病原菌以及人魚共患的致病菌廣泛存在于自然水體中[20-21].感染水產(chǎn)動(dòng)物之后,可引起脾臟和肝臟壞死腫大,消化道出現(xiàn)炎癥,體表出血或腐爛,肌肉水腫等癥狀[15].此前有研究表明弗氏檸檬酸桿菌是牛蛙“紅腿癥”的致病菌之一[22-24].同時(shí)大量的研究證實(shí),弗氏檸檬酸桿菌可引起克氏原螯蝦[25]、羅非魚[26]、花鰻鱺[27]、團(tuán)頭魴[28]、大鯢[29]等水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的病害并造成較大的經(jīng)濟(jì)損失.不同來(lái)源的弗氏檸檬酸桿菌的致病性通常存在差異.陳綺梨等[16]對(duì)鱸源的弗氏檸檬酸桿菌進(jìn)行人工回歸感染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),經(jīng)1×108CFU/mL 菌懸液浸泡感染,在浸泡16 h 后出現(xiàn)死亡,連續(xù)觀察7 d 發(fā)現(xiàn)其累積死亡率達(dá)60%.蘇英等[17]對(duì)大鯢源弗氏檸檬酸桿菌進(jìn)行人工感染回歸實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),對(duì)大鯢的半致死濃度(LD50)為3.16×106CFU/mL.本實(shí)驗(yàn)的分離菌株在腹腔注射0.1 mL 1×108CFU/mL,在48 h其累積死亡率可達(dá)60%,這表明該分離菌株具有較強(qiáng)的致病性和毒力.

    3.3 弗氏檸檬酸桿菌的耐藥性

    弗氏檸檬酸桿菌對(duì)抗生素的耐藥性因菌株不同、宿主差異以及環(huán)境等因素存在差異.本研究的分離菌株對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類、青霉素類和四環(huán)素類抗生素已經(jīng)產(chǎn)生明顯耐藥性,這與蘇英等[17]、盧君輝等[30]、白杰等[31]的報(bào)道類似.而本研究的分離菌株W6 對(duì)諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星等喹諾酮類抗生素表現(xiàn)為耐藥性,這與陳綺梨等[16]的報(bào)道存在差異,但與張冬星等[28]的研究類似,這可能與菌株來(lái)源地的養(yǎng)殖環(huán)境、用藥情況以及宿主的差異有關(guān)[32].因此,對(duì)于養(yǎng)殖過(guò)程中出現(xiàn)的細(xì)菌性病害應(yīng)快速進(jìn)行病原分離鑒定和敏感藥物篩選,從而為病害科學(xué)防治提供依據(jù)[16].

    中草藥來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉、毒性低、不易產(chǎn)生耐藥性,在當(dāng)前限制使用抗生素的形勢(shì)下,使用中草藥提取物替代傳統(tǒng)抗生素已逐漸成為解決病原菌耐藥性的有效方式之一[12].本研究發(fā)現(xiàn)五味子、烏梅、黃芩、艾葉等中草藥水提取液對(duì)分離菌株W6具有一定的抑菌效果.在本課題組前期的研究中,五味子對(duì)嗜水氣單胞菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌都具有較強(qiáng)的抑菌作用[12].葉偉東等發(fā)現(xiàn)烏梅水提取液對(duì)加州鱸源的嗜水氣單胞菌具有良好的抑菌效果[33].這可能與五味子含有鞣質(zhì),烏梅含有有機(jī)酸等抗菌物質(zhì)有關(guān)[34-35].雖然體外抑菌實(shí)驗(yàn)表面五味子、烏梅、黃芩和艾葉對(duì)弗氏檸檬酸桿菌具有一定的防治效果,但抗菌機(jī)制還需進(jìn)一步研究.

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