基于耐消化肽的核桃主要過敏原Jug r 2的線性表位篩選

郝夢真， 李欣芮， 牟 瑤， 陳 錫， 車會蓮

（中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院 食品質量與安全北京實驗室 北京100083）

樹堅果過敏是常見的食物過敏之一， 估計其全球流行率為0.05%至4.9%， 而且流行率還在增加[1]。 據美國國家自報登記處的記錄，樹堅果尤其是核桃， 是食物過敏導致致命或接近致命反應的主要原因[2]。 Jug r 2 是核桃中的主要過敏原[3]，Jug r 2 為7S 球蛋白， 通過BLAST 搜索發(fā)現，其蛋白序列不僅與黑核桃中7S 球蛋白過敏原Jug n 2 相似，而且與其它植物來源的7S 球蛋白過敏原相似，例如花生Ara h 1 和大豆Gly m 5[4]。 7S 球蛋白由3 個亞基組成[5]，與其它7S 球蛋白相似，一個成熟的Jug r 2 蛋白亞基是由約66 ku 前體蛋白在其第173 個氨基酸位點斷裂而形成的， 其分子質量約為44 ku[3]。

食物過敏原線性表位是研究過敏原結構及其致敏性關系的重要方面。 食物過敏原的線性表位可分為T 細胞表位和B 細胞線性表位。 其中T 細胞僅能識別抗原呈遞細胞（如樹突狀細胞）的主要組織相容性復合體分子中出現的抗原衍生肽[6]。由過敏原來源的肽激活2 型CD4+T 細胞是食物過敏反應中的關鍵步驟，該肽通常至少由13 個連續(xù)氨基酸組成[7]；過敏原連續(xù)氨基酸序列形成的B 細胞線性表位可與特異性IgE 結合， 是食物過敏反應中肥大細胞或嗜堿性粒細胞釋放過敏介質的關鍵觸發(fā)點[6]，該肽通常由8～15 個連續(xù)氨基酸組成[8]。目前， 免疫信息學方法是一種預測過敏原B 細胞線性表位的常見高效方法， 該方法利用過敏原的理化性質對抗原的線性表位進行預測， 例如蛋白質局部親水性、表面可及性、可塑性和抗原性等，這極大程度降低了合成試驗成本和時間， 并提示某些連續(xù)氨基酸序列具有與IgE 結合的可能[9]。

食物過敏是發(fā)生在在胃腸道的免疫反應[10]，食物過敏原可通過多種屏障進入機體，例如皮膚、呼吸道、胃腸道，與其它屏障相比胃腸道對食物蛋白的消化作用會造成蛋白質結構的破壞， 從而影響其生物活性， 食物過敏原內在消化穩(wěn)定性和致敏性之間似乎不存在確定的核心關系[11]。 某些食物過敏原對消化高度敏感， 其消化產物在到達腸道黏膜誘導免疫系統時仍保持足夠的結構和大小，可以被抗原呈遞細胞攝取[12]，這依賴于耐消化肽重組成特定結構和腸道免疫系統對其識別及攝取的能力， 因此食物過敏原在胃腸道的消化情況以及消化產物是影響過敏原致敏潛能的關鍵因素[13]。 除此之外，在腸道中耐消化肽具有與腸道部位IgE 結合的活性， 從而可能引發(fā)過敏反應中的胃腸道癥狀。 最近的一項研究強調胃腸組織中局部IgE 反應的重要性， 證明了胃腸道組織是產生IgE+B 系細胞的重要募集場所[14]。 評估食物過敏原抗消化肽成為研究食物過敏原在腸道部位致敏性的潛在方法。有研究者[15]對花生過敏原Cupin 家族的Ara h 1 的胃腸道消化產物進行分析， 發(fā)現其消化短肽仍具有與特異性IgE 結合和致敏活性，而Ara h 1 與Cupin 家族的其它蛋白相似，極易在胃腸道內被分解， 因此推測食物蛋白的耐消化性并不是其具備免疫原性或免疫反應性的必要條件。目前，在評估食物過敏原的胃腸道保存能力時，大部分研究關注完整蛋白的消化穩(wěn)定性，很少關注食物過敏原消化肽的穩(wěn)定性、大小及組成。

本研究的目的是通過將核桃過敏原體外胃腸液模擬消化降解產物， 與已知的線性表位和通過生物信息學預測得到的線性表位進行比較， 并將其定位至模擬Jug r 2 三維結構上，以進一步認識Jug r 2 的結構特點， 旨在為評估核桃過敏原Jug r 2 免疫原性和免疫反應性，以及進一步研究導致食物過敏的過敏原分子結構條件提供試驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本文所用血清取自6 名對核桃過敏的患者，具有攝食核桃后產生系統性過敏反應的病史，或在醫(yī)院進行皮膚點刺試驗時對核桃產生陽性反應。 研究獲得血清提供者的知情同意。

英國核桃購自天津薊縣。 BCA 蛋白定量試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；標準蛋白分子質量Marker，Thermo Fisher 公司； 牛血清白蛋白BAS、生物素標記的山羊抗人IgE 抗體、胃蛋白酶P7000、 胰蛋白酶P3292，Sigma 公司；HRP 標記鏈霉親和素，Thermo Scientific 公司；HRP-TMB 顯色試 劑 盒，Millipore 公 司；0.22 μm 硝酸纖維薄膜，Whatman 公司。

1.2 儀器與設備

電子天平，瑞安市英衡電器有限公司；多功能酶標儀，Thermo Scientific 公司；DYY-7C 型電泳儀，北京市六一儀器廠；Geno Sens 1850 凝膠成像分析系統、ChemiScope 3300 mini 化學發(fā)光成像系統， 上海勤翔科學儀器有限公司；JB-3 磁力攪拌器， 上海富磁新徑儀器有限公司；TGL-16M 臺式高速冷凍離心機，廣州廣一科學儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱，寧波萊?？萍加邢薰荆粩碉@圓周搖床，Scilogex 公司； CC-K6 加熱制冷型恒溫水浴鍋，德國Huber 公司；漩渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 核桃粗蛋白的浸提 按姜松松等[16]的方法提取核桃中的粗蛋白。將核桃剝殼，去除核桃外硬殼并去皮，打碎成細粉末。 稱取10 g 所得核桃粉，加入100 mL 正己烷溶液， 于4 ℃磁力攪拌脫脂2 h，然后于4 ℃、8 000×g 離心30 min，棄上清，將所得沉淀再經過上述方法重復脫脂2 次， 于通風櫥內將沉淀部分充分晾干，得到脫脂核桃粉末。將脫脂核桃粉于PBS 緩沖液（0.1 mol/L）按質量∶體積比1∶10 進行混合， 于4 ℃環(huán)境中使用磁力攪拌器攪拌12 h，然后于4 ℃、10 000×g 離心20 min，取上清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 免疫印跡 按照Downs 等[17]的方法進行血清IgE 識別核桃過敏原的免疫印跡試驗。 對蛋白粗提物進行SDS-PAGE 電泳后，在80 V 恒壓下電轉2 h，將蛋白條帶印跡到硝酸纖維薄膜（NC）上。使用封閉液（5% BSA-TBST）室溫封閉1 h 后，加入用稀釋液（5% BSA-TBST）以1∶10 比例稀釋的過敏患者混合血清作為一抗在4 ℃下孵育過夜。用TBST 洗滌6 次后，加入1∶8 000 稀釋的生物素標記山羊抗人IgE 抗體作為二抗室溫孵育1 h。 用TBST 洗滌6 次后，加入1∶500 稀釋的HPR 標記鏈霉親和素作為三抗孵育1 h。TBST 洗滌后，使用化學發(fā)光底物顯色，成像系統拍照。

1.3.3 免疫信息學預測Jug r 2B 細胞線性表位使用免疫信息軟件DNAStar Protean 系統和ABCpred 在線工具，預測Jug r 2 的線性表位。

在DNAStar Protean 系統中，以氨基酸序列的親水性、柔韌性、可達性和抗原性4 種性質作為表位預測的參數。 親水性、柔韌性、表面可及性和抗原性的預測分別按照Kyte 等[18]、Karplus 等[19]、Emini 等[20]和Jameson 等[21]的方法進行?；谝陨系姆椒ǎ肈NAStar 預測了具有合適的親水性、高柔韌性、 表面可及性和高抗原性的肽段為線性表位。BPAP 系統和BepiPred 1.0 服務器是基于氨基酸的親水性、柔韌性、接觸性、轉角和表面暴露等理化性質來預測線性表位的。

1.3.4 體外模擬胃液消化 模擬胃液和腸液由Toomer 等[22]所述制備，并進行了一些調整。模擬胃液： 在100 mL ddH2O 中溶解131.6 mg 胃蛋白酶和0.2 g NaCl，用HCl 調節(jié)pH 值至1.2，胃蛋白酶的活性≥2 000 U/mg。模擬腸液：在100 mL ddH2O中溶解1 g 胰蛋白酶和0.7 g KH2PO4，用NaOH 調整pH 值至7.5，胰蛋白酶的活性需要滿足如下條件：在40 ℃、pH 7.5 時，60 min 內胰蛋白酶水解酪蛋白質量是胰蛋白酶質量的25 倍。 參照Guo 等[23]的方法進行體外胃腸消化試驗。

1.3.5 Jug r 2 抗消化肽序列分析 利用納米級的HPLC 系統Easy-nLC 1000 對Jug r 2 消化產物進行分析。流動相：0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸乙腈溶液（B）。用95%的A 液平衡色譜柱。樣品通過自動取樣器加載到柱前C18 柱（3 mm，0.10 mm×20 mm），然后用C18 分析柱分離（1.9 mm，0.15 mm×120 mm），流速600 nL/min。 用毛細管高效液相色譜對樣品進行分離， 用Q-Exactive 質譜儀對樣品進行裂解。

使用PFind 2.6 軟件對通過串聯質譜分析得到的Jug r 2 消化產物序列進行鑒定，該過程數據庫檢索。 數據庫檢索參數如下：胃蛋白酶或胰酶；漏切位點：2；固定修飾：酰甲基化修飾（C）；可變修飾：乙酰化（N）、谷氨酰胺修飾為焦谷酰酸（N 段）、氧化（M）；前體質量偏差：±1.5 u；碎片質量偏差：±0.5 u；肽段可信度：高；肽段長度：＞4；肽段FDR：≤0.01。

1.3.6 Jug r 2 的同源建模 在Protine Data Bank，使用BLAST 來搜索一個已知的蛋白質作為模板[24]。這個模板應該與Jug r 2 具有高度的序列同源性。 因此， 推測Car i 2 與Jug r 2 約有91.65%的一致性。 利用7S 球蛋白的SWISSMODEL 網站中的比對模式作為模板，建立了較為準確的三維模型[25]。 通過分子動力學模擬和能量最小化，得到了Jug r 2 的三維模型。 利用可視化軟件RasMol 查看Jug r 2 預測B 細胞線性表位和抗消化肽段在三維結構中的位置。

2 結果與分析

2.1 核桃主要過敏原Jug r 2 的B 細胞線性表位的生物信息學預測

DNAStar Protean 系統是基于表面可及性、柔韌性和氨基酸親水性對線性表位進行預測。 如圖1 所示， 表面可及和柔韌區(qū)域出現頻率增高說明這些區(qū)域在Jug r 2 中是柔軟的且易拉伸的，容易暴露在蛋白質表面。 完整序列中的高抗原指數區(qū)域具有形成線性表位的高度傾向。如表1 所示，根據這些性質，使用DNAStar 軟件分析最終得到Jug r 2 的8 個潛在B 細胞線性表位。

之后利用了ABCpred 在線工具對Jug r 2 的B 細胞線性表位進行預測，閾值設置為0.8，其結果如表1 所示。 兩種工具所預測的B 細胞線性表位存在很多重疊的部分， 以兩種工具預測的線性表位作為最終結果，不考慮存在爭議的結果。如表1 所示，最終通過兩種生物信息學預測得到8 條B細胞線性表位， 分別為AA186～199、AA226～230、AA257 ～263、AA284 ～289、AA373 ～382、AA389 ～398、AA408～414、AA472～487。 利用DNAStar 聯合ABCpred 預測得到的Jug r 2 的8 條B 細胞線性表位在Jug r 2 模擬三維模型中的定位。如圖2 所示，預測得到的8 條線性表位均位于Jug r 2 表面的β 折疊、轉角和無規(guī)卷曲處，這些區(qū)域的可變程度更大，可能具有更強的IgE 結合活性。

表1 DNAStar 和ABCpred 兩種免疫信息學工具預測的B 細胞線性表位Table 1 B cell linear epitopes predicted by two immunoinformatics tools of DNAStar and ABCpred

圖2 兩種免疫信息學預測得到的B 細胞線性表位在Jug r 2 模擬三維結構上的定位Fig.2 Location of B cells linear epitopes analyzed by two combined immunoinformatics tools in the tertiary structure of Jug r 2

2.2 核桃蛋白粗提物的SDS-PAGE 的電泳分析

核桃蛋白粗提物的SDS-PAGE 電泳結果如圖3 所示。 核桃總蛋白在17 ku 和10 ku 處有明顯的條帶， 經灰度值分析分別占總蛋白含量的28%和26%，其中分子質量為17 ku 的蛋白質對應于核桃中另一主要過敏原Jug r 1。 分子質量為10 ku 左右的蛋白條帶對應于7S 球蛋白Jug r 2 前體蛋白翻譯后修飾所切除的6～9 ku 小親水性肽段[3]。 該肽段經過質譜鑒定確實為Jug r 2 的產物。成熟的Jug r 2 單亞基分子質量位于44 ku 處， 占總蛋白含量的16%，此證明了本次核桃中過敏原Jug r 2提取成功。 提取的總蛋白經過BCA 試劑盒測定其質量濃度為20.66 mg/mL。

圖3 核桃總蛋白電泳分析Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis analysis of walnut proteins

2.3 核桃蛋白粗提物與核桃過敏患者血清池IgE結合情況

使用6 名核桃過敏患者血清建立血清池，通過免疫印跡試驗檢測其中與血清IgE 結合的主要的核桃過敏原。 如圖4 所示，患者血清池與44 ku處的Jug r 2 有明顯的結合，強度顯著高于其它蛋白質。

圖4 核桃蛋白粗提物的免疫印跡分析Fig.4 Western blot analysis of walnut proteins crude extracts

2.4 核桃蛋白粗提物抗胃蛋白酶和胰蛋白酶消化肽段的質譜分析

將核桃蛋白粗提物經胃蛋白酶或胰蛋白酶消化60 min 后的產物進行HPLC-MS/MS 檢測以確定屬于過敏原Jug r 2 的抗消化肽段。核桃蛋白粗提物經過60 min 的胃蛋白酶消化后， 經HPLCMS/MS 檢測共產生了4 953 個二級質譜。 根據Uniprot 數據庫提供的核桃過敏原氨基酸序列構建檢索數據庫，使用pFind 軟件搜索，鑒定出來源于Jug r 2 的4 條肽段 （如表2 所示）， 覆蓋其11%的氨基酸序列。 核桃蛋白粗提物經過60 min的胰蛋白酶消化后，經HPLC-MS/MS 檢測共產生了6 493 個二級質譜，據Uniprot 數據庫提供的核桃過敏原氨基酸序列構建檢索數據庫，使用pFind軟件搜索，鑒定出來源于Jug r 2 的13 條肽段（如表3 所示），覆蓋其46%的氨基酸序列。

表2 胃蛋白酶消化質譜與Jug r 2 匹配的肽段Table 2 Peptide matched with Jug r 2 by pepsin digestion through mass spectrometry

表3 胰蛋白酶消化質譜與Jug r 2 匹配的肽段Table 3 Peptide matched with Jug r 2 by trpsin digestion through mass spectrometry

（續(xù)表3）

2.5 抗消化肽在Jug r 2 一級序列和三維結構上的分布情況

為了進一步觀察這些抗消化肽在過敏原Jug r 2 一級序列上的分布情況，從NCBI 數據庫中獲取了Jug r 2 的序列。 如圖5 所示，這些抗消化肽段主要分布于Jug r 2 的C 端區(qū)域， 覆蓋了AA428～572 位點，約占74%的序列。 其中，經胃蛋白酶消化后，在AA515～528 處產生了兩條重疊肽段 （3 號和4 號）， 經胰蛋白酶消化后分別在AA470～483 （6 號和7 號）、AA488～513 （8 號和9號）和AA545～572（12 號和13 號）處產生重疊肽段，證明了這些區(qū)域具有較強的抗消化性。相比胃蛋白酶，Jug r 2 經過胰蛋白酶消化可獲取更多的肽段， 這可以提高耐消化肽預測B 細胞線性表位的效率。 值得注意的是抗胃蛋白酶消化肽段與8～11 號抗胰蛋白酶消化肽段存在重合區(qū)域，進一步說明Jug r 2 經過連續(xù)的胃腸道主要消化酶的消化， 肽段AA494～513、AA515～526、AA519～528 可以得以保留。最終篩選得到11 條抗消化的非重疊肽段， 分別為AA215～220，AA250～260，AA323～337，AA351～356，AA363～388，AA428～438，AA470～483，AA488～513，AA514～526，AA527～541，AA545～572。11 條抗消化肽段在Jug r 2 模擬三維模型中的定位如圖6 所示，11 條抗消化肽段中有2 條僅位于α 螺旋處，2 條同時存在α 螺旋和轉角結構，3 條同時存在β 折疊和轉角結構，2 條位于無規(guī)卷曲處。 相比預測得到的8 條B 細胞線性表位的定位特點，11 條抗消化肽段中出現了更多的α 螺旋結構， 盡管α 螺旋的結構可能會降低與IgE 結合能力[23]，然而11 條抗消化肽段所處的α 螺旋均處于Jug r 2 表面， 并且部分消化肽段同時位于α螺旋和轉角處， 即認為這些抗消化肽段可能位于α 螺旋的連接處。 按照Ktye 等[18]的原則，對11 條抗消化肽段在Jug r 2 中的疏水性分析如圖7 所示， 本研究發(fā)現11 條抗消化肽段處于Jug r 2 親水性區(qū)域的比例較高。李平等[26]對Cupin 家族的食物過敏原的B 細胞線性表位的特點進行總結，發(fā)現其B 細胞線性表位具有處于高度暴露于溶劑的區(qū)域；含有親水性側鏈；有一定的柔韌性的3 個特點。在本研究中所得到的11 條抗消化肽段均位于Jug r 2 的表面，親水性良好，且這些肽段所處轉角和無規(guī)卷曲結構具有可變性， 會提高其與IgE的結合活性。

圖5 抗消化肽段在Jug r 2 氨基酸序列中的定位Fig.5 Positioning of anti-digestive peptides in Jug r 2 amino acid sequences

圖6 11 條抗消化肽段在Jug r 2 模擬三維結構上的定位Fig.6 Location of 11 digestion-resistant peptides in the tertiary structure of Jug r 2

圖7 11 條抗消化肽段的疏水分析Fig.7 Hydrophobicity analysis of 11 anti-digestible peptides

2.6 Jug r 2 抗消化肽段與Jug r 2 線性表位重合程度分析

胞 線 性 表 位[27]，在AA250 ～260、AA363 ～388 和AA470～483 位置的抗消化肽均與預測的線性表位存在部分氨基酸序列的交叉， 說明B 細胞線性表位可能具有一定的抗消化性。 除此之外，在

如圖8 所示，Jug r 2 的抗消化肽段在蛋白質全序列的AA545～572 位置附近含有已知的B 細AA215 ～220、AA250 ～260、AA323 ～337、AA363 ～388、AA428～438、AA470～483、AA545～572 位置的抗消化肽段與已知的T 細胞表位交叉，核桃Jug r 2 的T 細胞表位可能是誘導核桃過敏患者外周血T 細胞向Th2 中樞記憶表型分化的因素[28]，Th2 細胞驅動IgE 類轉換和過敏效應細胞的擴大是引發(fā)過敏反應的關鍵環(huán)節(jié)[29]。

圖8 抗消化肽段和預測表位在Jug r 2 氨基酸序列中的定位Fig.8 Position of anti-digestive peptides and predicted epitopes in amino acid sequence of Jug r 2

食物過敏原進入機體的主要途徑是消化道黏膜表面， 過敏原在消化道內所具有的特定分子特性與腸道駐留免疫細胞相互作用所必需的， 這些特定分子特性包括食物過敏原的消化特性[30]。 某些食物過敏原經過模擬胃腸道消化后形成的蛋白片段仍保持與IgE 結合活性，例如花生過敏原Ara h 1[15]、Ara h 3[31]和獼猴桃蛋白[32]。 在本研究中同樣也發(fā)現了核桃主要過敏原Jug r 2 的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶消化短肽， 與預測和實際得到的B細胞線性表位存在重疊，因此Jug r 2 抗消化肽段成為篩選B 細胞線性表位的方法。 除此之外，Jug r 的抗消化肽段與實際T 細胞表位存在重疊，這進一步指出胃腸道消化對核桃主要過敏原Jug r 2 消化后引起腸道黏膜免疫細胞反應的作用機制可能與抗消化肽段有關。

本研究中核桃蛋白所處的體外消化環(huán)境較為簡單， 所采用的體外胃腸模擬消化并不能完全反映核桃蛋白在核桃整個食物基質中的消化行為，特別是由于腸道不同部位發(fā)揮作用的消化酶種類的不同[33]，可能導致該研究結果具有一定的局限性。 除此之外，核桃主要過敏原Jug r 2 抗消化肽是否具有與IgE 結合能力仍需更多的核桃過敏患者血清來進一步驗證。

3 結論

盡管固相肽合成法是研究Jug r 2 線性表位的金方法，但是由于合成成本高且盲目性大，因此目前尋找相關輔助方法以提高Jug r 2 線性表位的識別效率是重要的研究方向。 本研究發(fā)現了Jug r 2 抗消化肽段具有B 細胞線性表位所具備的親水性和柔韌性的特點， 并且通過一級序列和三維定位分析發(fā)現了Jug r 2 抗消化肽段與預測和真實的B 細胞線性表位以及T 細胞線性表位重疊。基于Jug r 2 抗消化肽段的一級序列和三維定位的分析可能是預測Jug r 2 線性表位的有效策略，并且本研究也有助于研究核桃主要過敏原Jug r 2 在胃腸道致敏機制。