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    基于宏基因組分析酸馬奶的微生物多樣性及功能基因

    2022-03-04 04:53:50夏亞男
    中國(guó)食品學(xué)報(bào) 2022年2期
    關(guān)鍵詞:馬奶酮酸脫氫酶

    夏亞男, 劉 皓, 雙 全

    (內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 呼和浩特010000)

    傳統(tǒng)酸馬奶(Koumiss)制作和食用歷史悠久,是最受中亞和東歐地區(qū)人們喜愛的傳統(tǒng)發(fā)酵乳飲料,它不僅營(yíng)養(yǎng)豐富,而且對(duì)某些疾病有治療效果[1-2]。在我國(guó),酸馬奶是一種具有民族特色的發(fā)酵乳飲料, 我國(guó)內(nèi)蒙古和新疆地區(qū)人民對(duì)其十分偏愛。新鮮的馬奶在乳酸菌、酵母菌和其它微生物的共同作用下,經(jīng)特定溫度和時(shí)間發(fā)酵形成酸馬奶。酸馬奶具有良好的、 特殊的風(fēng)味口感和一定的醫(yī)療保健作用,如有助于人體消化吸收、預(yù)防各種腸胃道疾病,還可以降低血脂和膽固醇[3-4]。

    酸馬奶獨(dú)特風(fēng)味及功能特性的形成與其復(fù)雜的微生物群落密切相關(guān)。 微生物將鮮馬奶中的各類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪酸等)不斷分解、代謝,生成相應(yīng)的風(fēng)味物質(zhì)以及具有特定功能的生物活性成分。 近年來,采用16s rRNA 技術(shù)[5-6]檢測(cè)酸馬奶的微生物多樣性時(shí)發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)方法發(fā)酵得到的酸馬奶中, 乳酸菌和酵母菌占菌群的絕大部分,不同微生物之間存在相互作用,其微生物菌群體系與開菲爾非常相似[7-8]。采用16s rRNA技術(shù)檢測(cè)酸馬奶的微生物多樣性只能確定到屬水平,無法精確到種水平,對(duì)功能基因的挖掘存在一定的局限性。

    宏基因組學(xué)(Metagenonics)是基于提取特定環(huán)境中全部微生物的DNA, 構(gòu)建宏基因組文庫(kù),來探索微生物群落功能, 挖掘功能基因的一門技術(shù)[5-8]。傳統(tǒng)宏基因組學(xué)研究技術(shù)包括芯片、克隆測(cè)序、變性梯度凝膠電泳等,這些技術(shù)已在許多領(lǐng)域取得重大突破, 例如在土壤和海洋等環(huán)境樣品的研究中[9-11]。 Li 等[12]通過宏基因組學(xué)技術(shù)研究3 種牛乳(新鮮牛乳、含抗生素的牛乳以及經(jīng)巴氏殺菌且含有抗生素的牛乳) 對(duì)牛犢瘤胃中微生物的影響,結(jié)果表明,飲用含有抗生素的牛乳影響瘤胃中微生物群落結(jié)構(gòu)及豐度, 同時(shí)與細(xì)胞周期相關(guān)的酶的數(shù)量也發(fā)生變化。 通過對(duì)功能基因及關(guān)鍵酶的挖掘,揭示牛乳中抗生素殘留的安全問題。

    目前,已有對(duì)酸馬奶微生物多樣性的研究,然而,微生物在種水平上尚不明確,功能基因也幾乎處于空白階段,需要開展深入研究。本試驗(yàn)利用宏基因組學(xué)和生物信息學(xué)分析手段, 在分類學(xué)地位“種”水平上對(duì)酸馬奶中核心微生物類群進(jìn)行甄別,分析酸馬奶的微生物多樣性,并挖掘群體微生物中的功能基因, 以期為我國(guó)酸馬奶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及乳酸菌資源開發(fā)提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    酸馬奶于2019年6月采自于內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林郭勒盟阿巴嘎旗。發(fā)酵方法:經(jīng)前處理后的新鮮馬奶倒入酸馬奶發(fā)酵桶中,按照6%的接種量添加酸馬奶自然發(fā)酵劑并在22~26 ℃進(jìn)行發(fā)酵,定時(shí)攪拌確?;旌暇鶆蚯铱焖侔l(fā)酵。 整個(gè)發(fā)酵過程持續(xù)30 h, 發(fā)酵結(jié)束后將酸馬奶樣品密封并在干冰中冷卻,轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冷凍保存用于后續(xù)試驗(yàn)。

    1.2 試劑與儀器

    NanoDrop2000 超微量分光光度計(jì), 美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司;DYY-6C電泳儀,北京市六一儀器廠;GeneAmp9700 型PCR 儀,美國(guó)ABI 公司;5424R 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī), 美國(guó)Eppendorf 公司;Miseq PE300 測(cè)序儀, 美國(guó)Illumina 公司。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 樣品DNA 抽提 酸馬奶經(jīng)過離心處理后,采用E.Z.N.A土壤DNA 提取試劑盒提取酸馬奶中全部微生物的DNA, 再利用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)抽提微生物基因組的DNA。

    1.3.2 宏基因組檢測(cè)

    1) 構(gòu)建PE 文庫(kù) 連接“Y”字形接頭;通過磁珠篩選去除接頭自連片段;利用PCR 擴(kuò)增進(jìn)行文庫(kù)模板的富集;氫氧化鈉變性,產(chǎn)生單鏈DNA片段。

    2) 橋式PCR 引物堿基與DNA 片段的一端互補(bǔ), 固定在芯片上;DNA 片段的另一端隨機(jī)與附近的另外一個(gè)引物堿基互補(bǔ), 也被固定在芯片上,形成“橋(Bridge)”;利用PCR 擴(kuò)增,產(chǎn)生DNA簇;DNA 擴(kuò)增子線性化成為單鏈。

    3) Illumina Hiseq 測(cè)序 加入改造過的DNA聚合酶和帶有4 種熒光標(biāo)記的dNTP,每次循環(huán)只合成一個(gè)堿基;用激光掃描反應(yīng)板表面,讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類;將“熒光基團(tuán)”和“終止基團(tuán)”化學(xué)切割,恢復(fù)3' 端黏性,繼續(xù)聚合第二個(gè)核苷酸;統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果,獲知模板DNA 片段的序列。

    1.3.3 數(shù)據(jù)分析

    1.3.3.1 基因序列拼接組裝及預(yù)測(cè) 使用Megahit拼接軟件對(duì)clean 序列進(jìn)行拼接組裝,根據(jù)不同的kmer 大小進(jìn)行組裝, 從中選擇最優(yōu)結(jié)果。 使用MetaGeneMark 對(duì)拼接結(jié)果中的conting 進(jìn)行基因預(yù)測(cè),并將其翻譯為氨基酸序列。

    1.3.3.2 物種注釋及豐度分析 通過使用Kraken軟件對(duì)測(cè)序酸馬奶數(shù)據(jù)進(jìn)行物種注釋, 獲得物種分類信息。

    1.3.3.3 功能基因注釋分析

    1) COG 注釋 通過與COG 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blastp 比對(duì), 酸馬奶基因可以獲得對(duì)應(yīng)的COG 注釋,再根據(jù)COG 的功能編號(hào)進(jìn)行分類;

    2) KEGG 注釋 運(yùn)用FMAP 軟件對(duì)KEGG注釋和差異Module 分析;

    3) CAZy 注釋 通過與CAZy 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析, 碳水化合物酶類的物種來源、 酶功能分類、基因序列、蛋白質(zhì)序列及其結(jié)構(gòu)等信息就可以清楚地展現(xiàn)出來。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 酸馬奶微生物多樣性分析

    經(jīng)檢測(cè),酸馬奶一共鑒定到72 364 條組裝序列,總堿基(15 932 809 200)中堿基G 和C 的含量為45.29%, 堿基質(zhì)量大于或等于20 的堿基可達(dá)97.09%。 基于酸馬奶內(nèi)的物種系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及相對(duì)信息, 使用KRONA 軟件對(duì)酸馬奶樣物種進(jìn)行標(biāo)注, 酸馬奶中微生物分類在門水平上有30 個(gè),在科水平上有331 個(gè),在屬水平上有913 個(gè),在種水平有2 692 個(gè)。 其中,相對(duì)含量大于1%的優(yōu)勢(shì)菌群在門水平上有2 個(gè),在科水平上有3 個(gè),在屬水平上有6 個(gè),在種水平有8 個(gè)(圖1)。

    圖1 酸馬奶樣品微生物群落餅圖Fig.1 Pie chart of microbial community of koumiss

    在門水平上,排名前6 位的分別是變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門、軟壁菌門和廣古菌門。優(yōu)勢(shì)菌群是變形菌門和厚壁菌門,相對(duì)含量分別為54.36%和44.55%,占據(jù)總含量的98.91%。在屬水平上,排名前5 位的優(yōu)勢(shì)菌屬是乳桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、 腸桿菌屬、 拉烏爾菌屬和乳球菌屬, 相對(duì)含量分別為40.20%,27.71%,10.40%,9.22%和3.37%,占據(jù)總含量的90.90%。 此外,在酸馬奶中發(fā)現(xiàn)了埃希氏菌屬(0.46%)、克雷伯氏菌屬(1.63%)及微量的芽孢桿菌屬(0.01%)和支原菌屬(0.01%)。由于傳統(tǒng)酸馬奶的制作過程中缺少殺菌工藝, 這導(dǎo)致酸馬奶中微生物的群落信息復(fù)雜多樣,所以酸馬奶中除了有益菌乳酸菌等外,還存在著少量的腐敗菌和有害微生物。近些年來,大量文獻(xiàn)報(bào)道稱酸馬奶中發(fā)現(xiàn)較多的抑菌微生物,能產(chǎn)生抗菌肽等抗菌成分[13-15],這也解釋了未經(jīng)殺菌操作的酸馬奶未產(chǎn)生安全問題的原因。盡管如此,在充分研究酸馬奶微生物及保健功能的基礎(chǔ)上,仍需要進(jìn)一步研究適合于鮮馬奶的殺菌技術(shù),以保證酸馬奶穩(wěn)定的品質(zhì)及更加突出的保健功效。

    在種水平上,相對(duì)含量大于2.0%的優(yōu)勢(shì)菌種主要包含馬乳酒樣乳桿菌、瑞士酸桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、解鳥氨酸拉烏爾菌、檸檬酸桿菌和乳酸乳球菌, 其平均相對(duì)含量分別為18.76%,14.84%,13.05%,7.83%,6.22%和2.96%, 其余細(xì)菌相對(duì)含量較少。 其中,馬乳酒樣乳桿菌、瑞士乳桿菌和乳酸乳球菌為酸馬奶常見優(yōu)勢(shì)菌種,本試驗(yàn)中,弗氏檸檬酸桿菌、 解鳥氨酸拉烏爾菌和檸檬酸桿菌平均相對(duì)含量也較高, 且與文獻(xiàn)報(bào)道的酸馬奶中常見優(yōu)勢(shì)菌種含量相近[16-18],由此可以判斷弗氏檸檬酸桿菌、 解鳥氨酸拉烏爾菌和檸檬酸桿菌也屬于酸馬奶的優(yōu)勢(shì)菌種。 由于研究酸馬奶微生物多樣性確定到細(xì)菌種水平的報(bào)道較少, 該結(jié)果豐富了酸馬奶微生物多樣性的具體類別信息。

    2.2 常用數(shù)據(jù)庫(kù)注釋分析

    2.2.1 COG 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋分析 經(jīng)COG 注釋分析,酸馬奶的10 849 個(gè)基因根據(jù)其功能大致可分為23 類,其中,去除功能未知的R 和S 兩部分,其中功能基因數(shù)目在800 個(gè)以上, 主要有氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝類基因(1 208 個(gè))、翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)及合成基因(1 207 個(gè))、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝類基因(947 個(gè))、轉(zhuǎn)錄類基因(931 個(gè))和復(fù)制、重組和修復(fù)類基因(807 個(gè));其它類的功能基因統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖2。

    圖2 酸馬奶中COG 主要功能分類的基因數(shù)目Fig.2 The number of genes in COG primary functional classification in koumiss

    2.2.2 KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋分析 運(yùn)用FMAP 軟件對(duì)酸馬奶的214 338 個(gè)基因進(jìn)行KEGG 注釋和差異Module 分析,統(tǒng)計(jì)其可能參與或涉及的代謝途徑。 酸馬奶功能注釋基因主要可歸屬為6 大類的代謝通路, 主要功能基因二級(jí)代謝途徑有42 類。KEGG 注釋結(jié)果顯示, 酸馬奶功能基因主要位于細(xì)胞群體——原核生物、膜運(yùn)轉(zhuǎn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、氨基酸代謝、碳水化合物代謝、輔酶因子和維生素的新陳代謝和核苷酸代謝等代謝途徑(圖3)。

    圖3 酸馬奶中KEGG 主要功能分類的基因數(shù)目Fig.3 The number of genes in KEGG primary functional classification in koumiss

    2.2.3 CAZy 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋分析 將酸馬奶基因序列與CAZy 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),酸馬奶共鑒定出3 495 個(gè)碳水化合物活性酶, 其中糖基轉(zhuǎn)移酶(1 238 個(gè))和糖苷水解酶(1 430 個(gè))類最多,占據(jù)酸馬奶碳水化合物活性酶的76%, 其次是碳水化合物結(jié)合模塊 (235 個(gè)) 和碳水化合物酯酶(435個(gè)),而輔助活動(dòng)酶(109 個(gè))和多糖裂合酶(48 個(gè))類最少, 僅占據(jù)酸馬奶樣品檢測(cè)到酶總數(shù)的4.49%。

    2.3 蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)基因分析

    2.3.1 蛋白酶 在乳制品研究中,芳香族氨基酸、支鏈氧基酸以及含硫氨基酸被認(rèn)為是奶酪風(fēng)味形成的主要前體物質(zhì), 乳中酪蛋白被細(xì)胞壁黏附蛋白水解為寡肽, 主要控制基因?yàn)镃EPs 族基因prtB, prtP, prtR 等。 馬奶與牛奶在蛋白質(zhì)組成上有較大差別,經(jīng)分析,酸馬奶中未發(fā)現(xiàn)與奶酪風(fēng)味形成相關(guān)的CEPs 族基因,可見酸馬奶與常見奶酪在風(fēng)味形成中的蛋白酶種類也有一定差異。 經(jīng)檢索,酸馬奶中發(fā)現(xiàn)3 種RRT12 蛋白酶[EC:3.4.21.-]和2 種serralysin 金屬蛋白酶基因。RRT12 蛋白酶與枯草溶菌素的形成有關(guān),而serralysin 金屬蛋白酶的活性依賴于二價(jià)金屬離子鋅同HEXXH 組件的結(jié)合水平(表1)。 盡管檢索到的蛋白酶并不豐富, 但在酸馬奶中發(fā)現(xiàn)第六型蛋白分泌系統(tǒng)(T6SS)基因較豐富,分屬于21 種類型。 第六型蛋白分泌系統(tǒng)(T6SS)是一種廣泛分布于革蘭氏陰性細(xì)菌中、 既能作用于真核細(xì)胞也能作用于細(xì)菌細(xì)胞的蛋白分泌系統(tǒng), 它通過細(xì)胞間直接接觸和物理性穿透轉(zhuǎn)運(yùn)有細(xì)胞毒性或抗菌的分泌蛋白[19-20]。然而,其分泌蛋白的機(jī)理尚不清楚。此一系列基因的發(fā)現(xiàn)將有助于馬奶樣品中蛋白分解及分泌蛋白的深入解析。

    表1 酸馬奶蛋白酶基因分析Table 1 Gene analysis of protease in koumiss

    2.3.2 肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng) 蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)的第2 階段為胞外蛋白降解形成的短肽及寡肽通過不同的肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)。目前,已知乳酸菌的3 個(gè)肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)為寡肽Opp 系統(tǒng)、二/三肽Dpp 系統(tǒng)和DtpT 系統(tǒng)。 如表2 所示,酸馬奶中存在豐富寡肽Opp 系統(tǒng)(158 個(gè))和二/三肽Dpp 系統(tǒng)(74 個(gè))基因, 具有非常強(qiáng)的肽轉(zhuǎn)運(yùn)能力。 在寡肽Opp 系統(tǒng)中, 寡肽Opp 系統(tǒng)寡肽連接蛋白基因數(shù)有75 個(gè);在二/三肽Dpp 系統(tǒng)中,DppA/P 二/三肽寡肽聯(lián)合蛋白透性酶基因數(shù)有41 個(gè),表明酸馬奶在寡肽連接、寡肽聯(lián)合蛋白通透性方面具有較好的潛力,而具體功效需進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄表達(dá)驗(yàn)證。另外,酸馬奶中不含有DtpT 基因,因此不能對(duì)連接有離子的二肽或三肽進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。

    2.3.3 肽酶 肽酶是蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)中至關(guān)重要的組成部分, 不僅可以產(chǎn)生大量維持乳酸菌生長(zhǎng)所必需的氨基酸, 同時(shí)還可以降低乳制品的不良風(fēng)味,如干酪的苦味。 α-酪蛋白和β-酪蛋白水解產(chǎn)生的肽是干酪苦味的主要來源, 利用肽鏈內(nèi)切酶對(duì)其苦味肽進(jìn)行水解已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。 如表2 所示,酸馬奶中含有17 個(gè)pepO、19 個(gè)pepF 和11 個(gè)PepE 肽鏈內(nèi)切酶的控制基因,說明在發(fā)酵過程中具有潛在的降低苦味肽的能力。 同時(shí), 酸馬奶中發(fā)現(xiàn)含有PepB (18 個(gè))、pepN(28個(gè))、PepM(2 個(gè))和PepA(9 個(gè))的編碼基因,這些氨肽酶與抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性的ACE 抑制肽的形成有關(guān)[21-22],表明酸馬奶具有潛在的降血壓功能。 另外,酸馬奶中還具有豐富的二/三肽酶(67 個(gè))和脯氨酸肽酶(60 個(gè))。 由此可見,酸馬奶中可能蘊(yùn)含著豐富的風(fēng)味肽及功能肽, 有待后續(xù)進(jìn)一步純化鑒定。

    表2 酸馬奶肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)及肽酶基因分析Table 2 Peptide transport system and gene analysis of peptidase in koumiss

    2.4 氨基酸風(fēng)味形成途徑

    氨基酸風(fēng)味形成途徑是指氨基酸經(jīng)轉(zhuǎn)氨酶作用,轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酮酸,酮酸較不穩(wěn)定,進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的醛類、醇類和酯類,這些都是食品中重要的風(fēng)味成分。

    2.4.1 轉(zhuǎn)氨酶 支鏈氨基酸、 芳香族氨基酸以及甲硫氨酸的轉(zhuǎn)氨作用可以通過不同的轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行催化。 在乳酸菌菌株中,支鏈轉(zhuǎn)氨酶(BcAT)顯示了對(duì)支鏈氨基酸和蛋氨酸的催化活力, 而芳香轉(zhuǎn)氨酶(ArAT)對(duì)芳香族氨基酸、亮氨酸和蛋氨酸具有催化活力。 如表3 所示,酸馬奶中編碼了26 個(gè)ArAT 基因,包括ARO8、tyrB、ybdl 3 類,未發(fā)現(xiàn)支鏈轉(zhuǎn)氨酶(BcAT)基因,說明酸馬奶發(fā)酵過程中可對(duì)芳香族氨基酸、 亮氨酸和蛋氨酸進(jìn)行催化。 例如, 亮氨酸可以通過轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)化為α-酮異己酸,有報(bào)道稱α-酮異己酸是發(fā)酵香腸中的主要風(fēng)味物質(zhì)[23]。

    2.4.2 酮酸轉(zhuǎn)化酶 酮酸以3 種途徑進(jìn)行進(jìn)一步轉(zhuǎn)化: 第1 種途徑是酮酸經(jīng)過氧化脫羧反應(yīng)可被直接的轉(zhuǎn)化成羧酸。 在這個(gè)途徑中, 酮酸脫氫酶(KaDH)、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(PTA)和酰基激酶(ACK)對(duì)支鏈氨基酸的基質(zhì)表現(xiàn)出活性。如表3 所示,酸馬奶基因組存在編碼PTA(8 個(gè))和ACK(32 個(gè))的基因。 酸馬奶發(fā)酵過程中可能會(huì)通過該途徑將上述氨基酸的酮酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的羧酸類物質(zhì)。 第2 種途徑是酮酸經(jīng)羧酸脫氫酶(HycDH)分解為羧酸。 HycDH 有D-羧酸脫氫酶(D-HycDH)和L-羧酸脫氫酶(L-HycDH)兩種立體專一性酶。目前,雖然并不能證明此途徑可以直接導(dǎo)致風(fēng)味物質(zhì)的形成, 但是卻可以通過將所形成的風(fēng)味物質(zhì)前體分流到非風(fēng)味產(chǎn)品內(nèi)造成風(fēng)味物質(zhì)合成的減少。 酸馬奶基因組中未發(fā)現(xiàn)這2 種羧酸脫氫酶, 不會(huì)因?yàn)橐陨贤緩皆斐烧w風(fēng)味的減少。 第3 種途徑是α-酮酸經(jīng)α-酮酸脫羧酶(KdcA)的催化轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的醛類。截至目前,乳制品微生物組中并未發(fā)現(xiàn)KdcA 活性,這與乳制品發(fā)酵中只有很少暈的氨基酸轉(zhuǎn)化為醛類的觀察結(jié)果相一致。 酸馬奶基因中也未發(fā)現(xiàn)編碼α-酮酸脫羧酶(KdcA)的基因,表明酸馬奶發(fā)酵中不會(huì)通過此途徑對(duì)支鏈氨基酸酮酸進(jìn)行脫羧反應(yīng),生成相應(yīng)的醛類物質(zhì)。

    表3 酸馬奶氨基酸風(fēng)味形成相關(guān)基因分析Table 3 Analysis of amino acid flavor formation gene in koumiss

    2.4.3 醇和醛脫氫酶 醛脫氫酶(AldDH)和醇脫氫酶(AlcDH)可以分別催化醛(醇)類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的醇類和羧酸類物質(zhì), 控制基因主要是AlcDH 總科和1 個(gè)雙官能團(tuán)的AlcDH/AldDH 總科。酸馬奶基因中發(fā)現(xiàn)51 個(gè)編碼醇脫氫酶(AlcDH)和68 個(gè)編碼醛脫氫酶(AldDH)的基因,醇脫氫酶(AlcDH)包括Adh1、Adh2、adhP、AKR1A1、yjgB 和yghD 6 類,醛脫氫酶(AldDH)包括adhE、aldB、aldh、mhpF、aldA 和feaB 6 類。 因此酸馬奶發(fā)酵時(shí)具有催化醛類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的醇類和羧酸類物質(zhì)的潛能。如可以催化異戊醛、活性戊醛和異丁醛等生成相應(yīng)的異戊醇、活性戊醇和異丁醇,并進(jìn)一步生成相應(yīng)的羧酸類物質(zhì)(如具有甜味和奶酪味的二甲基丁酸,具有汗味的2-異戊酸以及酸甜味的異丁酸)。

    2.4.4 乙酰酯酶 帶有短鏈脂肪酸的酯類物質(zhì)大多具有水果風(fēng)味,對(duì)特色乳制品的開發(fā)非常重要。酸馬奶基因中編碼了34 個(gè)可以催化乙酸酯類合成的乙酰酯酶的基因(aes),可以合成具有水果香味的乙酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸正丁酯、乙酸異丁酯等, 為酸馬奶系列產(chǎn)品的風(fēng)味提升及品質(zhì)優(yōu)化提供了思路。

    3 結(jié)論

    酸馬奶獨(dú)特的風(fēng)味及功能特性的形成與其復(fù)雜的微生物菌群結(jié)構(gòu)密不可分。 本試驗(yàn)基于宏基因組技術(shù)分析酸馬奶的微生物多樣性, 挖掘蛋白質(zhì)分解系統(tǒng)及氨基酸風(fēng)味形成系統(tǒng)的功能基因。酸馬奶中鑒定出微生物30 個(gè)門,331 個(gè)科,913 個(gè)屬,2 692 個(gè)種。 其中,相對(duì)含量大于1%的優(yōu)勢(shì)菌群在門、科、屬、種水平上分別有2,3,6,8 個(gè)。優(yōu)勢(shì)菌種為乳酒樣乳桿菌、瑞士乳桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、解鳥氨酸拉烏爾菌、檸檬酸桿菌屬和乳酸乳球菌。 COG、KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)分別注釋到10 849 和214 338 個(gè)基因。 代謝通路中,碳水化合物代謝和氨基酸代謝功能突出, 其次為輔酶因子和維生素的新陳代謝和核苷酸代謝等代謝活動(dòng)。 經(jīng)CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)注釋分析,糖基轉(zhuǎn)移酶(1 238 個(gè))和糖苷水解酶(1 430 個(gè))的數(shù)量最多,占據(jù)酸馬奶碳水化合物活性酶的76%。 同時(shí),在蛋白質(zhì)分解系統(tǒng)中,酸馬奶基因中發(fā)現(xiàn)3 種RRT12 蛋白酶、2 種serralysin 金屬蛋白酶、 第六型蛋白分泌系統(tǒng)(T6SS)基因、232 個(gè)肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)及231 個(gè)肽酶控制基因,表明其具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)分解轉(zhuǎn)運(yùn)潛力。 酸馬奶中編碼了26 個(gè)(ArAT)基因、40 個(gè)酮酸轉(zhuǎn)化酶、51個(gè)編碼醇脫氫酶 (AlcDH)、68 個(gè)編碼醛脫氫酶(AldDH)基因和34 個(gè)乙酰酯酶(aes)基因,說明酸馬奶發(fā)酵時(shí)具有從氨基酸形成濃郁風(fēng)味物質(zhì)的基因基礎(chǔ), 本試驗(yàn)結(jié)果可為酸馬奶品質(zhì)的提升及乳酸菌功能基因庫(kù)的挖掘提供理論依據(jù)。

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