不同區(qū)段小鼠小腸類器官體外培養(yǎng)方法建立

秦玉梅， 郭慶斌， 黃微微， 郭世杰， 韓劍眾

（浙江工商大學食品與生物工程學院 杭州310018）

小腸作為人體最大的營養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收器官，由于其在代謝紊亂疾病，如肥胖及糖尿病的重要作用，因此人們對腸道營養(yǎng)物質(zhì)吸收、轉(zhuǎn)運、感受和激素釋放的興趣日益增長[1]。作為人體更新速度最快的器官之一，腸道上皮細胞平均壽命為4～6 d[2]，腸道上皮更新受到內(nèi)在和外在因素影響。腸道微生物和食物是影響腸道上皮平衡的主要外在因素，由于腸道長期暴露于各種飲食成分中，腸道上皮細胞與飲食成分密切接觸， 直接受攝入食物成分的調(diào)節(jié)， 因此確定飲食成分如何與腸道上皮相互作用至關重要[3]。一種能夠再現(xiàn)體內(nèi)真實腸道上皮結(jié)構(gòu)及細胞組成的體外研究模型必定成為加速上述研究的寶貴工具。

過去， 用于腸道食物成分吸收和營養(yǎng)物質(zhì)功能評價的體外模型主要包括： 以離體腸道組織為基礎的組織模型和以各種轉(zhuǎn)化的腸道細胞系為基礎的細胞模型。以腸道組織為基礎的模型，包括外翻腸囊、尤斯灌流室和離體腸灌注等，上述模型需要獲取離體組織， 在試驗對象數(shù)量有限情況下無法獲得足夠質(zhì)量及數(shù)量的組織， 且離體組織功能測試試驗有時間限制性， 試驗的重復性及穩(wěn)定性差。此外，為了獲取足夠的數(shù)據(jù)而大大增加動物使用量，從而增加試驗成本和動物使用倫理風險。以腫瘤細胞系為基礎的細胞模型， 包括各種轉(zhuǎn)化的腸道上皮細胞系，如Caco-2、HT29 等，雖然細胞基礎上的模型能夠克服上述以動物組織為基礎的模型的部分缺陷， 但是細胞基礎上的模型細胞組成單一，無法真正再現(xiàn)腸道細胞與細胞之間、細胞與細胞基質(zhì)之間的相互作用[4]。目前亟待建立一種有力的腸道體外培養(yǎng)模型。

2007年，Hans Clever 實驗室發(fā)現(xiàn)了Lgr5 標記的腸道干細胞， 此細胞的發(fā)現(xiàn)為新型腸道體外研究模型的建立提供了基礎[5]，2009年，Hans Clever 實驗室報道了人和小鼠來源的腸類器官（Organoid）的產(chǎn)生和長期體外培養(yǎng)[6]，此類器官再現(xiàn)了腸上皮的所有細胞類型組成， 目前該技術(shù)被廣泛應用于疾病模型、藥物篩選、再生醫(yī)學及干細胞治療領域[7-12]。 相對于上述領域，類器官在食品領域的應用研究相對滯后[3，13-20]。尤其是在國內(nèi)，除了少數(shù)醫(yī)學及藥物學研究領域?qū)嶒炇艺莆樟四c道類器官培養(yǎng)技術(shù)外， 在食品研究領域能夠熟練掌握上述技術(shù)的研究人員較少， 尤其是完善的針對于不同區(qū)段的小腸類器官培養(yǎng)方法。 本研究以含有腸道干細胞的腸道隱窩為基礎， 通過優(yōu)化隱窩分離方法和類器官培養(yǎng)基組成， 旨在建立一套完整的不同區(qū)段小腸類器官培養(yǎng)方法， 并通過免疫熒光及 RT-PCR 驗證體外培養(yǎng)類器官再現(xiàn)體內(nèi)腸道細胞及結(jié)構(gòu)組成特點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8 周大雄性C57BL6/J 小鼠，購自于上海斯泰克實驗動物中心。 所有動物實驗均嚴格按照浙江工商大學實驗動物保護和使用委員會規(guī)定， 并遵循中國實驗動物的護理和使用指南。

1.2 試劑與儀器

無Ca2+、Mg2+磷酸鹽緩沖液（DPBS），吉諾生物技術(shù)有限公司；Matrigel 基質(zhì) （CB40230C）， 美國Corning 公司；1 mol/L HEPES 緩沖液（15630080）、DMEM/F12 培養(yǎng)基（11320-033）、青霉素/鏈霉素溶液（15140-122）、B27 添加劑（17504044）、N-2添加劑 （17502048）、Glutamix 添加劑 （35050-061）， 美國Gibco Thermo Fisher Scientific 公司；人類重組EGF（315-09），美國Peprotech 公司；Y-27632 二鹽酸鹽（Y0503）、N-乙?；?L-半胱氨酸（A7250）， 美國Sigma Aldrich 公司；R-spondin 條件培養(yǎng)基（來自于R-spondin 細胞系），Dr. Jeffery Wittsett 實驗室；Noggin 條件培養(yǎng)基（來自于HEK-293 Noggin 細胞），Dr. Peihua Jiang 實驗室；細胞回收液（354253），美國Corning 公司；RNA 抽提試劑盒 （12-183-018A）， 美國Invitrogen Thermo Fisher Scientific 公 司；VILO 預混液（11755050）、PCR 試劑盒 （13001013）， 美國Thermo Fisher Scientific 公 司；4%多聚甲醛（BL539A），Biosharp蘭杰柯科技有限公司； SuperBlock 封閉緩沖液（37515），美國Thermo Fisher Scientific 公司；OCT包埋劑（4583），美國Sakura Finetek 公司；封片劑（F6182），美國Sigma Aldrich 公司。 本試驗所用抗體信息見表1。

SP8 激光共聚焦顯微鏡、DMI8 倒置熒光顯微鏡， 德國徠卡公司；Herace VOPS 250i 二氧化碳培養(yǎng)箱、T100PCR 儀，Thermo 公司；L550 低溫離心機，湘儀公司；YCTS-103H 回旋式搖床，上海捷呈實驗儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 小腸隱窩分離 8～10 周大雄性C57BL/6小鼠CO2處死， 腹部剖開獲得完整小腸放于4 ℃預冷的DPBS 溶液中； 去除小腸外壁連接組織后將小腸縱向剖開，冷DPBS 清洗后將小腸按照圖1所示分成十二指腸，空腸，回腸3 份取3～4 cm，眼科剪將各段小腸剪成3～5 mm 小段置于15 mL 離心管中冷DPBS 清洗至上清澄清； 隨后棄上清加入5 mmol/L EDTA 溶液，搖床37 ℃，250 r/min 振蕩10 min；消化后DPBS 清洗組織一次，棄上清，加入適量DPBS 振蕩20～30 次， 自然沉降后將上清過100 μm 細胞篩轉(zhuǎn)移至新離心管中，可重復上述振蕩收集步驟1 次， 合并上清； 將收集上清250×g，4 ℃離心10 min，去除上清，沉淀中加入少量冷基礎培養(yǎng)基 【含1%谷氨酰胺、1% HEPES、1%青霉素/鏈霉素的DMEM/F12 培養(yǎng)基】， 取10 μL 計數(shù)隱窩數(shù)量，根據(jù)孔板接種數(shù)量調(diào)整隱窩濃度。

圖1 小腸不同區(qū)段示意圖Fig.1 Diagram of different segments of small intestine

1.3.2 隱窩培養(yǎng)及腸類器官傳代 按照24 孔培養(yǎng)板每孔50 μL 劑量向分離腸道隱窩中加入相應的體積Matrigel 基質(zhì)，輕輕吹打形成均勻懸液。 將懸液接種于37 ℃提前預熱24 孔板中， 后將培養(yǎng)板置于37 ℃CO2培養(yǎng)箱30 min，最后向每孔中加入500 μL 完全培養(yǎng)基【85%～87%基礎培養(yǎng)基、3%～5% R-spondin 條件培養(yǎng)基、10% Noggin 條件培養(yǎng)基、1xB27（%）、1xN2（%）、50 ng/ml EGF，1 mmol/L N-acetylcysteine，10 μmol/L Y-27632）】，每2 d 更換一次完全培養(yǎng)基。倒置顯微鏡及Leica CCD 每天觀察和記錄隱窩形態(tài)變化及生長情況。接種4～6 d 后小腸類器官可用于傳代， 傳代時去除培養(yǎng)基，每孔加500 μL 冷DPBS，反復吹打60～100 次，4 ℃，300×g 離心5 min， 去除上清并加入相應體積Matrigel 基質(zhì)，隨后按照前述方法接種、更換培養(yǎng)基及記錄類器官生長變化。

1.3.3 免疫熒光 培養(yǎng)第5 d 類器官， 去除培養(yǎng)基后加入500 μL 冷細胞回收溶液，將培養(yǎng)板置于冰上回轉(zhuǎn)式搖床40 r/min 振蕩1 h； 后800 r/min離心機瞬離取沉淀回收類器官；沉淀中加入4%多聚甲醛室溫固定15 min， 隨后0.01%亞甲基藍溶液室溫孵育20 min， 離心后沉淀中加入20%蔗糖溶液4 ℃過夜； 第2 天OCT 包埋劑包埋，Leica 冰凍切片獲得類器官冷凍切片，切片厚度5 μm。PBS清洗玻片，加入抗原封閉液（含有2%驢血清、0.3%Triton X-100 的SuperBlock 封閉溶液）室溫孵30 min；加入一抗4 ℃過夜（一抗種類及稀釋比例如表1 所示）；PBS 清洗3 次（每次5 min）后加入二抗室溫孵育30 min；PBS 清洗4 次（每次5 min）后DAPI 復染， 封片劑封片后Leica SP8 激光共聚焦顯微鏡獲取圖像。隱窩分離試驗獲取腸段時，同時取0.5～1 cm 腸段用于獲取冰凍切片， 獲取組織4%多聚甲醛4 ℃固定2 h，PBS 清洗組織3 次（每次5 min），后續(xù)冰凍切片獲取、免疫熒光及圖像獲取方法與類器官相同。1.3.4 RT-PCR 傳代培養(yǎng)5～6 d 小腸類器官，去除培養(yǎng)基后加入500 μL 冷細胞回收溶液，將培養(yǎng)板置于冰上回轉(zhuǎn)式搖床40 r/min 振蕩1 h； 后800 r/min 離心機瞬離取沉淀回收類器官。 類器官和腸道組織通過RNA 抽提試劑盒獲取RNA，VILO 合成cDNA，PCR 試劑盒獲得目標產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳分析PCR 結(jié)果， 基因測序確定序列正確性。PCR 所用引物如表2 所示。

表1 抗體Table 1 List of antibodies

表2 引物序列Table 2 Sequences of primers

2 結(jié)果與分析

2.1 不同區(qū)段小腸類器官培養(yǎng)

腸道組織的動態(tài)平衡是腸道行使各項功能的基礎， 腸道中的組織平衡需要位于腸隱窩底部的干細胞在自我更新和分化形成子代祖細胞之間保持動態(tài)平衡來調(diào)節(jié)， 祖細胞進一步分化產(chǎn)生所有成熟腸道細胞類型，包括潘氏細胞、杯狀細胞、內(nèi)分泌細胞及吸收細胞等[21]。 因此，腸道干細胞或含有腸道干細胞組織的分離是實現(xiàn)腸道類器官體外培養(yǎng)方法建立的前提。 由于單個腸道干細胞分離需要借助特殊標記腸道干細胞的轉(zhuǎn)基因小鼠及流式細胞分選方法，試驗成本高，因此本研究以含有腸道干細胞的小腸隱窩為對象， 優(yōu)化了不同區(qū)段小腸隱窩的分離方法， 大大縮短隱窩分離所需時間，從小鼠組織獲取到隱窩分離所需時間少于25 min， 與已報道的方法相比時間縮短了1～2 倍[22]。另外此方法還提高了隱窩分離純度和類器官生成率，如圖2a～2c 所示，十二指腸、空腸和回腸均可獲得純度＞80%的隱窩，新分離小腸隱窩呈典型的U 型結(jié)構(gòu)。

分離的小腸隱窩經(jīng)過數(shù)小時到1 d 培養(yǎng)形成閉合的囊狀結(jié)構(gòu)（如圖2m），位于小腸隱窩底部的干細胞向囊狀結(jié)構(gòu)四周擴增， 經(jīng)過增殖與分化過程， 培養(yǎng)第3～5 d 閉合囊狀結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂卸鄠€向外凸起芽體的立體結(jié)構(gòu)（如圖2d～2f 和2m），即形成典型的小腸類器官結(jié)構(gòu)， 而且不同區(qū)段小腸具有相似生長特征， 本方法獲得的類器官的生長特性與Sato 等[6]報道的生長特性一致，然而成熟類器官結(jié)構(gòu)形成速度更快， 這可能來自于培養(yǎng)基及成分的差異性。另外，在培養(yǎng)過程中隨著培養(yǎng)時間增加類器官形成的芽體數(shù)量也不斷增加， 由于每個芽體都能獨立成長形成新的腸道類器官， 所以芽體被認為是小腸隱窩的類似結(jié)構(gòu)， 并且Fuller等[23]提出類器官出芽個數(shù)的多少可作為類器官生長能力和分化能力的重要評價指標， 本文建立的類器官培養(yǎng)方法可以很好的保留來源于腸道組織中腸道干細胞的增殖分化特征。 圖2g～2i 結(jié)果證實， 小腸類器官經(jīng)傳代后芽體從類器官結(jié)構(gòu)中解離出來， 經(jīng)過2 h 培養(yǎng)后與原代隱窩培養(yǎng)形成閉合的囊狀結(jié)構(gòu)， 同時經(jīng)過3～5 d 培養(yǎng)形成典型類器官結(jié)構(gòu)（如圖2j～2l）。 與以往的組織體外研究模型相比，以腸道干細胞為基礎的類器官培養(yǎng)，具有可傳代性， 而且經(jīng)過多次傳代后類器官仍保持相同的生長特性（如圖2g～2l）， 具有表型結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

圖2 不同區(qū)段小腸類器官原代及傳代培養(yǎng)Fig.2 Primary and subculture of small intestinal orgnaoids in different section

2.2 小腸類器官再現(xiàn)體內(nèi)腸道上皮結(jié)構(gòu)特征及細胞組成

腸道上皮是一個多細胞組成結(jié)構(gòu)， 除了位于隱窩底部的腸道干細胞外， 腸上皮細胞主要包括2 大類：吸收細胞和分泌細胞。 分泌細胞主要包括杯狀細胞、潘氏細胞、內(nèi)分泌細胞和簇狀細胞等[24]。 每種類型細胞具有特定的基因和蛋白構(gòu)成，行使特定的功能，與非腸道上皮細胞相比，腸道上皮細胞普遍表達鈣黏蛋白（E-cadherin）；腸道內(nèi)分泌細胞表達有嗜鉻粒蛋白A （Chramogrin A，Chr-A）， 腸道內(nèi)分泌細胞包括表達有胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）的L-型細胞，表達有抑胃肽（GIP）的I 型細胞等； 腸道杯狀細胞表達有黏液素（Mucin2）； 能夠產(chǎn)生用于維持腸道干細胞平衡的生長因子及產(chǎn)生抗菌肽的腸道潘氏細胞表達有溶菌酶（Lysozyme）；腸道吸收細胞表達有鈣依賴性肌動蛋白結(jié)合蛋白Villin。利用上述特定細胞蛋白表達特征， 本研究利用特定蛋白抗體結(jié)合免疫熒光分析了腸道類器官與相應腸道上皮細胞組成。如圖3a、3d 和3g 所示的上皮鈣黏蛋白 （E-cadherin）標記的小腸類器官與小腸組織結(jié)果表明，腸道類器官與小腸組織上皮具有結(jié)構(gòu)一致性， 由單層上皮細胞組成， 而且上皮層環(huán)繞形成一個閉合的腔體結(jié)構(gòu)。 而蛋白Villin、Lysozyme、Muc2、Chr-A 及GLP-1 結(jié)果表明，小腸類器官與體內(nèi)小腸組織具有相同的多細胞組成特點。 上述特征克服了以改造的細胞系為體外研究模型的細胞單一的缺點， 而且細胞改造的過程中也可能導致部分基因性狀的改變。 如圖4 所示，RT-PCR 分析了腸道組織及具有相同來源不同代次腸道類器官特征細胞基因表達組成，結(jié)果與上述免疫熒光結(jié)果一致，表明腸道類器官與腸道組織具有相同細胞組成，而且這種組成具有代次穩(wěn)定性。上述特征綜合表明，與腫瘤細胞系相比， 腸道類器官具有腫瘤細胞系的可傳代和傳代穩(wěn)定性特征， 而且同時也克服了腸道來源腫瘤細胞系的細胞種類單一及腸道組織不可傳代性缺點， 為基于類器官的食物與腸道相互作用試驗數(shù)據(jù)的收集提供可靠的體外研究模型。

圖3 免疫熒光分析不同區(qū)段小腸類器官及小腸上皮細胞組成Fig.3 Representative immune-fluorescence images of organoid and tissue of different segment of small intestine

圖4 不同類型腸道上皮細胞標志蛋白編碼基因在十二指腸、空腸、回腸組織及同源P3、P8 代類器官的表達Fig.4 Expression of coding genes of marker proteins of different types of intestinal epithelial cells duodenum， jejunum and ileum tissue， organoids of homologous passage 3 and passage 8

3 結(jié)論

本文通過分離含有腸道干細胞的腸道隱窩，經(jīng)過體外培養(yǎng)能夠形成與供體結(jié)構(gòu)和細胞組成相似的腸道類器官，類器官具有可傳代性，而且不同代次之間具有生長表型和細胞組成穩(wěn)定性， 可以為食品領域營養(yǎng)物質(zhì)及功效成分功能評價， 甚至吸收評價提供更加真實的體外研究工具。