超聲波輔助提取駱駝皮膠原蛋白的工藝及結(jié)構(gòu)表征

史 睿， 何 靜， 吉日木圖，2*

（1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 呼和浩特010018 2 內(nèi)蒙古駱駝研究院 內(nèi)蒙古阿拉善750306）

膠原蛋白是動(dòng)物體內(nèi)豐富的蛋白質(zhì)之一，在所有脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物的細(xì)胞外基質(zhì)中起著關(guān)鍵作用，其自身組裝成橫紋原纖維，為細(xì)胞生長提供支持，并影響結(jié)締組織的機(jī)械彈性[1-2]。膠原蛋白主要存在于動(dòng)物的皮、骨、軟骨及肌腱等結(jié)締組織中，約占動(dòng)物總蛋白的30%[3]。 它被廣泛用于食品、化妝品（皮膚植入物）、生物醫(yī)學(xué)及細(xì)胞培養(yǎng)等多個(gè)領(lǐng)域[1，4-7]。膠原蛋白作為一種安全的有效成分應(yīng)用于產(chǎn)品加工中， 可以從肉類加工行業(yè)的原材料中有效回收[8]。

內(nèi)蒙古自地區(qū)擁有豐富的駱駝資源， 然而牧區(qū)交通不便且條件有限，牧民屠宰駱駝后，只注重食肉， 許多駱駝皮被棄置， 未能充分發(fā)揮皮張價(jià)值。 研究表明，駱駝皮的脂腺遠(yuǎn)不如豬皮發(fā)達(dá)，也比牛皮弱，駱駝皮中油脂含量低于豬皮、牛皮[9]，可將駱駝皮作為提取膠原蛋白的優(yōu)質(zhì)原料。通常，將富含膠原纖維的皮膚或肌腱等組織通過中性鹽、酸、堿和蛋白酶處理來提取膠原蛋白，相比之下，在0.5 mol/L 乙酸中使用胃蛋白酶提取膠原蛋白可以獲得更高的產(chǎn)量。 雖然在酶的作用下膠原蛋白的端肽被水解切割， 但是其三螺旋結(jié)構(gòu)基本保持完整[10-11]。 這些常規(guī)的提取方法效率不高，且在提取過程中會(huì)造成大量的膠原組織殘留物[12]。 目前，低強(qiáng)度的超聲波作為一種非破壞性[13]、安全高效的輔助提取方式被廣泛應(yīng)用在食品加工、 蛋白質(zhì)等物質(zhì)的提取及改性中[14]。 本試驗(yàn)通過低強(qiáng)度超聲波輔助的方式，從駱駝皮中提取膠原蛋白，促進(jìn)駱駝源膠原蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)， 增加駱駝副產(chǎn)品的附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

駱駝皮，內(nèi)蒙古駱駝研究院。

胃蛋白酶（1∶10 000），北京索萊寶科技有限公司；中性蛋白酶（1398），山東龍?jiān)锕こ逃邢薰荆涣u脯胺酸（堿水法）試劑盒，南京建成生物工程研究所；其它主要試劑均為分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

JY 88-IIN 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；JJ-2 型組織搗碎機(jī)，常州賽普實(shí)驗(yàn)儀器廠；XK78-2 型磁力加熱攪拌器， 江蘇新康醫(yī)療器械有限公司；LAMBDA 365 紫外-可見分光光度計(jì)，PerkinElmer 股份有限公司；Thermo Scientific Nicolet iS10 傅里葉變換紅外光譜儀，賽默飛世爾科技公司；TM4000 臺(tái)式掃描電子顯微鏡，日立高新技術(shù)公司；Zetasizer Nano ZS90 納米粒度電位儀，英國馬爾文儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 膠原蛋白含量的測定 參照朱敏[15]的方法，使用羥脯胺酸（堿水法）試劑盒測定羥脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。 膠原蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）=羥脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)×7.1。

通常，羥脯氨酸占膠原蛋白干重的14%左右，然而組織來源、部位甚至測定方法的不同，其含量也會(huì)隨改變，如在軟骨中約占10%左右。人們常用11.1 作為水生動(dòng)物換算系數(shù)， 陸生動(dòng)物則多采用7.1[16]。

1.3.2 膠原蛋白提取率的計(jì)算 膠原蛋白的提取率按下式計(jì)算：

1.3.3 提取工藝流程 駱駝皮→修剪、 浸泡→去毛→脫脂→去除鹽溶性非膠原成分→超聲波輔助提取→鹽析、純化→冷凍干燥

1.3.4 駱駝皮的預(yù)處理

1） 浸泡 冷凍的駱駝皮在4 ℃解凍后，用蒸餾水沖洗干凈。 將駱駝皮切分為5 cm×5 cm 塊狀，盆中加入0.5% Na2CO3浸泡數(shù)小時(shí)后， 蒸餾水洗凈備用。

2） 去毛 浸泡后的原料皮中加入不同質(zhì)量濃度（2，4，6，8，10 mg/mL）的1398 中性蛋白酶，溫度控制在25 ℃，保溫去毛4 h，根據(jù)去毛效果選擇最優(yōu)去毛工藝。

3） 脫脂 將脫毛后的駱駝皮切分為0.5 cm×0.5 cm 小塊， 稱取適量樣品按料液比1∶10 加入5% Na2CO3，攪拌脫脂18 h，蒸餾水洗凈。

4） 去除鹽溶性非膠原成分 脫脂后的原料按料液比1∶10 加入2% NaCl 攪拌18 h，蒸餾水洗凈。

以上操作均在低溫下進(jìn)行， 將預(yù)處理后的駱駝皮儲(chǔ)存在-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 勻漿液的制備 稱取一定質(zhì)量預(yù)處理后的駱駝皮加入適量蒸餾水， 使用組織搗碎機(jī)間隙工作，控制物料溫度不超過25 ℃，搗碎后離心去除多余水分。 將搗碎后樣品加入到0.5 mol/L 乙酸介質(zhì)中，料液比為1∶10，繼續(xù)使用組織搗碎機(jī)勻漿，使其充分混勻攪碎。

1.3.6 超聲波輔助提取駱駝皮膠原蛋白 將胃蛋白酶溶解于0.5 mol/L 乙酸溶液中，稱取一定質(zhì)量的上述勻漿液，二者混勻后進(jìn)行超聲波處理，攪拌提取48 h 后，于8 000 r/min 離心20 min，分離上清液和沉淀，保留上清液，得到駱駝皮膠原蛋白提取液。 所有操作，均在低溫下進(jìn)行。

1.3.7 膠原蛋白的鹽析純化 在提取液中加Na-Cl 至濃度為0.9 mol/L 后鹽析24 h，10 000 r/min離心10 min，沉淀加入0.5 mol/L 乙酸溶液，攪拌充分溶解。 完全溶解后用0.1 mol/L 乙酸透析24 h，再用蒸餾水透析24 h，經(jīng)冷凍干燥得到超聲波輔助提取的駱駝皮膠原蛋白（UPSC）。 所有操作，均在低溫下進(jìn)行。

1.3.8 超聲波輔助提取駱駝皮膠原蛋白工藝的優(yōu)化

1.3.8.1 單因素實(shí)驗(yàn) 在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定酶添加量4%、料液比1∶20、超聲波處理時(shí)間20 min、超聲波功率200 W、總提取時(shí)間48 h 條件，分別考察酶添加量（0.5%，1.0%，2%，4%，8%）、料液比（1∶5，1∶10，1∶20，1∶30，1：40）、 超聲波處理時(shí)間（5，10，15，20，25，30 min）、 超聲波功率（50，100，150，200，250 W） 及總提取時(shí)間（12，24，36，48，60 h）對(duì)駱駝皮膠原蛋白提取率的影響。1.3.8.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上， 依據(jù)Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以膠原蛋白提取率為響應(yīng)值，選取酶添加量、料液比、 超聲波處理時(shí)間和總提取時(shí)間4 個(gè)影響顯著的因素，進(jìn)行四因素三水平的組合試驗(yàn)，使用DesignExpert 8.0.6.1 軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。 因素水平及編碼見表1。

表1 駱駝皮膠原蛋白提取試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of collagen extraction from camel skin

1.3.9 膠原蛋白的結(jié)構(gòu)表征

1.3.9.1 SDS-PAGE 凝膠電泳分析 利用SDSPAGE 凝膠電泳分析法分析UPSC， 采用5%濃縮膠和8%分離膠體系進(jìn)行電泳分離， 用0.5 mol/L乙酸將樣品配置成0.5 mg/mL 的膠原蛋白溶液，上樣量為5 μL。 分別采用濃縮膠電壓80 V、分離膠電壓100 V 進(jìn)行電泳。 電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)R-250 染色膠片， 并用乙醇-乙酸脫色液進(jìn)行脫色，最后使用凝膠成像儀觀察分析。

1.3.9.2 紫外光譜分析 將提取得到的UPSC 置于0.5 mol/L 乙酸溶液中， 配制成0.5 mg/mL 的溶液， 稀釋10 倍后利用紫外-可見分光光度計(jì)上機(jī)測試，在200～400 nm 近紫外光區(qū)對(duì)膠原蛋白溶液進(jìn)行掃描。

1.3.9.3 傅里葉變換紅外光譜分析 分別稱取適量UPSC 凍干樣品與KBr 按一定的比例混合研磨，置于壓片機(jī)上壓片，使用傅里葉變換紅外光譜儀在4 000～500 cm-1波數(shù)范圍對(duì)樣品進(jìn)行掃描測定，分辨率為2 cm-1。

1.3.9.4 掃描電子顯微鏡觀察 將UPSC 剪成小塊，固定在載物片上，然后用掃描電子顯微鏡觀察其形態(tài)特性。 使用10 kV 的加速電壓，以200×倍的倍率采集圖像。

1.3.9.5 Zeta 電位測定 將UPSC 用0.5 mol/L 乙酸溶解，低溫下攪拌6 h，使其最終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL。 用1 mol/L 的HCl 和1 mol/L 的NaOH 調(diào)節(jié)pH，分別測定不同pH 值（2～9）下UPSC 的Zeta電位。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度的中性蛋白酶（1398）對(duì)去毛效果的影響

不同質(zhì)量濃度的中性蛋白酶（1398）對(duì)駱駝皮的去毛效果不同。從圖1 中可以看出，使用質(zhì)量濃度為2 mg/mL 中性蛋白酶處理駱駝皮， 去毛效果較差，有些區(qū)域不能完全將毛去除干凈；酶的質(zhì)量濃度4～6 mg/mL 范圍可達(dá)到較好的去毛效果，使用6 mg/mL 酶處理后的皮張色澤較白， 皮質(zhì)較為柔軟。 研究表明，酶可以使皮的內(nèi)容物溶解出來，改變皮表面的折光性能，使顏色變白，同時(shí)，酶具有松散膠原纖維的作用，使皮張變得柔軟[17]。 隨著酶質(zhì)量濃度的增加，皮質(zhì)發(fā)生變化，使用質(zhì)量濃度為8 mg/mL 的中性蛋白酶處理時(shí)， 局部區(qū)域顏色開始變黃且毛孔粗大，使用10 mg/mL 蛋白酶處理后，皮質(zhì)過度松軟，顏色發(fā)黃，膠原纖維被高濃度的酶破壞， 所以選擇6 mg/mL 的酶質(zhì)量濃度以達(dá)到最佳去毛效果。

圖1 不同質(zhì)量濃度的中性蛋白酶（1398）對(duì)駱駝皮去毛效果的影響Fig.1 The effects of different mass concentrations of neutral protease （1398） on the hair removal of camel skin

2.2 超聲波輔助提取駱駝皮膠原蛋白的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 酶添加量對(duì)駱駝皮膠原蛋白提取率的影響

由圖2 可知，隨著酶添加量的增加，提取率隨之升高。當(dāng)酶量增加時(shí)，更多的底物可以與酶充分結(jié)合，增加提取率。當(dāng)酶添加量為4%時(shí)，此時(shí)提取率為（42.05±2.42）%，達(dá)到最高水平。 當(dāng)酶量繼續(xù)增大時(shí)，酶對(duì)膠原蛋白非螺旋區(qū)域的反應(yīng)過度，使其組織結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致膠原蛋白濃度下降，提取率降低。 因此，初步確定最佳酶添加量為4%。

圖2 酶添加量對(duì)提取率的影響Fig.2 Effects of enzyme addition amount on extraction rate

2.2.2 料液比對(duì)駱駝皮膠原蛋白提取率的影響圖3 表明，隨著液料比的增大，提取率呈先增加后降低趨勢。當(dāng)料液比較小時(shí)，預(yù)處理后的原料在乙酸溶液中會(huì)發(fā)生溶脹現(xiàn)象，導(dǎo)致體系中黏度較高，酶與底物不能充分結(jié)合， 且不利于超聲波空化作用的傳導(dǎo)[18]，影響酶解進(jìn)程，使提取率較低。 增加乙酸溶液的體積，降低了體系的黏度，超聲波可充分發(fā)揮空化作用且震動(dòng)強(qiáng)度增加，打散膠原纖維，有利于更多膠原蛋白的溶出，從而使提取率增高。同時(shí)，各體系中酶制劑用量是相同的，料液比增加會(huì)使酶濃度降低，可以酶解的駱駝皮的質(zhì)量有限，導(dǎo)致提取率逐漸下降。因此，確定最適液料比為1∶20，此時(shí)提取率可達(dá)（42.02±2.78）%。

圖3 料液比對(duì)提取率的影響Fig.3 Effects of solid-liquid ratio on extraction rate

2.2.3 超聲波處理時(shí)間對(duì)駱駝皮膠原蛋白提取率的影響 由圖4 可知， 膠原蛋白提取率呈先增加后降低的趨勢。 超聲時(shí)間在5～25 min 內(nèi)膠原蛋白的提取率顯著增加，說明超聲波可增加提取率，縮短提取時(shí)間，在超聲波處理20 min 時(shí)提取率達(dá)到最大，此時(shí)原料中膠原蛋白基本溶出；然而隨著超聲波處理時(shí)間加長， 其產(chǎn)生的空化效應(yīng)和機(jī)械作用增強(qiáng)，在局部的高溫高壓作用下，會(huì)加速提取到的膠原蛋白發(fā)生降解[19]，破壞膠原蛋白結(jié)構(gòu)，使得提取率開始下降。因此，初步選擇超聲波處理時(shí)間為15～25 min。

圖4 超聲波處理時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.4 Effects of ultrasonic treatment time on extraction rate

2.2.4 超聲波功率對(duì)駱駝皮膠原蛋白提取率的影響 由圖5 可知， 在料液比為1∶20， 超聲波處理20 min，總提取時(shí)間48 h 的條件下，隨著超聲功率的提高整體提取率先上升， 功率達(dá)到200 W 時(shí)膠原蛋白提取率最高， 駱駝皮中的膠原蛋白大部分已溶出，隨著超聲波功率的增加，膠原蛋白提取率呈平穩(wěn)趨勢，變化不顯著。 有研究表明，當(dāng)超聲波功率過大時(shí)，會(huì)增加散射衰減，形成聲屏障，影響提取效果[19]。 因此，為避免過分超聲處理影響膠原蛋白的組織結(jié)構(gòu)， 選擇200 W 為提取膠原蛋白的最優(yōu)超聲波功率。

圖5 超聲波功率對(duì)提取率的影響Fig.5 Effects of ultrasonic power on extraction rate

超聲波產(chǎn)生的微聲流能加快傳質(zhì)擴(kuò)散， 產(chǎn)生空化、震蕩效應(yīng)，活化酶分子構(gòu)象及催化部位[20]。然而超聲波處理的一個(gè)主要缺點(diǎn)是其產(chǎn)生的空化效應(yīng)會(huì)在介質(zhì)內(nèi)部引起高溫、 高剪切力以及高壓[21]，同時(shí)它還可以破壞多肽鏈上的氫鍵和范德華相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)或酶發(fā)生變性[12]。 本試驗(yàn)采用冰浴的方式來消除熱效應(yīng)， 并選擇適當(dāng)?shù)某暡üβ始疤幚頃r(shí)間， 在保正其完整結(jié)構(gòu)及生理活性的基礎(chǔ)上， 以溫和的超聲波輔助方式高效提取膠原蛋白。2.2.5 總提取時(shí)間對(duì)駱駝皮膠原蛋白提取率的影響 圖6 表明，隨著總提取時(shí)間的增加，膠原蛋白的提取率呈先升高后降低的趨勢。 膠原蛋白溶出的過程是固體溶質(zhì)向溶劑傳遞的過程[22]，在其二者未達(dá)平衡前，隨著提取時(shí)間的延長，胃蛋白酶促使膠原蛋白不斷釋放到提取液中， 提取率逐漸增加。 在48 h 處， 膠原蛋白提取率達(dá)最高值為（42.48±1.35）%。 然而著時(shí)間的繼續(xù)增加，其有下降趨勢，部分膠原蛋白發(fā)生了水解，使得提取率下降。 綜上，初步選擇酶提取時(shí)間為36～60 h。

圖6 總提取時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.6 Effects of total extraction time on extraction rate

2.3 響應(yīng)曲面法對(duì)超聲波輔助提取駱駝皮膠原蛋白工藝的優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上， 根據(jù)Box-Behnken原理，以駱駝皮膠原蛋白提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)曲面分析試驗(yàn)， 使用DesignExpert8.0.6.1 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。表2 為駱駝皮膠原蛋白提取工藝響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果。

表2 駱駝皮膠原蛋白提取工藝響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of collagen extraction from camel skin for response surface analysis

2.3.1 回歸模型的方差分析 通過對(duì)響應(yīng)曲面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合回歸分析， 得到駱駝皮膠原蛋白提取率與各因素變量的二次多項(xiàng)回歸方程為：y=40.91+2.75A+1.83B+0.87C+1.04D-0.17AB-0.18AC+1.10AD+0.99BC-0.30BD-1.20CD-5.16A2-3.06B2-2.36C2-1.85D2。

對(duì)二次多項(xiàng)回歸模型進(jìn)行方差分析， 結(jié)果如表3 所示。 模型F=32.01，P＜0.0001，意味該回歸模型顯著性極高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以用模型分析預(yù)測駱駝皮膠原蛋白提取率的結(jié)果。 失擬項(xiàng)F=0.46，P=0.8557＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著，可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。 決定系數(shù)R2=0.9697，校正決定系數(shù)R2Adj=0.9394，說明回歸模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合程度較高， 可以模擬93.94%的響應(yīng)值變化， 只有6.06%的變異不能由此模型解釋，進(jìn)一步說明模型擬合程度較好，能夠用于駱駝皮膠原蛋白提取率的理論預(yù)測。

根據(jù)表3 可知， 模型中A、B、C、D、A2、B2、C2、D2對(duì)響應(yīng)值影響極顯著（P＜0.01），AD、BC、CD 對(duì)響應(yīng)值影響顯著（P＜0.05）。F 檢驗(yàn)可以反映回歸模型的有效性，F(xiàn) 值越大，說明此因素對(duì)膠原蛋白提取率的影響越顯著[19]，因此，4 個(gè)因素對(duì)膠原蛋白提取率的影響順序?yàn)椋好柑砑恿浚ˋ）＞料液比（B）＞總提取時(shí)間（D）＞超聲波提取時(shí)間（C）。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

2.3.2 過程變量的交互作用 圖7 中的響應(yīng)曲面圖和等高線圖直觀反映了酶添加量（A）、 料液比（B）、超聲波提取時(shí)間（C）及總提取時(shí)間（D）各因素間的交互作用對(duì)駱駝皮膠原蛋白提取率的影響。

通過觀察圖7 中各響應(yīng)曲面的陡峭程度及等高線圖的疏密程度， 可以看出4 個(gè)因素中酶添加量與總提取時(shí)間、料液比與超聲波提取時(shí)間、超聲波提取時(shí)間與總提取時(shí)間的交互作用顯著， 對(duì)膠原蛋白提取率的影響較大， 其它因素間的交互作用不顯著，這與方差分析的結(jié)果一致。

圖7 過程變量的響應(yīng)曲面圖Fig.7 Response surface diagram of process variables

2.3.3 最優(yōu)提取條件的確定與驗(yàn)證 通過模型計(jì)算分析得到理論上的最佳提取條件為： 酶添加量4.58%、 料液比1∶23.03、 超聲波提取時(shí)間20.81 min、總提取時(shí)間51.49 h，提取率可達(dá)（41.81±1.89）%。 考慮實(shí)際操作情況，將優(yōu)化條件整合為：酶添加量4.5%、料液比1∶23、超聲波處理時(shí)間20 min、總提取時(shí)間51 h，在此條件下進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，得到膠原蛋白提取率為（41.99±1.57）%，與擬合模型的預(yù)測值接近，說明該模型合理，參數(shù)可靠，可以用來預(yù)測提取駱駝皮的最優(yōu)工藝條件。

2.4 駱駝皮膠原蛋白SDS-PAGE 凝膠電泳分析結(jié)果

通過SDS-PAGE 凝膠電泳對(duì)UPSC 的分子質(zhì)量進(jìn)行測定，分析其亞基組成。如圖8 所示，UPSC是由α 鏈（α1和α2）、β 鏈及γ 鏈組成。 在135 ku處有兩條譜帶，較粗的一條是由兩條α1肽鏈重疊構(gòu)成的，另一條是單條的α2肽鏈；在245 ku 處是α 鏈二聚體，即β 鏈；高于245 ku 處的條帶是Ⅰ型膠原蛋白α 鏈的三聚體，即γ 鏈。 此結(jié)構(gòu)與劉雯恩等[23]研究一致。 因此，可初步判斷提取出的UPSC 為結(jié)構(gòu)完整的Ⅰ型膠原蛋白。

圖8 駱駝皮膠原蛋白的SDS-PAGE 圖譜Fig.8 SDS-PAGE patterns of collagen extracted from camel skin

2.5 駱駝皮膠原蛋白紫外光譜分析結(jié)果

膠原蛋白的近紫外吸收光譜可判斷其酪氨酸含量和非螺旋端肽的完整性[18]。 圖9 中UPSC的最大吸收峰在218 nm 處，與Lin 等[24]的研究結(jié)果一致， 這是由于C=O 的n→π* 躍遷所致。 同時(shí)，在280 nm 處無吸收峰出現(xiàn)，說明芳香族氨基酸含量較少，提取得到的膠原蛋白純度較高[16]。

圖9 駱駝皮膠原蛋白的紫外吸收光譜圖Fig.9 Ultraviolet absorption spectrum of collagen extracted from camel skin

2.6 駱駝皮膠原蛋白傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

由圖10 可知，UPSC 具有Ⅰ型膠原蛋白紅外光譜特征吸收峰，即酰胺A、B 和酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。酰胺A 帶主要是由N-H 鍵的伸縮振動(dòng)引起，自由N-H 伸縮振動(dòng)發(fā)生的范圍是3 400～3 450 cm-1，然而當(dāng)N-H 基團(tuán)參與氫鍵形成時(shí)， 其振動(dòng)頻率會(huì)偏低，通常為3 300 cm-1左右[25]。 UPSC 的酰胺A 帶在3 301.32 cm-1，說明UPSC 中有較多的NH 鍵參與肽鏈的形成。 在2 922.03 cm-1附近為酰胺B 帶， 這是由-CH2基團(tuán)的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的， 反映了酰胺A 與酰胺Ⅱ帶之間的相互作用[26]。酰胺Ⅰ帶的范圍一般在1 625～1 690 cm-1之間， 酰胺Ⅱ帶的范圍一般在1 550～1 600 cm-1之間。 觀察到UPSC 的酰胺I 帶在1 630.46 cm-1左右，酰胺II 帶在1 543.98 cm-1，移動(dòng)到了更低的頻率， 進(jìn)一步說明膠原蛋白中氫鍵的存在。 在1 236.46 cm-1處存在的吸收峰是由N-H 鍵平面彎曲形成的酰胺Ⅲ帶特征頻率。 酰胺Ⅱ和酰胺Ⅲ帶可確定膠原蛋白螺旋結(jié)構(gòu)的存在。 綜上，UPSC保有較完整的三螺旋結(jié)構(gòu)。

圖10 駱駝皮膠原蛋白的傅里葉紅外光譜圖Fig.10 Fourier transform infrared spectroscopy of collagen extracted from camel skin

2.7 駱駝皮膠原蛋白掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果

通過肉眼和掃描電子顯微鏡觀察凍干后的UPSC，并對(duì)其形態(tài)進(jìn)行分析。 圖11a 為肉眼觀察下的UPSC 形態(tài)，質(zhì)輕且柔軟，呈乳白色的海綿狀態(tài)，表面可見有一定的孔隙；圖11b 為掃描電子顯微鏡下UPSC 的微觀結(jié)構(gòu)， 更清楚的顯示出大量多孔、疏松的橫截面，呈現(xiàn)相互纏繞的卷曲狀結(jié)構(gòu)，由此表明UPSC 具有膠原的纖維特性[27]。

圖11 駱駝皮膠原蛋白肉眼觀察圖（a）及掃描電子顯微鏡觀察圖（b）Fig.11 Camel skin collagen as viewed in naked eye （a）and SEM micrograph （b）

2.8 駱駝皮膠原蛋白Zeta 電位分析結(jié)果

膠原蛋白表面的凈電荷數(shù)量會(huì)影響其穩(wěn)定性，因此測定了不同pH 值（2～9）UPSC 的Zeta 電位值。 如圖12 所示，UPSC 在pH 2～6.7 范圍時(shí)帶正電荷，在pH 6.7～9 范圍時(shí)帶負(fù)電荷。 蛋白質(zhì)水溶液在其等電點(diǎn)（PI）處凈電荷為零[28]。 由圖可知UPSC 的等電點(diǎn)為6.7。

圖12 不同pH 值下駱駝皮膠原蛋白Zeta 電位數(shù)據(jù)Fig.12 Zeta potential of collagen extracted from camel skin at different pH values

3 結(jié)論

為節(jié)約成本，提高提取效率，本試驗(yàn)采用超聲波輔助法提取駱駝皮中的膠原蛋白， 確定了最優(yōu)工藝： 使用質(zhì)量濃度為6 mg/mL 的中性蛋白酶（1398）對(duì)駱駝皮進(jìn)行去毛，將預(yù)處理后的駱駝皮進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，確定提取超聲波功率為200 W，在此基礎(chǔ)上， 結(jié)合響應(yīng)曲面分析法得到最佳提取條件為：酶添加量4.5%、料液比1∶23、超聲波提取時(shí)間20 min、總提取時(shí)間51 h，膠原蛋白的實(shí)際提取率為（41.99±1.57）%，與模型預(yù)測擬合較好，證明該模型能夠用于駱駝皮膠原蛋白提取率的理論預(yù)測。

從駱駝皮中提取到的膠原蛋白為I 型膠原蛋白，由α 鏈（α1和α2）、β 鏈及γ 鏈組成。 紫外光譜分析進(jìn)一步推斷UPSC 為典型I 型膠原蛋白，經(jīng)紅外光譜分析證實(shí)UPSC 具有完整的三螺旋結(jié)構(gòu)，通過掃描電子顯微鏡觀察到膠原纖維的存在。 同時(shí)測定UPSC 在pH 2～9 的Zeta 電位， 確定其等電點(diǎn)為6.7。