干燥方式對秋葵多糖結(jié)構(gòu)特征和抗氧化性的影響

王 喆， 馬璐瑤， 林海峰， 聶少平， 殷軍藝

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室 南昌330047）

秋葵【Abelmoschus esculentus （L.） Moench】是藥食兩用的一年生草本，有多個品種[1]。 最初生長于非洲，現(xiàn)廣泛種植于亞熱帶與熱帶地區(qū)，在我國一些地區(qū)（江西、海南、廣東等）也有種植。 這種營養(yǎng)成分豐富、 有一定保健作用的蔬菜深受人們的喜愛。

秋葵多糖是一種酸性多糖，主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和半乳糖醛酸等組成[2]。 它具有抗疲勞[3]，抗氧化[4]，調(diào)節(jié)血糖、血脂[5-6]，改善腸道狀況[7]，調(diào)節(jié)免疫[8]等多種功能活性。秋葵多糖在合成材料上有應(yīng)用前景，可以提高絮凝劑的混凝活性[9]，提高乙酰二胺的促生長活性[10]，強化其它材料的凝膠性[11]，甚至還可用于改變羥基磷灰石的孔隙率， 有望作為骨與軟骨的修復(fù)材料[12]。 在醫(yī)藥領(lǐng)域，秋葵多糖也有一定價值，它可以合成納米銀離子[13]，還可以制成運載藥物的包材[14]。

新鮮秋葵水分含量高，容易腐敗變質(zhì)，干燥后可以延長秋葵的儲存時間并保留其營養(yǎng)成分[15]。多糖是秋葵中主要的營養(yǎng)成分之一。 對于果蔬的干燥方法已有一些研究， 常用的干燥方法有真空干燥、冷凍干燥、熱風(fēng)干燥、紅外干燥和微波干燥等[16-17]。不同干燥方式的干燥效率與能耗都有所不同， 干燥處理后多糖的結(jié)構(gòu)特征和功能性質(zhì)也會發(fā)生變化。 本文以秋葵為原料，去頭、尾后采用不同干燥方式前處理，然后提取制備多糖，并用多種分析方法比較多糖的結(jié)構(gòu)， 分析干燥方式對秋葵水溶性多糖結(jié)構(gòu)特征以及抗氧化功能的影響，為秋葵加工提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮秋葵購于江西省萍鄉(xiāng)市福田鎮(zhèn)。

葡萄糖（Glucose， Glc）、半乳糖醛酸（Galacturonic acid， GalA）、鼠 李 糖（Rhamnose， Rha）、阿拉伯糖 （Arabinose， Ara）、 半乳糖（Galactose，Gal），美國Merck（Sigma-Aldrich）公司；葡萄糖醛酸 （Glucuronic acid， GlcA）、 葡聚糖標(biāo)準品（MW2.0×106，5.0×105，7.0×104，4.0×104，1.0×104u）、考馬斯亮藍G-250、牛血清蛋白、沒食子酸、福林酚，上海阿拉丁試劑有限公司；乙醇，西隴科學(xué)股份有限公司；濃硫酸等其它化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純級，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Aglient 1260 超高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；Bruker AVANCE Ⅲ HD 400 MHz NMR 光譜儀， 瑞士Bruker 公司；Dionex ICS 5000 離子色譜儀、Nicolet 5700 紅外光譜儀、Varioskan Flash 多功能酶標(biāo)儀，美國Thermo Scientific 公司；JSM-7610F 場發(fā)射掃描電鏡帶能譜儀，日本電子公司；ARES-G2 流變儀，美國TA 公司；TU 1900 紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；12 L 立式冷凍干燥機， 美國Labconco 公司；DSH-50 A-1 水分測定儀，上海佑科儀器儀表有限公司；Milli-Q 超純水儀，美國Millipore 公司；AL104 電子天平，上海梅特勒-托利多儀器公司。

1.3 秋葵干燥與秋葵多糖提取

1.3.1 秋葵預(yù)處理 取形態(tài)大小相似秋葵等分3份，將其洗凈切成2.5 cm 小段，一份在50 ℃干燥48 h 后粉碎得到熱風(fēng)干燥的秋葵原料， 一份在自然狀態(tài)下干燥72 h 后粉碎得到自然干燥的秋葵原料， 一份在-80 ℃干燥68 h 后粉碎得到冷凍干燥的秋葵原料。

1.3.2 秋葵多糖提取 稱取一定量的秋葵干粉，按料液比1 ∶10 加入95%乙醇浸泡24 h 脫色，過濾收集樣品，揮干乙醇后，按料液比1 ∶60 加入蒸餾水，于60 ℃下水浴條件下提取4 h，離心收集殘渣，沉淀物重復(fù)提取一次，合并上清液，經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后緩慢加入95%乙醇醇沉（終體積分數(shù)約為80%），靜置過夜。離心收集沉淀，加入蒸餾水復(fù)溶濃縮后再次醇沉離心收集沉淀，復(fù)溶于水，濃縮凍干得到秋葵多糖。將從熱風(fēng)干燥、自然干燥和真空冷凍干燥后的秋葵中提取得到的多糖，分別記為OPH-60，OPN-60 和OPF-60。

1.4 基本理化性質(zhì)測定

1） 總糖測定 以葡萄糖為標(biāo)準品， 采用苯酚-硫酸法測定總糖含量[18]。

2） 蛋白質(zhì)含量測定 以牛血清白蛋白為標(biāo)準品，采用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量[19]。

3） 糖醛酸含量測定 以半乳糖醛酸為標(biāo)準品，采用硫酸-咔唑法測定糖醛酸含量[20]。

4） 總酚含量測定 以沒食子酸為標(biāo)準品，采用福林酚法測定總酚含量[21]。

1.5 單糖組成

稱取5.0 mg 樣品加入試管中， 在冰浴條件下加入12 mol/L 硫酸0.5 mL 水解，加入2.5 mL 超純水混勻，于120 ℃油浴鍋中水解2 h，然后將水解液加水定容、 稀釋， 過孔徑為0.22 μm 的水系濾膜，進樣檢測[22-23]。

色譜條件： 高效陰離子交換色譜配備CarboPacTMPA20 保護柱 （3 mm × 30 mm） 和CarboPacTMPA20 分析柱（3 mm×150 mm）串聯(lián)；流動相：A 為250 mmol/L 氫氧化鈉，B 為超純水，C 為1 mol/L 醋酸鈉，D 為超純水；流速為0.5 mL/min，進樣量為10 μL。

1.6 相對分子質(zhì)量測定

使用流動相溶解樣品配制成1 mg/mL 溶液，采用孔徑為0.22 μm 的水系濾膜后進樣檢測。

色譜條件：安捷倫1260 型超高效液相色譜儀系統(tǒng)， 帶有UltrahydrogelTM分析柱 （7.8 mm×300 mm）； 流動相為0.1 mol/L NaNO3和0.02% NaN3的混合溶液；流速為0.6 mL/min；柱溫為35.0 ℃。

1.7 紅外光譜測定

取適量樣品采用壓片法， 用傅里葉紅外光譜于波長4 000～500 cm-1區(qū)域內(nèi)進行掃描， 掃描分辨率為4 cm-1。

1.8 核磁共振光譜測定

取多糖樣品使其完全溶于D2O 中， 充分交換12 h 以上然后凍干， 重復(fù)3 次， 最后用99.9%的D2O 溶解取適量溶液加入核磁管中，靜置過夜，采用400 MHz 核磁共振儀用5 mm 探頭在50 ℃掃描64 次進行核磁共振分析。

1.9 掃描電鏡測定

配置1 mg/mL 的多糖溶液，置于液氮中冷卻10 min 后凍干， 取樣品進行噴金處理， 用JSM-6701F 型場發(fā)射掃描電鏡帶能譜儀觀察樣品表觀形態(tài)。

1.10 表觀黏度測定

配置質(zhì)量分數(shù)為1%的多糖溶液，完全溶解后于室溫靜置12 h 后用ARES-G2 流變儀測定，同時采用TA-Orchestrator-7 軟件采集數(shù)據(jù)。

測試條件：溫度25 ℃，40 mm 不銹鋼平板，上下板間距0.4 mm，剪切速率0.01～1 000 s-1。

1.11 體外抗氧化活性測定

參照文獻并略作修改進行試驗。 分別測定3種多糖對DPPH 自由基清除能力[24]、羥自由基清除能力[25]以及對金屬離子螯合能力[24]，DPPH 自由基和羥自由基清除能力試驗中以VC 作為陽性對照，金屬離子螯合能力試驗以EDTA 為陽性對照。根據(jù)以下公式得出多糖及陽性對照的清除率和螯合率。

式中，A0——蒸餾水的吸光度；A1——多糖溶液本身的吸光度；A2——加入多糖后的吸光度。

1.12 數(shù)據(jù)分析

文中表格數(shù)據(jù)采用SPSS 的單因素方差分析進行評價， 圖是根據(jù)數(shù)據(jù)由Origin 2017 處理繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋葵多糖基本理化性質(zhì)及單糖組成

秋葵經(jīng)不同干燥方式處理后提取所得水溶性多糖， 其基本理化性質(zhì)和單糖組成結(jié)果如表1 所示。 3 種多糖的總糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)、總酚含量分別處于67.0%～69.6%、34.3%～38.4%、2.6%～4.5%和0.6%～1.0%。 其中，冷凍干燥后的樣品OPF-60中總糖和糖醛酸含量最高， 達到69.6%和38.4%，這可能是由于冷凍干燥過程中植物機制內(nèi)會形成冰晶，導(dǎo)致了植物細胞結(jié)構(gòu)更大程度的破裂，促進了樣品中活性成分的提取[28]，而在熱風(fēng)干燥和自然干燥過程中， 糖醛酸等會因為較高的環(huán)境溫度而變性[29]。

表1 3 種干燥方式秋葵多糖的理化性質(zhì)（n=3）Table 1 Physical and chemical properties of okra polysaccharides in three drying methods（n=3）

通過離子色譜儀測定3 種干燥方式多糖單糖組成，發(fā)現(xiàn)均主要由Rha（13.9%～14.9%）、Gal（21.4%～23.4%）和GalA（10.3%～14.7%）組成，而在含量上有所不同，具有結(jié)構(gòu)差異。常用6 種單糖組成比來評價果膠多糖的結(jié)構(gòu)特征[26-27]，其中R1是果膠主鏈糖GalA 與側(cè)鏈中所含中性糖的比例，常用作估算果膠線性度。3 種多糖R1值一致，表明線性程度接近；R2表示鼠李半乳糖醛酸（RG）對果膠的貢獻，多糖的R2值依次為OPN-60＞OPH-60＞OPF-60， 表明冷凍干燥降低了果膠的支鏈程度；R3值反映了RG 的半乳糖側(cè)鏈長度，OPN-60 在3種干燥方式中顯示出最高的RG 分支。 在這3 種多糖中，I 型鼠李糖半乳糖醛酸聚糖（RG-I）的范圍為97.7 至100.0。

2.2 分子質(zhì)量分布

采用HPGPC 法測定干燥方式對多糖的分子質(zhì)量分布的影響（圖1），根據(jù)標(biāo)準品洗脫的時間和分子質(zhì)量建立標(biāo)準曲線計算3 種多糖的分子質(zhì)量，3 種多糖在7～16 min 范圍內(nèi)主要有5 個信號峰，信號峰的分布范圍較寬且互相重疊，其中10 min 左右的峰分子質(zhì)量最大（＞2×106u），3 種干燥方式多糖分子質(zhì)量分布基本相似， 然而在低分子質(zhì)量區(qū)域還是存在一定的不同。

圖1 3 種干燥方式秋葵多糖的HPGPC 圖Fig.1 HPGPC diagram of okra polysaccharides in three drying methods

表2 列出了秋葵多糖每個信號峰對應(yīng)的具體分子質(zhì)量數(shù)值，3 種多糖的分子質(zhì)量分布在1.76×104～2.04×107u， 出峰時間最早的組分P 1 的相對分子質(zhì)量最大的為OPN-60 和OPF-60，最小的為OPH-60。

表2 3 種干燥方式秋葵多糖的分子質(zhì)量分布（u）Table 2 Molecular weight distribution of okra polysaccharides in three drying methods （u）

2.3 干燥方式對秋葵多糖紅外光譜的影響

由圖2 可知，3 400 cm-1處的強吸收峰為多糖類物質(zhì)的特征吸收峰，是O-H 的伸縮振動[30]。 在2 970 cm-1和2 925 cm-1處的吸收峰可能為CH2、CH3或GalA 單元的C-H 伸縮振動[31]。 而在1 600 cm-1處的吸收峰為COO-的伸縮振動[32]。 1 400 cm-1和1 260 cm-1附近的弱吸收峰為GalA 和GlcA 中羧酸的C-O 伸縮振動[33]。 此外，1 048 cm-1附近為果膠的特征吸收峰[34]；在880 cm-1左右的吸收峰表明多糖可能存在β 構(gòu)型， 而840 cm-1也出現(xiàn)了代表α 構(gòu)型的弱吸收峰。 由以上結(jié)果可知，3 種多糖主要官能團相似， 且都具有果膠多糖的特征吸收峰。

圖2 3 種干燥方式對秋葵多糖紅外光譜特征的影響Fig.2 Effects of three drying methods on infrared spectra characteristics of okra polysaccharides

2.4 干燥方式對秋葵多糖1H NMR 的影響

圖3 為不同干燥方式秋葵多糖于50 ℃條件下的1H NMR 譜圖。 與文獻報道相比本試驗的NMR 譜圖向低場方向略有偏移。 3 種多糖的譜圖雖然相似，但也有一定的差異。 很明顯，3 種多糖中都含有非支鏈的α-1，2-連接的鼠李糖（δ 1.41）和支鏈α-1，2，4-連接的鼠李糖（δ 1.49），在δ 2.07～2.27 范圍的共振信號為-CH3的質(zhì)子峰， 證明了O-乙?；拇嬖赱35]。在δ 4.45～4.65 范圍內(nèi)出現(xiàn)的異頭信號表明存在末端半乳糖或1，4-連接的半乳糖[36]。在δ 3.98 處有一處較大的信號峰，可能是由于甲基與半乳糖醛酸上羧基的結(jié)合所致[37]。

圖3 3 種干燥方式對秋葵多糖1H NMR 譜圖的影響Fig.3 Effects of three drying methods on 1H NMR diagram of okra polysaccharides

2.5 干燥方式對秋葵多糖表面形貌的影響

由圖4 可知，3 種多糖的微觀結(jié)構(gòu)相似，其主體均由線性結(jié)構(gòu)和片狀結(jié)構(gòu)組成。 其中，OPH-60為線性結(jié)構(gòu)，OPN-60 為線性結(jié)構(gòu)和片狀結(jié)構(gòu)交聯(lián)，OPF-60 主要為線性和片狀結(jié)構(gòu)， 除此之外還分布著多孔結(jié)構(gòu)， 這是由于原料在冷凍干燥過程中， 水分直接由固態(tài)升華到氣態(tài)而未受到外力的破壞所致[28]。

圖4 3 種干燥方式對秋葵多糖微觀結(jié)構(gòu)的影響（5 000×）Fig.4 Effects of three drying methods on the microstructure of okra polysaccharies （5 000×）

2.6 干燥方式對秋葵多糖流變特性的影響

由圖5 可知，剪切速率在0.1～1 000 s-1范圍，3 種秋葵多糖的表觀黏度隨著剪切速率的增大而減小，表現(xiàn)出明顯的剪切稀化現(xiàn)象，多糖黏度減小原因是隨著剪切速率的加快， 分子間的相互作用力被破壞，使得多糖流動性增大[38]。 在0.1～1 000 s-1范圍的剪切速率下，OPH-60 表觀黏度最大，OPF-60 表觀黏度其次，OPN-60 的表觀黏度最小， 這可能與樣品總蛋白質(zhì)與單糖組成的類型和含量有關(guān)[39]，例如有文獻報道稱，蛋白質(zhì)含量降低，黏度增大[40]。 此外3 個組分間的黏度差異可能和分子質(zhì)量也有關(guān)系，即通過測定過膜前、后多糖的糖含量，發(fā)現(xiàn)其含量差異較大，濾膜對于多糖的截留率從大到小依次為OPF-60（50.93%）＞OPN-60（45.86%）＞OPH-60（40.58%），這可能是由于較小孔徑的水系濾膜將多糖中較大的分子質(zhì)量的組分截留在膜外， 因此導(dǎo)致較大分子質(zhì)量組分未通過儀器檢測，使得測得的分子質(zhì)量相似。

圖5 3 種干燥方式對秋葵多糖表觀黏度的影響Fig.5 Effects of three drying methods on apparent viscosity of okra polysaccharides

采用Power-law 模型計算3 種干燥方式秋葵多糖剪切稀化的流變參數(shù)， 模型擬合R2＞0.99，表3 中可以發(fā)現(xiàn)它們的流動特性指數(shù)均小于1，表明3 種多糖均屬于假塑性流體。 它們的K 值大小依次是OPH-60＞OPF-60＞OPN-60，與表觀黏度的變化趨勢一致，OPN-60 的n 值最大， 其假塑性相對最低。

表3 3 種干燥方式秋葵多糖的剪切稀化流變參數(shù)（n=3）Table 3 Rheological parameters of shear thinning of okra polysaccharide in three drying modes （n=3）

2.7 干燥方式對秋葵多糖體外抗氧化活性的影響

圖6 顯示3 種秋葵多糖對DPPH 自由基、羥自由基清除能力和金屬離子螯合能力。 從圖中可以看出， 隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，3 種多糖對DPPH 自由基、 羥自由基清除能力和金屬離子螯合能力也都增強。 在相同的多糖質(zhì)量濃度， 對于DPPH 自由基的清除能力依次為OPN-60>OPH-60>OPF-60； 對于羥自由基，OPN-60 的清除能力最強，OPH-60 和OPF-60 的清除能力相似；3 種多糖對金屬離子的螯合能力依次為OPN-60>OPH-60>OPF-60?？傮w數(shù)據(jù)來看，3 種秋葵多糖都具有體外抗氧化活性，OPN-60 的體外抗氧化活性最強，這可能是與多糖中的總酚含量有一定關(guān)系，有研究表明多糖中其抗氧化作用的主要物質(zhì)是多酚[41]。

圖6 3 種干燥方式秋葵多糖的抗氧化能力Fig.6 Antioxidant capacity of okra polysaccharide in three drying methods

3 結(jié)論

3 種干燥方式處理秋葵， 得到的秋葵多糖都是RG-I 型果膠多糖， 它們的得率和化學(xué)組成都有所不同，秋葵多糖的蛋白質(zhì)含量、糖醛酸含量、總酚含量出現(xiàn)了顯著變化。通過單糖組成、紅外光譜和表面形貌分析， 發(fā)現(xiàn)干燥方式主要對多糖相關(guān)成分的含量（如單糖組成比例、官能團響應(yīng)值之間的比例） 產(chǎn)生影響， 而對它們的種類影響不明顯。 3 種干燥方式秋葵多糖都表現(xiàn)出弱凝膠行為，都屬于假塑性流體， 熱風(fēng)干燥處理的秋葵所提取的多糖黏度相對較大， 在體外抗氧化活性中可以發(fā)現(xiàn)OPN-60 的抗氧化活性最好， 真空冷凍干燥得到的多糖中總糖、糖醛酸含量最高。 3 種方法在對樣品的處理后得到的多糖都有其各自結(jié)構(gòu)和功能特性。