大負(fù)荷運(yùn)動后時(shí)鐘基因Bmal1調(diào)控骨骼肌線粒體結(jié)構(gòu)功能的作用機(jī)制*

夏雨， 丁海麗， 傅澤鋌

·短篇論著·

大負(fù)荷運(yùn)動后時(shí)鐘基因調(diào)控骨骼肌線粒體結(jié)構(gòu)功能的作用機(jī)制*

夏雨， 丁海麗△， 傅澤鋌

（成都體育學(xué)院運(yùn)動醫(yī)學(xué)與健康研究所，四川 成都 610041）

探討大負(fù)荷運(yùn)動后大鼠骨骼肌時(shí)鐘基因節(jié)律振蕩變化及其對線粒體結(jié)構(gòu)功能的調(diào)控作用。將156只成年SD大鼠隨機(jī)分為對照組和運(yùn)動組，運(yùn)動組予以一次大負(fù)荷運(yùn)動訓(xùn)練。每6 h取各組大鼠腓腸肌，使用RT-qPCR檢測各時(shí)相時(shí)鐘基因的mRNA水平，并用余弦分析軟件CircaCompare（R Packages）獲取擬合余弦曲線參數(shù)，分析時(shí)鐘基因的mRNA表達(dá)節(jié)律性振蕩情況，透射電鏡下觀察每周期始末（ZT0、ZT24、ZT48和ZT72）骨骼肌線粒體的形態(tài)學(xué)變化，Western blot檢測Bmal1和過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（peroxisome proliferator activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α）的蛋白表達(dá)，ELISA測定ATP和ADP含量，以及線粒體氧化呼吸鏈酶細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合物亞單位Ⅱ（subunits Ⅱ of cytochrome C oxidase complex，COX Ⅱ）和COX Ⅳ的活性。運(yùn)動組Bmal1的mRNA表達(dá)在ZT0～ZT24時(shí)節(jié)律出現(xiàn)紊亂（>0.05），ZT24～ZT48和ZT48～ZT72時(shí)節(jié)律恢復(fù)（<0.05）。大負(fù)荷運(yùn)動后運(yùn)動組線粒體形態(tài)于ZT0出現(xiàn)腫脹、嵴結(jié)構(gòu)損傷等異常，于ZT24和ZT48時(shí)有所恢復(fù)，ZT72時(shí)損傷基本消失。與對照組相比，運(yùn)動組Bmal1、PGC-1α的蛋白表達(dá)于ZT0時(shí)顯著升高（<0.05），ATP和ADP含量分別于ZT0時(shí)顯著下降和升高（<0.05），COX Ⅱ和COX Ⅳ活性于ZT0時(shí)顯著升高和下降（<0.05），在ZT24時(shí)二者活性下降至最低（<0.05）。大負(fù)荷運(yùn)動可誘發(fā)骨骼肌時(shí)鐘基因的節(jié)律紊亂，可能參與調(diào)控了線粒體的結(jié)構(gòu)功能異常。

大負(fù)荷運(yùn)動；時(shí)鐘基因；過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α；線粒體；骨骼肌

自2017年美國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)生物鐘基因及調(diào)控機(jī)制的過程而榮獲諾貝爾獎之后，有關(guān)生物節(jié)律的研究也引起了運(yùn)動醫(yī)學(xué)和運(yùn)動生理學(xué)領(lǐng)域研究人員的廣泛關(guān)注。生物鐘是生物體內(nèi)無形的“鐘表”，可調(diào)節(jié)機(jī)體行為、生理和生化反應(yīng)，是生物體內(nèi)一種普遍存在的分子振蕩器，控制和調(diào)節(jié)大量行為和生理現(xiàn)象的生物節(jié)律［1］。哺乳動物的生物鐘包括位于下丘腦視交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN）的中樞生物鐘［2］和位于骨骼肌、心、腎等外周組織器官的外周生物鐘［3］。中樞生物鐘可通過神經(jīng)、體液等方式直接或間接調(diào)控外周生物鐘，使外周生物鐘同步，且已有研究發(fā)現(xiàn)，外周生物鐘也可受行為（如進(jìn)食、運(yùn)動等）的影響而產(chǎn)生獨(dú)立的生物節(jié)律［4］。與運(yùn)動關(guān)系最為密切、研究最為廣泛的是晝夜節(jié)律，其能夠影響運(yùn)動能力及運(yùn)動水平的發(fā)揮，而運(yùn)動作為一種信號輸入也能影響晝夜節(jié)律［5］。骨骼肌作為外周組織，自身也擁有組織特異性節(jié)律表達(dá)，其在能量代謝、肌發(fā)生等生理功能中發(fā)揮著重要作用［6］。

生物節(jié)律與能量代謝之間能相互影響。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α）是整合外周生物時(shí)鐘和能量代謝的重要蛋白分子［7］。線粒體是真核細(xì)胞進(jìn)行生物氧化和能量代謝的主要場所，機(jī)體所需絕大部分能量由位于線粒體內(nèi)膜上的線粒體呼吸鏈提供，被稱之為“細(xì)胞動力工廠”。有研究證實(shí)線粒體生物活性具有振蕩節(jié)律，核心時(shí)鐘基因可調(diào)控骨骼肌線粒體形態(tài)、蛋白表達(dá)以及蛋白翻譯后修飾過程，從而引起線粒體代謝功能改變［8］。但在運(yùn)動誘發(fā)的骨骼肌線粒體生理功能異?；虿±磉^程中，的調(diào)控機(jī)制及作用途徑尚不明確。本研究擬通過在體動物實(shí)驗(yàn)，觀察一次大負(fù)荷運(yùn)動對骨骼肌核心時(shí)鐘基因振蕩節(jié)律及線粒體結(jié)構(gòu)功能的影響，并分析二者時(shí)相變化關(guān)系與特征，以期探究運(yùn)動后骨骼肌能量代謝變化的生物節(jié)律效應(yīng)機(jī)制。

材料和方法

1　實(shí)驗(yàn)動物

156只健康8周齡雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重200～230 g，購自成都達(dá)碩生物科技有限公司，許可證號為SCXK（川）2020-030。所有大鼠在成都體育學(xué)院SPF級動物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，自由攝食與飲水。實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度20～25 ℃，濕度67%～70%，光照與黑暗時(shí)間12 h交替，ZT（zeitgeber time）0，即光照起始時(shí)間，為早8：00開燈；ZT12，即光照結(jié)束時(shí)間，為晚20：00熄燈；ZT24則為下一周期的光照起始時(shí)間，24 h為一個節(jié)律周期。所有大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠4只。本實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)流程及實(shí)驗(yàn)方法均遵循我國現(xiàn)行的涉及實(shí)驗(yàn)動物倫理研究的相關(guān)政策法規(guī)，且經(jīng)成都體育學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)。

2　主要試劑

RNA Trizol Reagent購自合肥博美生物科技有限公司，異丙醇購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；PrimeScript RT reagent Kit購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；抗Bmal1抗體購自于Sigma；抗PGC-1α和GAPDH抗體，細(xì)胞色素C氧化酶復(fù)合物亞單位Ⅱ（subunit Ⅱ of cytochrome C oxidase complex，COX Ⅱ）和COX Ⅳ ELISA檢測試劑盒，HRP標(biāo)記的兔抗山羊IgG H&L和生物素化山羊抗兔IgG（H+L）均購自Abcam；大鼠三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）和二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP） ELISA檢測試劑盒購自武漢基因美生物科技有限公司；動物組織線粒體分離試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒（10%）購自上海雅酶醫(yī)藥生物科技有限公司；Bradford法蛋白檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

3　主要方法

3.1實(shí)驗(yàn)分組及運(yùn)動方案正式實(shí)驗(yàn)前大鼠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，隨后按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照（control，Con）組和運(yùn)動（exercise，Exe）組，各組根據(jù)運(yùn)動后不同取材時(shí)相（ZT0、ZT6、ZT12、ZT18、ZT24、ZT30、ZT36、ZT42、ZT48、ZT54、ZT60、ZT66和ZT72）分為13個亞組，共26組，每組6只。測定各亞組腓腸肌Bmal1的mRNA表達(dá)，每周期始末（ZT0、ZT24、ZT48和ZT72）測定線粒體形態(tài)、Bmal1和PGC-1α的蛋白表達(dá)等指標(biāo)。運(yùn)動干預(yù)前，Exe組大鼠先進(jìn)行２ d低負(fù)荷、短時(shí)間適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練［9］，第3天休息，第4天于光照開始時(shí)間ZT0前按照Armstong等［10］的經(jīng)典離心運(yùn)動方案進(jìn)行一次大負(fù)荷下坡跑運(yùn)動，坡度-16°，速度16 m/min，時(shí)間90 min，跑完即刻與ZT0時(shí)相相同。Con組大鼠正常飼養(yǎng)，不進(jìn)行運(yùn)動干預(yù)。

3.2動物取材及線粒體提取實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，兩組大鼠按照對應(yīng)時(shí)相進(jìn)行取材。先稱重后麻醉，按3.5 mL/kg體重注射10%水合氯醛，斷頸處死，迅速取雙側(cè)腓腸肌。隨后用冰冷生理鹽水漂洗，除去血液，濾紙拭干，剔除結(jié)締組織，分段備用。其中左側(cè)取中段約2 mm×3 mm×3 mm大小的組織存入2.5％戊二醛固定液中，制備電鏡樣品，其余組織用錫箔紙包裹保存于液氮中，后續(xù)移至-80 °C冰箱保存，用于RT-qPCR及Western bolt測定。右側(cè)切取100 mg腓腸肌放入離心管內(nèi)，按照線粒體分離試劑盒說明書差速離心法提取骨骼肌線粒體，隨即加入適量線粒體儲存液，重懸線粒體，先置于液氮速凍后再放入-80 ℃冰箱待測呼吸鏈復(fù)合物活性，剩余組織剪碎后勻漿，用于ELISA測定。

3.3Bmal1 mRNA表達(dá)的測定采用RT-qPCR檢測Bmal1 mRNA的表達(dá)，首先分別提取各亞組總RNA，隨后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，用于測定其表達(dá)情況的引物由上海生工生物工程管理技術(shù)發(fā)展服務(wù)有限公司進(jìn)行設(shè)計(jì)合成，并以ULTRAPAGE純化。Bmal1的上游引物序列為5'-TGCCACCAATCCATACAC-3'，下游引物序列為5'-TTCCCTCGGTCACATCCTAC-3'；β-actin的上游引物序列為5'-GAAGATCAAGATCATTGCTCC-3'，下游引物序列為5'-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3'。隨后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，使用Thermo Scientific PikoReal軟件分析PCR過程各檢測樣本的Ct值，最后通過2-ΔΔCt法計(jì)算相對mRNA表達(dá)水平。

3.4骨骼肌線粒體形態(tài)學(xué)的檢測采用透射電鏡觀察大鼠腓腸肌線粒體形態(tài)，取每周期始末（ZT0、ZT24、ZT48和ZT72）電鏡樣品，經(jīng)3%戊二醛預(yù)固定，1%四氧化鋨再固定，用丙酮逐級脫水，脫水劑濃度梯度為30%→50%→70%→80%→90%→95%→100%（100% 濃度處理換3次），再用環(huán)氧樹脂包埋，采用超薄切片機(jī)制備約50 nm厚的超薄切片，用醋酸鈾染色后再用枸櫞酸鉛染色，室溫下染色15～20 min，采用JEM-1400 FLASH透射電鏡觀察腓腸肌線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)。

3.5Western bolt檢測Bmal1和PGC-1α的蛋白表達(dá)取適量每周期始末肌肉樣本，經(jīng)過裂解、低溫離心收集上清液，用Bradford法蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度，并進(jìn)行蛋白變性處理。使用PAGE凝膠快速制備試劑盒（10%）制膠，上樣：40 μg（10 g/L）蛋白；電泳：穩(wěn)定電壓100 V，15 min；轉(zhuǎn)膜：200 mA轉(zhuǎn)膜1～2 h；封閉PVDF膜2 h。孵育Ⅰ抗的濃度分別為：Bmal1和PGC-1α，1∶1 000； β-actin，1∶100 000。Ⅱ抗孵育稀釋濃度為1∶5 000。將PVDF膜平鋪到曝光板上，利用ECL發(fā)光液顯影、定影，最后用天能GIS機(jī)箱控制軟件2.0對條帶進(jìn)行曝光掃描，結(jié)果以目的蛋白相對表達(dá)量表示。

3.6線粒體COX Ⅱ和COX Ⅳ活性的測定采用Abcam ELISA分析試劑盒測定COX Ⅱ和COX Ⅳ的活性，取適量每周期始末肌肉樣本，實(shí)驗(yàn)測定步驟分別按照試劑盒說明書進(jìn)行。最后按照公式：Rate（/min）=（1-2）/time （min）=（1-2）/Δ，計(jì)算出COX Ⅱ和COX Ⅳ活性，單位mOD/min。為排除實(shí)驗(yàn)環(huán)境及操作的誤差對線粒體復(fù)合物活性的影響，本實(shí)驗(yàn)采用相對活性表示各組各時(shí)相活性值。

3.7ATP和ADP含量的測定應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中大鼠ATP和ADP的含量，取適量每周期始末肌肉樣本，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，最后用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中指標(biāo)濃度。

4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。利用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布時(shí)，根據(jù)方差齊性不同分別選用檢驗(yàn)（方差齊）或近似檢驗(yàn)（方差不齊），不符合正態(tài)分布時(shí)選用秩和檢驗(yàn)，以<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

應(yīng)用余弦分析軟件CircaCompare（R Packages）獲取擬合余弦曲線參數(shù)，分析時(shí)鐘基因的mRNA表達(dá)節(jié)律性，擬合的余弦函數(shù)方程為Y=Mesor+Amplitude×cos（TimeRadians-φ），其中Mesor為基線/中值，Amplitude為節(jié)律震蕩的振幅，φ為峰值相位，TimeRadians為時(shí)間所對應(yīng)的弧度值，以<0.05表示具有顯著節(jié)律性。

結(jié)果

1　大負(fù)荷運(yùn)動對核心時(shí)鐘基因Bmal1 mRNA表達(dá)及節(jié)律的影響

1.1大負(fù)荷運(yùn)動對骨骼肌核心時(shí)鐘基因mRNA表達(dá)的影響RT-qPCR測定Bmal1的mRNA表達(dá)結(jié)果顯示，與Con組相比，Exe組于大負(fù)荷運(yùn)動后72 h內(nèi)，其Bmal1的mRNA表達(dá)呈先升高后下降的變化趨勢。在ZT0～ZT24期間，Exe組于Bmal1的mRNA水平在ZT0時(shí)顯著上調(diào)個，明顯高于Con組，并于ZT6、ZT12及ZT18仍保持明顯升高狀態(tài)（<0.05），在ZT24時(shí)Exe組Bmal1的mRNA水平較前有所降低，與Con組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（>0.05），在隨后兩天內(nèi)Exe組各時(shí)相Bmal1的mRNA水平與Con組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（>0.05），見圖1。

Figure 1.Changes of relative mRNA expression of Bmal1 at different phases after heavy load exercise. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs Con group.

1.2大負(fù)荷運(yùn)動對核心時(shí)鐘基因的mRNA節(jié)律的影響余弦分析軟件分析所得數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，ZT0～ZT24期間，Con組Bmal1的mRNA表達(dá)水平在ZT0～ZT12時(shí)下降，于ZT12開始升高，隨后回升至ZT24完成一個周期節(jié)律振蕩（<0.05），在之后2 d中，其變化趨勢與ZT0～ZT24相似，72 h內(nèi)共呈現(xiàn)3個完整節(jié)律性周期。ZT0～ZT24期間，Exe組Bmal1的mRNA未呈節(jié)律性表達(dá)（>0.05），之后兩天均恢復(fù)節(jié)律性（<0.05），見圖2、表1。

Figure 2.Rhythmic changes of fitting cosine function of Bmal1 mRNA expression after heavy load exercise. The samples were collected every 6 h within 72 h. A： ZT0～ZT72； B： ZT0～ZT24； C： ZT24～ZT48； D： ZT48～ZT72. n=6.

表1　R package分析大負(fù)荷運(yùn)動后Bmal1 mRNA表達(dá)的晝夜節(jié)律參數(shù)值

2　大負(fù)荷運(yùn)動對大鼠每晝夜節(jié)律周期中骨骼肌線粒體形態(tài)學(xué)的影響

透射電鏡結(jié)果顯示，Con組大鼠Z線流暢，線粒體均勻分布于Z線兩側(cè)，呈長線形或卵圓形，嵴結(jié)構(gòu)清晰；Exe組于ZT0時(shí)，Z線不規(guī)整，線粒體分布不均，形狀不規(guī)整，大小不一，開始腫脹，嵴結(jié)構(gòu)不清晰；ZT24時(shí)，線粒體形態(tài)有所恢復(fù)，消失的嵴結(jié)構(gòu)開始出現(xiàn)；ZT48時(shí)，部分線粒體形狀恢復(fù)，呈細(xì)長桿狀或橢圓形，線粒體損傷減輕；ZT72時(shí)，線粒體形態(tài)已基本恢復(fù)至正常水平，見圖3。

Figure 3.Morphological observation of skeletal muscle mitochondria by electron microscopy at ZT0，ZT24，ZT48 and ZT72.

3　大負(fù)荷運(yùn)動對大鼠每晝夜節(jié)律周期中骨骼肌Bmal1和PGC-1α蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與Con組相比，Exe組的Bmal1和PGC-1α蛋白表達(dá)在ZT0時(shí)顯著升高（<0.05），隨后表達(dá)逐漸下降，于ZT24、ZT48、ZT72時(shí)與Con組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（>0.05），見圖4。

Figure 4.Changes of Bmal1 and PGC-1α protein expression in the skeletal muscle at ZT0，ZT24，ZT48 and ZT72. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs Con group.

4　大負(fù)荷運(yùn)動對大鼠每晝夜節(jié)律周期中線粒體COX Ⅱ和COX Ⅳ活性的影響

ELISA結(jié)果顯示，Con組COX Ⅱ與COX Ⅳ相對活性值為1.000±0.000，與Con組相比，Exe組COX Ⅱ相對活性值在ZT0時(shí)顯著升高（<0.05），在ZT24時(shí)最低，較Con組顯著下降（<0.05），在ZT48和ZT72時(shí)與Con組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（>0.05）。Exe組COX Ⅳ相對活性值在ZT0和ZT24時(shí)較Con組顯著降低（<0.05），在ZT48和ZT72時(shí)與Con組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（>0.05），見圖5。

Figure 5.Changes of mitochondrial COX Ⅱ and COX Ⅳ activity （relative activity） at ZT24，ZT48 and ZT72. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs Con group.

5　大負(fù)荷運(yùn)動對大鼠每晝夜節(jié)律周期中骨骼肌ATP和ADP含量的影響

ELISA結(jié)果顯示，與Con組相比，Exe組ATP含量于ZT0時(shí)顯著下降（<0.05），在ZT24、ZT48及ZT72時(shí)與Con組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（>0.05）。Exe組ADP含量于ZT0時(shí)顯著升高（<0.05），于ZT24、ZT48及ZT72時(shí)與Con組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（>0.05），見圖6。

Figure 6.The content of ATP and ADP in skeletal muscle at ZT24，ZT48 and ZT72. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs Con group.

討論

運(yùn)動作為一種授時(shí)因子可與時(shí)鐘基因相互調(diào)控，研究發(fā)現(xiàn)跨時(shí)區(qū)產(chǎn)生的時(shí)差變化可影響運(yùn)動表現(xiàn)能力［11］。在中樞時(shí)鐘基因正常的情況下，運(yùn)動類型、強(qiáng)度、時(shí)間以及運(yùn)動時(shí)間段可作為外來輸入信號引起骨骼肌核心時(shí)鐘基因發(fā)生相移，導(dǎo)致節(jié)律基因表達(dá)紊亂［4，7］。Kemler等［9］證實(shí)小鼠在一天中非活動時(shí)間運(yùn)動可引起骨骼肌核心時(shí)鐘基因mRNA表達(dá)發(fā)生變化。Zambon等［12］通過人體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，受試者下肢經(jīng)過一次30～45 min的大負(fù)荷抗阻運(yùn)動之后（包括向心運(yùn)動和離心運(yùn)動），結(jié)果顯示運(yùn)動后6 h和18 h股外側(cè)肌Bmal1的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，且晝夜節(jié)律發(fā)生相移。另有報(bào)道提出骨骼肌為運(yùn)動時(shí)機(jī)體主要的能量代謝器官，很多參與調(diào)控能量代謝的基因具有晝夜節(jié)律特點(diǎn)，同時(shí)能量代謝與時(shí)鐘基因能相互影響，從而引起骨骼肌時(shí)鐘基因發(fā)生節(jié)律紊亂及表達(dá)改變［13］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Con組大鼠骨骼肌核心時(shí)鐘基因mRNA呈晝夜節(jié)律表達(dá)，此結(jié)果與國外文獻(xiàn)報(bào)道相符［14］。Exe組Bmal1的mRNA表達(dá)于ZT0、ZT6和ZT18時(shí)顯著上升，運(yùn)動后的第１天（ZT0～ZT24）失去振蕩節(jié)律，第２天（ZT24～ZT48）和第３天（ZT48～ZT72）基本恢復(fù)振蕩節(jié)律，每周期始末Bmal1的蛋白表達(dá)于ZT0時(shí)顯著升高，隨后下降恢復(fù)至正常水平，與其基因表達(dá)趨勢相吻合。該結(jié)果變化與上述報(bào)道相符，提示一次大負(fù)荷急性運(yùn)動可影響核心時(shí)鐘基因的mRNA、蛋白表達(dá)及振蕩節(jié)律，但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

線粒體是機(jī)體進(jìn)行能量代謝的主要場所，為細(xì)胞的生命活動提供能量，其結(jié)構(gòu)及功能狀態(tài)決定了能量供應(yīng)效率。線粒體結(jié)構(gòu)變化主要是由于其分裂、融合以及自噬而引起的形態(tài)和大小的改變，位于線粒體內(nèi)膜上的線粒體呼吸鏈提供了細(xì)胞生存所需絕大部分能量，其活性及ATP和ADP含量是反映線粒體氧化合成功能的重要指標(biāo)。線粒體結(jié)構(gòu)功能由多種功能蛋白調(diào)控，近年來PGC-1α被認(rèn)為是一種調(diào)節(jié)能量代謝的轉(zhuǎn)錄共激活因子，為線粒體質(zhì)量控制體系最主要的調(diào)控者，在調(diào)節(jié)線粒體功能、氧化應(yīng)激和多種組織代謝途徑等方面發(fā)揮著重要作用，且受時(shí)鐘基因調(diào)控呈節(jié)律性表達(dá)［15］，也是整合生物鐘和能量代謝晝夜節(jié)律振蕩器的關(guān)鍵組成部分［16］。

在以上透射電鏡觀察腓腸肌線粒體超微結(jié)構(gòu)的結(jié)果中，Exe組在ZT0時(shí)Z線不規(guī)整，線粒體出現(xiàn)分布不均，大小不一，空泡樣改變，腫脹及嵴結(jié)構(gòu)消失，ZT24時(shí)開始恢復(fù)，嵴結(jié)構(gòu)重新出現(xiàn)，ZT48時(shí)線粒體損傷減輕，形態(tài)有所恢復(fù)，ZT72時(shí)形態(tài)基本恢復(fù)。有實(shí)驗(yàn)證明非習(xí)慣的大負(fù)荷運(yùn)動，尤其是離心運(yùn)動可引起骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)變化［17］。本研究Exe組進(jìn)行的運(yùn)動干預(yù)為一次大負(fù)荷下坡跑運(yùn)動，腓腸肌做離心收縮，因此可引起骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)改變。此外，時(shí)鐘基因?qū)€粒體結(jié)構(gòu)維持具有重要作用，當(dāng)晝夜節(jié)律紊亂時(shí)，骨骼肌可發(fā)生線粒體體積和氧化呼吸減少、纖維型移位、肌節(jié)結(jié)構(gòu)改變和肌肉功能受損［18］。且有研究證實(shí)-/-小鼠的腓腸肌線粒體可出現(xiàn)體積減小或缺失、腫脹、嵴破裂等形態(tài)學(xué)改變，同時(shí)PGC-1α表達(dá)顯著下降、節(jié)律性顯著改變［8］。大負(fù)荷運(yùn)動后結(jié)果顯示Exe組Bmal1和PGC-1α蛋白表達(dá)于ZT0時(shí)明顯升高，72 h內(nèi)線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)變化與Bmal1振蕩節(jié)律及每周期始末Bmal1和PGC-1α蛋白表達(dá)趨勢相符，提示大負(fù)荷運(yùn)動后核心時(shí)鐘基因可能通過調(diào)控PGC-1α蛋白表達(dá)從而影響骨骼肌線粒體結(jié)構(gòu)。

COX Ⅱ和COX Ⅳ是反映線粒體功能的標(biāo)志性酶，其活性增強(qiáng)，呼吸鏈傳遞電子的效率提高，組織的氧利用能力隨之增強(qiáng)，有利于組織有氧代謝，標(biāo)志著細(xì)胞內(nèi)能量即ATP合成增多。本實(shí)驗(yàn)中COX Ⅱ的活性于ZT0時(shí)升高，ZT24時(shí)下降至最低，COX Ⅳ活性于ZT0和ZT24時(shí)顯著下降。ATP和ADP含量分別于ZT0時(shí)顯著下降和升高，隨后恢復(fù)至正常。COX Ⅱ的活性變化與Tonkonogi等［19］研究結(jié)果相似。受試者在進(jìn)行急性高強(qiáng)度運(yùn)動之后，股外側(cè)肌線粒體產(chǎn)生ATP的能力下降并未即刻出現(xiàn)在運(yùn)動后，而在恢復(fù)期才開始。有學(xué)者認(rèn)為大強(qiáng)度跑臺運(yùn)動后即刻COX Ⅱ活性顯著升高，可能與長時(shí)間運(yùn)動對能量供應(yīng)的需求增加，中間代謝產(chǎn)物增多，使以琥珀酸為底物的COX Ⅱ的活性升高，是一種代償性變化［20］。COX Ⅳ活性變化與王瑩［21］的研究結(jié)果相符，一次力竭運(yùn)動可導(dǎo)致骨骼肌線粒體COX Ⅳ活性顯著下降。ATP和ADP含量變化結(jié)果與丁巖等［22］的報(bào)道相一致，本研究采用的運(yùn)動方案為急性高強(qiáng)度運(yùn)動，骨骼肌劇烈收縮可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的ATP和ADP水平分別下降和升高。

上述一次大負(fù)荷運(yùn)動后骨骼肌線粒體氧化合成功能變化同樣也與基因振蕩節(jié)律及Bmal1和PGC-1α蛋白表達(dá)趨勢相吻合。Popov等［23］檢測受試者大強(qiáng)度自行車運(yùn)動后各時(shí)相股外側(cè)肌時(shí)鐘基因和基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)均顯著上調(diào)，并提出高強(qiáng)度運(yùn)動后基因表達(dá)變化可能是受到晝夜節(jié)律調(diào)控的。PGC-1α是調(diào)控線粒體功能的關(guān)鍵因子，在骨骼肌、肝臟及心臟等高能量需求組織中表達(dá)會明顯增強(qiáng)，能促進(jìn)呼吸鏈復(fù)合物的表達(dá)［24］。因此可推測骨骼肌核心時(shí)鐘基因可通過調(diào)控PGC-1α表達(dá)從而參與大負(fù)荷運(yùn)動后線粒體氧化合成功能的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸。

綜上所述，大鼠骨骼肌核心時(shí)鐘基因呈晝夜節(jié)律振蕩趨勢，一次大負(fù)荷運(yùn)動可誘發(fā)該基因節(jié)律紊亂，其時(shí)相變化與骨骼肌線粒體形態(tài)及呼吸鏈氧化合成功能病理變化相一致，推測核心時(shí)鐘基因可調(diào)控PGC-1α從而影響線粒體結(jié)構(gòu)和功能，但關(guān)于基因是通過何種途徑來調(diào)控PGC-1α的，其分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。

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Effects of clock geneon the the structure and function of skeletal muscle mitochondria after heavy load exercise

XIA Yu，DING Hai-li△，F(xiàn)U Ze-ting

（，，610041，）

To investigate the effection of skeletal muscle clock geneon mitochondrial structure and function after heavy load exercise in rats.156 adult SD rats were randomly divided into control group and exercise group. The gastrocnemius muscle of each group were isolated in every 6 h，and the Bmal1 mRNA levels were detected by RT-qPCR. The parameters of fitting cosine curve were obtained by using the cosine analysis software CircaCompare （R Packages），and the rhythmic oscillation of clock genemRNA expression was analyzed. Morphological changes of skeletal muscle mitochondria at zeitgeber time（ZT） 0，ZT24，ZT48 and ZT72 were observed by transmission electron microscopy. Protein levels of Bmal1 and peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α （PGC-1α） were detected by Western bolt，contents of ATP and ADP and the activity of enzymes involved in the mitochondrial respiratory chain such as subunit Ⅱ of cytochrome C oxidase complex （COX Ⅱ） and COX Ⅳ were determined by ELISA.（1） The expression of Bmal1 mRNA was disturbed in ZT0～ZT24 （>0.05），and recovered in ZT24～ZT48 and ZT48～ZT72 （<0.05）. （2） After heavy load exercise，the morphology of mitochondria in exercise group showed swelling，crest damage at ZT0～ ZT24，recovered at ZT24～ ZT48 and ZT48～ ZT72. （3） Compared with control group，the protein levels of Bmal1 and PGC-1α in exercise group were significantly increased at ZT0 （<0.05）. （4） Decreased ATP and increased ADP in exercise group were observed at ZT0 （<0.05），the stimulated COXⅡ and decreased COXⅣ were measured at ZT0，and both decreased to the lowest at ZT24 （<0.05）.Heavy load exercise induce the rhythm disorder of skeletal muscle clock gene，which may be linked to the abnormal mitochondrial structure and function.

Heavy load exercise； Clock gene； PGC-1α； Mitochondria； Skeletal muscle

R318； R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.02.017

1000-4718（2022）02-0325-08

2021-10-12

2021-11-26

［基金項(xiàng)目］國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（No. 2018YFF0300604）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No. 81904318）；運(yùn)動醫(yī)學(xué)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨國家體育總局運(yùn)動醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目（No. 2021-A021）

Tel： 028-85051087； E-mail： dinghaili@cdsu.edu.cn

（責(zé)任編輯：宋延君，余小慧）