氣相色譜-燃燒-同位素比質(zhì)譜法測(cè)定魷魚中甲醛穩(wěn)定碳同位素比值

韓 莉， 余婷婷， 劉 迪， 王會(huì)霞， 江 豐

（湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院 武漢430074）

我國(guó)是水產(chǎn)品的生產(chǎn)大國(guó)和消費(fèi)大國(guó)， 水產(chǎn)品的安全和質(zhì)量也受到人們的關(guān)注。 甲醛是水產(chǎn)品中經(jīng)常被檢出的一種化學(xué)污染物[1-2]，是一種無(wú)色，具有強(qiáng)烈刺激氣味的原生質(zhì)毒物，人長(zhǎng)期食用含有甲醛的食物，會(huì)對(duì)身體造成極大傷害，我國(guó)也早將甲醛列入農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其化合物清單》（農(nóng)業(yè)部193 號(hào)公告）禁用藥物名單[3]。 水產(chǎn)品中甲醛來(lái)源比較復(fù)雜：一是人為添加， 不法商販在水產(chǎn)保存和運(yùn)輸過程中添加甲醛水溶液，用于保鮮、漂白、防腐等作用；二是內(nèi)源產(chǎn)生，水產(chǎn)品自身代謝過程會(huì)產(chǎn)生一定量的甲醛[4]。水產(chǎn)品中魷魚的甲醛含量普遍偏高， 含量高達(dá)146 mg/kg，食品安全風(fēng)險(xiǎn)比較突出[5]。

目前，甲醛的測(cè)試方法有分光光度法[6-7]、熒光法[8]、氣相色譜法[9-10]、高效液相色譜法[11-15]等。 甲醛的含量測(cè)定只能說明食品中含有甲醛， 其來(lái)源卻無(wú)法判定，這也是目前食品安全質(zhì)量監(jiān)管的難點(diǎn)。穩(wěn)定同位素指紋分析技術(shù)可從原子角度探析化合物中元素的分布，在食品真實(shí)性鑒別、產(chǎn)地溯源等方面很有潛力，該技術(shù)已在小麥[16]、葡萄酒[17]、蜂蜜[18]、牛肉[19]、茶葉[20-21]等多種食品中成功應(yīng)用。 目前， 同位素分析技術(shù)用于食品中甲醛來(lái)源鑒別的報(bào)道尚少， 在大氣中甲醛來(lái)源分析方面有相關(guān)研究。余應(yīng)新等[22-23]利用單體化合物穩(wěn)定碳同位素方法研究了大氣中甲醛來(lái)源的問題。 郭宋軍等[24]和Guo 等[25]采用氣相色譜/燃燒/同位素比值質(zhì)譜（GC/C/IRMS）技術(shù)測(cè)定了廣州市大氣甲醛碳同位素組成。魷魚中普遍存在一定量的甲醛，內(nèi)源性甲醛是由氧化三甲胺在代謝過程中轉(zhuǎn)化而來(lái)[26]，其代謝效率受茶多酚、氯化鈣、乳糖等影響[27-29]。關(guān)于水產(chǎn)品中甲醛真實(shí)來(lái)源問題， 目前還沒有有效地判別方法。 利用單體化合物同位素指紋特征來(lái)表征魷魚中甲醛來(lái)源是一個(gè)新思路。 本文選用甲醛安全風(fēng)險(xiǎn)較高的魷魚為對(duì)象，建立衍生化-氣相色譜/燃燒/同位素比值質(zhì)譜（GC/C/IRMS）法測(cè)定魷魚中甲醛穩(wěn)定碳同位素的方法， 為甲醛來(lái)源解析提供科學(xué)依據(jù)， 為食品質(zhì)量安全監(jiān)管提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醛水溶液、2，4-二硝基苯肼（2， 4-Dinitrophenylhydrazine， DNPH）、 甲醛2，4-二硝基苯腙標(biāo)準(zhǔn)品 （Formaldehyde 2， 4-dinitrophenylhydrazone， FA-DNPH，99.8%），CATO 公司； 甲醛水溶液標(biāo)準(zhǔn)品（10 mg/L），F(xiàn)irst Standard 公司；正己烷、二氯甲烷、 乙酸乙酯， 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸溶液、氯化鈉（分析純級(jí)），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：咖啡因 （δ13C=-19.357‰，IAEA-600）、 乙醇溶液（δ13C=-26.72‰，BCR-660）。

1.2 儀器與設(shè)備

ME204/02 分析天平， 梅特勒-托利多儀器有限公司；WNE29 恒溫水浴搖床， 德國(guó)memmert 公司；S180H 超聲儀， 德國(guó)Elma 公司；Allegra 64R冷凍離心機(jī)， 美國(guó)貝克曼公司；N-EVAP112 氮吹儀，美國(guó)Organomation Associates Inc 公司；e2695高效液相色譜儀， 美國(guó)Waters 公司；DeltaV 氣體穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀（配備有Thermo 氣相色譜儀、Flash 2000HT 元素分析儀）， 美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理 魷魚樣品購(gòu)買自6 個(gè)省9 個(gè)城市區(qū)域，內(nèi)臟部分為樣品A，剔除內(nèi)臟剩余部分為樣品B，整條魷魚為樣品C，樣品A、B、C 均切碎后研磨成泥，-20 ℃保存。衍生試劑2，4-二硝基苯肼用色譜純的乙腈重結(jié)晶兩次后用高效液相色譜檢驗(yàn)其純度。 將過量的純化過的DNPH 溶于24 mL 鹽酸，再加水定容至100 mL，配制得到衍生溶液。

1.3.2 FA 的含量測(cè)試 準(zhǔn)確稱取2 g 魷魚樣品于50 mL 離心管中，加入10 mL 水，蓋上蓋子后超聲提取30 min，9 000r/min、4 ℃高速離心10 min，取上清液于另一個(gè)干凈的離心管，加入1 mL DNPH衍生溶液（根據(jù)魷魚樣品中甲醛含量調(diào)整衍生溶液的添加量），迅速密封，將離心管置于60 ℃恒溫水浴搖床衍生反應(yīng)1 h， 待冷卻至室溫， 用0.22 μm 濾膜過濾，衍生物的含量在高效液相色譜儀中完成，工作曲線標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品相同的衍生操作，擬定衍生物線性曲線間接計(jì)算魷魚樣品中FA 的含量。

高效液相色譜儀工作條件如下： 化學(xué)鍵合C18 柱（4.6 mm×250 mm）；柱溫30 ℃；流動(dòng)相V乙腈∶V水=7 ∶3；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；紫外檢測(cè)器，檢測(cè)器波長(zhǎng)355 nm。

1.3.3 FA 標(biāo)準(zhǔn)樣的穩(wěn)定碳同位素測(cè)試 取1 mL 37% FA 溶液于5 mL 樣品頂空瓶中，加入適量的氯化鈉，樣品瓶置于65 ℃反應(yīng)箱平衡90 min，用5 mL 氣體進(jìn)樣針抽取2 mL 頂空氣體， 通過GC/C/IRMS 測(cè)定頂空氣體中FA 的穩(wěn)定碳同位素比值，參 考 氣CO2的δ13CPDB 值采用乙醇 （δ13C=-26.72‰，BCR-660）矯正。

氣相色譜儀工作條件如下： 測(cè)定FA 標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，采用HP-INNOWAX 強(qiáng)極性色譜柱（30 m×0.25 mm×20 μm）；柱溫65 ℃，進(jìn)樣口溫度250 ℃，氦氣流速1.5 mL/min。

1.3.4 甲醛2，4-二硝基苯腙的穩(wěn)定碳同位素測(cè)試 向1.3.2 節(jié)衍生好的溶液中加入10 mL 的正己烷， 翻轉(zhuǎn)搖勻充分萃取，4 000 r/min、4 ℃離心3 min，取上層正己烷置于50 mL 離心管中，向殘留水溶液中再加入10 mL 正己烷， 再重復(fù)萃取2～3次，合并正己烷層，將萃取液置于氮吹儀吹干，用甲醇定容至1 mL， 通過GC/C/IRMS 測(cè)定甲醛2，4-二硝基苯腙的穩(wěn)定碳同位素值， 參考?xì)釩O2的δ13CPDB 值采用乙醇（δ13C=-26.72‰，BCR-660）矯正。

氣相色譜儀工作條件如下：測(cè)定甲醛2，4-二硝基苯腙時(shí)，色譜柱為HP-5MS 弱極性柱（30 m×0.25 mm×20 μm）：程序升溫條件從50～200（20 ℃/min）～250 （3 ℃/min）～290 ℃（20 ℃/min）， 保留5 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃，氦氣流速1.0 mL/min。

1.3.5 2，4-二硝基苯肼的穩(wěn)定碳同位素測(cè)試 通過百萬(wàn)分之一天平稱取處理好的2，4-二硝基苯肼粉末0.1～2 mg 于錫杯， 通過自動(dòng)進(jìn)樣盤進(jìn)樣，采用元素分析-同位素比值質(zhì)譜法（EA-IRMS）測(cè)定2，4-二硝基苯肼的穩(wěn)定碳同位素值。 參考?xì)釩O2的δ13CPDB 值采用咖啡因（δ13C=-19.357‰，IAEA-600）矯正。

元素分析儀工作條件如下： 燃燒爐溫度960℃，氦氣流速90 mL/min，二氧化碳參考?xì)饬魉?80 mL/min，氧氣流速230 mL/min，色譜柱溫50 ℃。

1.3.6 液相衍生化過程的同位素效應(yīng)試驗(yàn) 向離心管加入10 μL 37% FA 溶液，混勻后向其中加入1 mL 的DNPH 衍生溶液（過量），衍生、萃取及測(cè)試同1.3.2 節(jié)和1.3.4 節(jié)方法。

1.4 計(jì)算方法

Wen 等[30]通過測(cè)定DNPH 和甲醛2，4-二硝基苯腙的穩(wěn)定碳同位素比值，以質(zhì)量平衡方程【式（1）】 間接計(jì)算而得到FA 的穩(wěn)定碳同位素比值，余應(yīng)新等[22]也用該方法對(duì)大氣中FA 的穩(wěn)定碳同位素比值進(jìn)行了分析。

式中，fFA——參加反應(yīng)的甲醛的碳原子在衍生物中的占比；fDNPH——參加反應(yīng)的2，4-二硝基苯肼的碳原子在衍生物中的占比；其中fFA+fDNPH=1。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器穩(wěn)定性分析

IRMS 系統(tǒng)的性能優(yōu)劣是確定碳穩(wěn)定同位素比值能否被認(rèn)可的重要指標(biāo)。 驗(yàn)證IRMS 系統(tǒng)的測(cè)定穩(wěn)定性， 連續(xù)10 次通入固定體積的CO2氣體，測(cè)定CO2中δ13C，結(jié)果見表1。 其標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.016‰，穩(wěn)定性較好。

表1 IRMS 系統(tǒng)穩(wěn)定性Table 1 Stability of IRMS system

2.2 FA 的δ13C 值測(cè)試結(jié)果

FA 溶液中的δ13C 值由頂空-GC/C/IRMS 法測(cè)定，直接測(cè)定FA 的靈敏度較低，需對(duì)平衡過程及條件進(jìn)行優(yōu)化以達(dá)到GC/C/IRMS 方法測(cè)定FA 的靈敏度。由圖1a 可知，高溫可以促進(jìn)FA 從液相向氣相擴(kuò)散，提高平衡溫度可以提高頂空FA 含量，然而當(dāng)溫度太高時(shí)，F(xiàn)A 的含量卻有所降低， 可能太高的溫度會(huì)導(dǎo)致頂空瓶瓶蓋變形， 部分氣體逸散，因此最優(yōu)平衡溫度為65 ℃。 FA 產(chǎn)生量與平衡時(shí)間的關(guān)系如圖1b 所示， 反應(yīng)在90 min 時(shí)基本可以達(dá)到平衡狀態(tài)。 向FA 溶液中加入一定量的氯化鈉可以降低FA 在水中的溶解度，提高FA 測(cè)定的靈敏度，如圖1c 所示，氯化鈉的最佳添加量為2 g。 從圖1d 可知，F(xiàn)A 含量對(duì)δ13C 值的測(cè)定影響不大，3 個(gè)含量水平的FA 溶液δ13C 值標(biāo)準(zhǔn)偏差SD 僅為0.056‰。對(duì)同一含量水平的FA 測(cè)定3 次平行，其平均值為-35.937‰，SD 為0.121‰，以該值為后文中液相衍生化過程同位素效應(yīng)驗(yàn)證試驗(yàn)中FA 的δ13C 值。

圖1 FA 測(cè)試方法優(yōu)化結(jié)果示意圖Fig.1 Schematic diagram of optimization results of FA test method

2.3 DNPH 的δ13C 值測(cè)試結(jié)果

DNPH 的δ13C 值由EA/IRMS 法測(cè)定， 進(jìn)樣5次，得到的結(jié)果如表2 所示。測(cè)定得到的δ13C 值平均值為-28.154‰，SD 為0.104‰。 本研究所用到的衍生劑均由該純化過的DNPH 固體配制而來(lái)。

表2 DNPH 的δ13C 值結(jié)果Table 2 Results of δ13C value of DNPH

2.4 甲醛2，4-二硝基苯腙的δ13C 值測(cè)試結(jié)果

甲醛2，4-二硝基苯腙標(biāo)準(zhǔn)品的δ13C 值由GC/C/IRMS 測(cè)定，其色譜峰峰形對(duì)稱、尖銳。 不同質(zhì)量濃度梯度（0.2～2 mg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)溶液中甲醛2，4-二硝基苯腙的δ13C 值如圖2 所示，SD 值為0.124‰，說明其δ13C 值的測(cè)定受質(zhì)量濃度影響很小， 測(cè)定6 組質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液，甲醛2，4-二硝基苯腙的δ13C 值SD 為0.189‰，說明碳同位素測(cè)試穩(wěn)定性較好。

圖2 甲醛2，4-二硝基苯腙δ13C 值結(jié)果示意圖Fig.2 Schematic diagram of δ13C value on formaldehyde 2，4-dinitrophenylhydrazone

對(duì)同一質(zhì)量濃度下， 分別對(duì)采用二氯甲烷、甲醇、正己烷、乙腈稀釋的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行穩(wěn)定碳同位素分析，δ13C 值如下表3，不同溶劑的選擇對(duì)甲醛2，4-二硝基苯腙的δ13C 值無(wú)明顯的影響。衍生產(chǎn)物可采用下表中的溶劑復(fù)溶上GC/C/IRMS 進(jìn)行測(cè)試。

表3 不同溶劑稀釋下甲醛2，4-二硝基苯腙的δ13C 值Table 3 δ13C value of formaldehyde 2， 4-dinitrophenylhydrazone diluted with different solvents

2.5 液相衍生化過程同位素效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果

5 組液相衍生化過程的測(cè)試結(jié)果如表5 所示，由甲醛和DNPH 在酸性條件下衍生而產(chǎn)生的甲醛2，4-二硝基苯腙的δ13C 理論值是經(jīng)質(zhì)量平衡方程（1）計(jì)算而來(lái)，測(cè)定值是經(jīng)GC/C/IRMS 測(cè)定得到。從表4 可知，甲醛和DNPH 的衍生化過程是符合質(zhì)量平衡方程的， 衍生物δ13C 理論值和測(cè)定值差值低于0.344‰，差值SD 為0.215‰。 可以認(rèn)為在DNPH 過量的情況下， 甲醛在衍生化過程中是不存在穩(wěn)定碳同位素的分餾的。

表4 液相衍生化過程結(jié)果表（‰）Table 4 The results of liquid phase derivatization process （‰）

根據(jù)Rieley[31]提出的同位素效應(yīng)理論，化學(xué)反應(yīng)中的同位素分餾與決定反應(yīng)速率的那一級(jí)反應(yīng)有關(guān)， 碳原子相連的化學(xué)鍵的斷裂和生成才會(huì)導(dǎo)致碳同位素發(fā)生分餾。 FA 和DNPH 的反應(yīng)如圖3所示，F(xiàn)A 中的碳原子參與了化學(xué)鍵的斷裂和生成，DNPH 中僅有氮原子參與了化學(xué)鍵的斷裂和生成，2，4-二硝基苯基中無(wú)碳原子參與反應(yīng)。 而且， 該反應(yīng)中DNPH 是過量的，F(xiàn)A 是定量完全反應(yīng)了， 因此整個(gè)反應(yīng)過程中碳同位素豐度比沒有發(fā)生改變， 可以認(rèn)為甲醛液相衍生化反應(yīng)無(wú)碳同位素分餾。

圖3 衍生反應(yīng)的結(jié)構(gòu)式示意圖Fig.3 Structural formula schematic of the derived reaction

2.6 魷魚樣品中FA 含量及δ13C 值測(cè)試結(jié)果分析

對(duì)市售9 個(gè)沿海城市鮮活魷魚中FA 含量進(jìn)行測(cè)試，除去內(nèi)臟的魷魚身體、魷魚全部、內(nèi)臟3部分的含量分布如圖4 所示。試驗(yàn)結(jié)果表明，魷魚中普遍存在一定量的FA， 其含量0.341～39.132 mg/kg。 總體來(lái)看，魷魚內(nèi)臟中FA 的含量最高，如樣品3 中內(nèi)臟的FA 含量高達(dá)39.132 mg/kg，除去內(nèi)臟后的身體中FA 含量為4.382 mg/kg， 說明內(nèi)源性的甲醛可能主要是在魷魚內(nèi)臟產(chǎn)生。 樣品1例外，其內(nèi)臟中FA 含量低于全部樣品中FA 的含量， 可能該樣品中添加了一定量的外源性FA，使得其分布異常。

圖4 魷魚中甲醛含量示意圖Fig.4 Diagram of formaldehyde content in squid

對(duì)FA 含量較高的2、3、4、5 4 個(gè)魷魚樣品進(jìn)一步測(cè)定衍生產(chǎn)物的δ13C 值， 經(jīng)過質(zhì)量平衡方程（1）計(jì)算得到的魷魚中甲醛的δ13C 值如表5 所示，不同產(chǎn)地魷魚中甲醛的δ13C 值差異最大可達(dá)23.653‰， 同位素指紋特征的差異可能是由于地域差異導(dǎo)致魷魚有機(jī)體中碳元素分布差異造成，也可能是不同樣品中內(nèi)外源甲醛貢獻(xiàn)率的差異所致。

表5 魷魚中FA 的δ13C 值結(jié)果表（‰）Table 5 δ13C value of FA in squid （‰）

3 結(jié)論

本研究利用DNPH 與FA 在酸性條件下發(fā)生液相衍生化反應(yīng)， 將易揮發(fā)的小分子FA 轉(zhuǎn)化成難揮發(fā)的甲醛2，4-二硝基苯腙，在氣相色譜柱上具有更好的保留與靈敏度。 通過測(cè)定衍生劑DNPH 和衍生產(chǎn)物甲醛2，4-二硝基苯腙的δ13C值，液相衍生化反應(yīng)不產(chǎn)生碳同位素分餾，因此由質(zhì)量平衡方程可以間接計(jì)算得到FA 的δ13C 值。該方法可用于魷魚中FA 的δ13C 值測(cè)定， 魷魚的產(chǎn)地以及人為添加使用FA 均會(huì)對(duì)魷魚中FA 的δ13C 值產(chǎn)生影響。 本研究為魷魚中甲醛的來(lái)源判別提供了新思路， 為保障水產(chǎn)品的質(zhì)量安全提供了技術(shù)支撐。