TGF-β1/Smad3信號軸的氧連糖基化修飾對小鼠心臟成纖維細(xì)胞活力和分化的影響*

金慧， 謝中杰， 張麗娜， 龔開政， 張振剛， 李如君△

TGF-β1/Smad3信號軸的氧連糖基化修飾對小鼠心臟成纖維細(xì)胞活力和分化的影響*

金慧1， 謝中杰2， 張麗娜1， 龔開政1， 張振剛1， 李如君1△

（1揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇 揚(yáng)州 225001；2臺州市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，浙江 臺州 318020）

探討TGF-β1/Smad3信號軸的氧連糖基化修飾（-連接的-乙酰葡萄糖胺修飾）對體外培養(yǎng)的小鼠心臟成纖維細(xì)胞（MCFs）在缺氧/復(fù)氧（H/R）后活力和分化的影響及機(jī)制。原代培養(yǎng)的MCFs缺氧6 h再恢復(fù)常氧24 h建立細(xì)胞H/R模型，通過感染-連接的-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶（OGT）重組腺病毒提高M(jìn)CFs氧連糖基化水平，將MCFs隨機(jī)分組為空載腺病毒預(yù)處理+常氧（Ad.Null+Ctrl）組、空載腺病毒預(yù)處理+H/R（Ad.Null+H/R）組、OGT腺病毒預(yù)處理+常氧（Ad.OGT+Ctrl）組和OGT腺病毒預(yù)處理+H/R（Ad.OGT+H/R）組。RT-qPCR檢測結(jié)締組織生長因子（CTGF）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）和IL-18 mRNA水平；Western blot檢測p-Smad3、Smad3、OGT和炎癥介質(zhì)蛋白水平；免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測Smad3修飾狀態(tài)及蛋白間相互結(jié)合；CCK-8法檢測細(xì)胞活力；免疫熒光共聚焦顯示Smad3亞細(xì)胞定位。H/R致使MCFs氧連糖基化水平下降，過表達(dá)OGT顯著緩解了H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞氧連糖基化水平降低（<0.05）。提高氧連糖基化水平抑制H/R誘導(dǎo)的MCFs活力和向肌成纖維細(xì)胞分化，減少I型膠原合成和炎癥介質(zhì)IL-1β/IL-18表達(dá)（<0.05）；TGF-β1信號軸胞內(nèi)關(guān)鍵分子Smad3氧連糖基化水平升高，并且Smad3磷酸化及核轉(zhuǎn)位受阻（<0.05）。氧連糖基化修飾競爭性抑制Smad3 Ser423/425磷酸化并使Smad3滯留于胞質(zhì)，負(fù)向調(diào)控TGF-β1/Smad3信號軸，抑制H/R對體外培養(yǎng)的小鼠心臟成纖維細(xì)胞功能變化的誘導(dǎo)。

心肌缺血再灌注損傷；心肌纖維化；心臟成纖維細(xì)胞；TGF-β1/Smad3信號通路；-連接的-乙酰葡萄糖胺修飾

心肌梗死患者接受以冠脈內(nèi)支架植入術(shù)為代表的血管再通治療后，仍舊出現(xiàn)心臟收舒功能低下，心律失常以及心力衰竭的現(xiàn)象，這與心梗后心臟病理性重構(gòu)密切相關(guān)。研究證實(shí)，心臟缺血梗死后經(jīng)典促纖維化通路——轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）信號軸活化并誘導(dǎo)小鼠心臟成纖維細(xì)胞（mouse cardiac fibroblasts，MCFs）增殖，分泌多種細(xì)胞外基質(zhì)（如Ⅰ型膠原），分化成肌成纖維細(xì)胞（myofibroblasts，MFBs）偶聯(lián)心肌細(xì)胞形成縫隙連接，表達(dá)炎癥細(xì)胞因子［如白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）/IL-18］參與炎癥反應(yīng)，最終形成以心肌纖維化為特征的心臟病理性重構(gòu)，是介導(dǎo)心肌梗死后心臟功能異常的重要病理學(xué)基礎(chǔ)。本課題組前期實(shí)驗(yàn)表明，-連接的-乙酰葡萄糖胺（-linked-acetylglucosamine，-GlcNAc）轉(zhuǎn)移酶（-GlcNAc transferase，OGT）通過提高細(xì)胞氧連糖基化修飾（-GlcNAc修飾，-GlcNAcylation）水平能夠顯著抑制應(yīng)激條件下MCFs增殖，但具體作用靶點(diǎn)不清。因而本項(xiàng)工作利用MCFs缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）建立心肌梗死血管再通治療的細(xì)胞模型，探討氧連糖基化修飾對H/R介導(dǎo)的MCFs損傷效應(yīng)的影響及可能機(jī)制。

材料和方法

1　主要材料

清潔級雄性成年（8～10周齡，20～25 g）C57BL/6小鼠購自揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號為SYXK（蘇）2017-0044；OGT過表達(dá)腺病毒（Ad-eGFP.OGT）和空載對照腺病毒（Ad-eGFP.Null）為本實(shí)驗(yàn)室保存；胰蛋白酶和Ⅰ型膠原酶購自Sigma-Aldrich；Trizol和RIPA裂解液購自中國北京普利萊基因技術(shù)有限公司；鼠氧連糖基化（-GlcNAc）抗體（CTD110.6）、鼠OGT抗體、鼠β-actin抗體、normal mouse IgG和Protein A/G plus agarose購自Santa Cruz；兔IL-1β、兔IL-18抗體、兔磷酸化Smad3（Ser423/425）抗體、HRP標(biāo)記抗兔IgG、HRP標(biāo)記抗鼠IgG和Alexa Fluor 555標(biāo)記抗兔IgG購自Cell Signaling Technology；兔Smad3抗體、兔Smad4抗體、鼠collagen I抗體、鼠α-SMA抗體和兔caspase-1抗體購自Abcam；蛋白酶磷酸酶抑制劑、DAPI染液、BCA蛋白定量試劑盒、CCK-8試劑盒購自中國上海碧云天生物技術(shù)有限公司；增強(qiáng)型ECL化學(xué)發(fā)光液、反轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒、SYBR Green熒光定量試劑盒、DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購自Thermo；PCR引物由中國上海生工生物工程有限公司合成。熒光倒置顯微鏡（Nikon）；RT-PCR擴(kuò)增儀（BIO-RAD，CFX96）；免疫印跡成像系統(tǒng)（iBright，CL1500）。

2　方法

2.1MCFs細(xì)胞原代培養(yǎng)參考已有文獻(xiàn)［1］，取5只小鼠在無菌條件下取出心臟并剪成組織塊后用預(yù)冷PBS洗凈血跡，混合酶液（胰酶+Ⅰ型膠原酶）充分消化后200目過濾并離心，取細(xì)胞沉淀重懸于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中置于體積分?jǐn)?shù)5% CO2、常氧培養(yǎng)箱中37 ℃絕對靜置培養(yǎng)90 min，利用差速貼壁法純化MCFs，棄去未貼壁細(xì)胞并繼續(xù)靜置培養(yǎng)，每3 d更換新鮮培養(yǎng)液。待細(xì)胞融合度達(dá)80%左右時用0.25%胰酶消化液消化傳代，選用P1代對數(shù)生長期的MCFs行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

2.2細(xì)胞預(yù)處理P1代MCFs生長融合至60%左右時，更換新鮮培養(yǎng)液并加入感染復(fù)數(shù)為10（MOI=10）劑量的Ad-eGFP.OGT繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h以提高細(xì)胞內(nèi)氧連糖基化水平，并設(shè)置Ad-eGFP.Null感染作為對照。

2.3實(shí)驗(yàn)分組將MCFs隨機(jī)分為4組：Ad-eGFP.Null預(yù)處理+常氧組（Ad.Null+Ctrl組）、Ad-eGFP.Null預(yù)處理+H/R組（Ad.Null+H/R組）、Ad-eGFP.OGT預(yù)處理+常氧組（Ad.OGT+Ctrl組）和Ad-eGFP.OGT預(yù)處理+H/R組（Ad.OGT+H/R組）。通過將預(yù)處理后的MCFs更換無血清培養(yǎng)液饑餓過夜后放置于5% CO2、95% N2、37 ℃培養(yǎng)箱中缺氧6 h，隨后移置于5% CO2、常氧、37 ℃培養(yǎng)箱中復(fù)氧24 h建立H/R細(xì)胞模型［2］。

2.4RT-qPCR檢測MCFs增殖、表型轉(zhuǎn)化和炎癥反應(yīng)相關(guān)因子的mRNA表達(dá)Trizol試劑抽提各分組細(xì)胞內(nèi)總RNA，經(jīng)過定量后各取600 ng總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行RT-qPCR檢測。引物設(shè)計來源于PCR引物公共數(shù)據(jù)庫PrimerBank。結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF/CCN2）的上游引物序列為5'-GGCCTCTTCTGCGATTTCG-3'，下游引物序列為5'-GCAGCTTGACCCTTCTCGG-3'；α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA/ACTA2）的上游引物序列為5'-CCCAGACATCAGGGAGTAATGG-3'，下游引物序列為5'-TCTATCGGATACTTCAGCGTCA-3'；IL-1β的上游引物序列為5'-GGCGGTTCAAGGCATAACAGGCT-3'，下游引物序列為5'-CAGCCCAAGTCAAGGGCTTGGA-3'；IL-18的上游引物序列為5'-AAGAACAAGATCATTTCCTTTGAGGA-3'，下游引物序列為5'-GGAACACGTTTCTGAAAGAATATGAG-3'；18S（內(nèi)參照）的上游引物序列為5'-GAAACGGCTACCACATCC-3'，下游引物序列為5'-CACCAGACTTGCCCTCCA-3'。PCR結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

2.5Western blot檢測關(guān)鍵蛋白水平RIPA裂解液抽取細(xì)胞總蛋白后BCA方法定量，經(jīng)100 ℃變性后各樣品取20 μg行電泳并濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉TBST室溫封閉1 h后分別加入相應(yīng)I抗4 ℃結(jié)合過夜，經(jīng)TBST洗膜3次后常溫孵育HRP標(biāo)記相應(yīng)Ⅱ抗2 h，洗膜后ECL化學(xué)發(fā)光并在iBright CL1500顯影；條帶經(jīng)ImageJ軟件分析灰度值，結(jié)果以目的條帶與內(nèi)參條帶比值顯示。

2.6細(xì)胞形態(tài)觀察利用重組腺病毒感染細(xì)胞后表達(dá)eGFP蛋白，可在熒光倒置顯微鏡下488 nm激發(fā)波長發(fā)射綠色熒光，借此觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

2.7CCK-8法檢測細(xì)胞活力P0代MCFs消化后調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107/L后傳代至96孔板中各100 μL，按實(shí)驗(yàn)分組（設(shè)置復(fù)孔）后在觀察終點(diǎn)加入每孔10 μL CCK-8反應(yīng)液并繼續(xù)培養(yǎng)箱孵育1 h，酶標(biāo)儀檢測每孔在450 nm波長吸光度（）值并統(tǒng)計分析。

2.8MCFs免疫熒光共聚焦MCFs經(jīng)PBS洗滌后用4%多聚甲醛固定15 min，再次洗滌后經(jīng)0.5% Triton X-100破膜5 min，隨后用5%山羊血清常溫封閉1 h，加入稀釋的Smad3抗體4 ℃結(jié)合過夜，用TBST洗滌3次后加入稀釋的Alexa Fluor 555標(biāo)記抗兔IgG常溫避光孵育2 h，TBST洗滌3次后用DAPI染液復(fù)染細(xì)胞核，熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光分布及共定位。

2.9免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測蛋白相互作用免疫共沉淀裂解液抽取細(xì)胞總蛋白后BCA方法定量，每樣品取600 μg總蛋白使用Smad3/Smad4抗體+Protein A/G plus agarose結(jié)合后離心共沉淀，吸取上清作為Input，沉淀物反復(fù)清洗離心后吸凈上清，加20 μL上樣緩沖液100 ℃變性后離心，取上清經(jīng)Western blot檢測目的蛋白表達(dá)。

3　統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié)果

1　過表達(dá)OGT緩解H/R誘導(dǎo)的MCFs氧連糖基化水平降低

Western blot結(jié)果顯示，與Ad.Null+Ctrl組相比，缺氧6 h復(fù)氧24 h的H/R過程導(dǎo)致Ad.Null+H/R組氧連糖基化程度顯著下降，OGT原生表達(dá)減弱（<0.05）；過表達(dá)OGT提高常氧狀態(tài)下即Ad.OGT+Ctrl組氧連糖基化水平（<0.05），并對抗H/R誘導(dǎo)的氧連糖基化水平下降（<0.05），見圖1。

Figure 1.Over-expression of OGT increased global O-GlcNAc level of MCFs at baseline and H/R. The levels of O-GlcNAc on whole protein and OGT were detected by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs Ad.Null+Ctrl group； #P<0.05 vs Ad.Null+H/R group.

2　提高氧連糖基化水平抑制H/R誘導(dǎo)的MCFs活力和細(xì)胞外基質(zhì)合成

RT-qPCR結(jié)果顯示，與Ad.Null+Ctrl組相比，Ad.Null+H/R組與促細(xì)胞增殖相關(guān)的CCN2轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，CCK-8測定細(xì)胞活力增強(qiáng)，Western blot結(jié)果顯示collagen I表達(dá)增多（<0.05）；與Ad.Null+H/R組相比，Ad.OGT+H/R組由于氧連糖基化水平的回升能夠顯著抑制H/R誘導(dǎo)的促增殖和促膠原合成作用（<0.05），見圖2。

Figure 2.Increase in O-GlcNAc level inhibited H/R-induced collagen isynthesis （A），CCN2 mRNA expression （B） and viability of MCFs （C）. Mean±SD. n=5. *P<0.05 vs Ad.Null+Ctrl group； #P<0.05 vs Ad.Null+H/R group.

3　提高氧連糖基化水平抑制H/R誘導(dǎo)的MCFs表型轉(zhuǎn)化

與Ad.Null+Ctrl組相比，標(biāo)志MCFs向MFBs轉(zhuǎn)化的特征表型ACTA2 mRNA及α-SMA蛋白表達(dá)在Ad.Null+H/R組均顯著升高（<0.05）。借助eGFP蛋白熒光觀察MCFs細(xì)胞形態(tài)，Ad.Null+Ctrl組MCFs多呈不規(guī)則三角形或長梭形，細(xì)胞輪廓清晰，胞核呈橢圓形，染色質(zhì)疏松著色淺；Ad.Null+H/R組MCFs胞體顯著增大呈扁平狀且缺乏極性，邊界不清，核仁大且胞質(zhì)細(xì)胞器代謝活躍。與Ad.Null+HIR組相比，Ad.OGT+H/R組ACTA2轉(zhuǎn)錄和α-SMA表達(dá)均受到抑制（<0.05），MCFs形態(tài)較基礎(chǔ)狀態(tài)變化不顯著，細(xì)胞面積半定量分析顯示與Ad.Null+H/R組有顯著差異（<0.05）。見圖3。

Figure 3.Increase in O-GlcNAc level inhibited H/R-induced phenotypic transformation of MCFs characterized by ACTA2/α-SMA expression （A and B） and morphological changes （C）. The scale bar=100 μm. Mean±SD. n=5. *P<0.05 vs Ad.Null+Ctrl group； #P<0.05 vs Ad.Null+H/R group.

4　提高氧連糖基化水平減輕H/R誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì)表達(dá)

與Ad.Null+Ctrl組相比，Ad.Null+H/R組炎癥細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高（<0.05）；而Ad.OGT+H/R組IL-1β和IL-18的mRNA和蛋白表達(dá)則顯著低于Ad.Null+H/R組（<0.05），見圖4A～C。

Figure 4.Increase in O-GlcNAc level inhibited H/R-induced inflammatory mediator （IL-1β and IL-18） expression （A，B and C） and Smad3 phosphorylation （D）. Mean±SD. n=5. *P<0.05 vs Ad.Null+Ctrl group； #P<0.05 vs Ad.Null+H/R group.

5　提高氧連糖基化水平阻礙Smad3磷酸化及核內(nèi)移

與Ad.Null+Ctrl組相比，Ad.Null+H/R組的TGF-β1信號軸關(guān)鍵信號分子Smad3磷酸化水平（p-Smad3/Smad3）顯著升高（<0.05），免疫熒光染色顯示Smad3核內(nèi)移顯著，提示TGF-β1/Smad3信號軸激活；與Ad.Null+H/R組相比，Ad.OGT+H/R組Smad3磷酸化水平（p-Smad3/Smad3）顯著降低（<0.05），免疫熒光染色顯示Smad3滯留于胞漿內(nèi)，核轉(zhuǎn)位受阻，見圖4D及圖5。

Figure 5.Increase in O-GlcNAc level inhibited H/R-induced Smad3 nuclear accumulation （observed by confocal fluorescence，scale bar=25 μm）. Infected MCFs were visualized by eGFP fluorescence （green），subcellular localization of Smad3 were stained with Smad3 antibody （red），and nuclei were stained with DAPI （blue）.

6　過表達(dá)OGT增強(qiáng)Smad3氧連糖基化修飾

與Ad.Null+H/R組相比，Ad.OGT+H/R組細(xì)胞內(nèi)與Smad3相結(jié)合的OGT顯著增多（<0.05），Smad3抗體免疫沉淀物氧連糖基化水平增強(qiáng)（<0.05）；采用-GlcNAc抗體反向免疫沉淀，Smad3條帶信號趨勢與前一致，見圖6。

Figure 6.Increasing OGT directly enhanced the O-GlcNAc level of Smad3. The binding degree with Smad3 and modified status of Smad3 were detected by co-immunoprecipitation. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs Ad.Null+H/R group.

討論

本項(xiàng)體外研究結(jié)果顯示，過表達(dá)OGT提高M(jìn)CFs整體氧連糖基化修飾水平，能夠阻礙Smad3磷酸化及后續(xù)核轉(zhuǎn)位，從而負(fù)性調(diào)控TGF-β1/Smad3信號軸，進(jìn)而減緩H/R損傷后MCFs的增殖分化、膠原分泌和炎癥介質(zhì)的表達(dá)。進(jìn)一步檢測顯示，過表達(dá)OGT使得與Smad3相結(jié)合的OGT顯著增多，Smad3氧連糖基化水平直接得到增強(qiáng)，且發(fā)生氧連糖基化修飾的Smad3能夠競爭性抑制其磷酸化并阻礙其入核發(fā)揮作用。我們的研究表明，除熟知的磷酸化修飾和泛素化修飾外，氧連糖基化修飾作為細(xì)胞內(nèi)另一種廣泛發(fā)生的翻譯后修飾（post-translational modifications，PTMs），是TGF-β1/Smad3信號軸的另一種快速而重要的調(diào)節(jié)形式。

MCFs是構(gòu)成心臟的主要細(xì)胞類型，雖體積小但數(shù)量占心臟細(xì)胞總數(shù)的60%～70%，在維系心臟的形態(tài)、功能以及損傷修復(fù)過程中均與心肌細(xì)胞聯(lián)系密切，是心肌重構(gòu)的重要執(zhí)行者［3］。以TGF-β1/Smad3為代表的經(jīng)典促纖維化信號軸在心肌梗死及再灌注治療后的炎癥反應(yīng)期、增殖修復(fù)期和基質(zhì)沉積期均發(fā)揮多重生物學(xué)效應(yīng)［4］，但過度活化引發(fā)的MCFs功能性紊亂也是導(dǎo)致心?；颊咭约把茉偻ㄖ委熀蟪霈F(xiàn)心肌順應(yīng)性下降、惡性心律失常甚至心衰的重要發(fā)病基礎(chǔ)。TGF-β1引發(fā)的信號內(nèi)傳是典型的激酶信號通路，研究證實(shí)該信號軸中多環(huán)節(jié)均受到磷酸化修飾調(diào)節(jié)，如Smad2/3可被激酶GSK3β、CDK［5-6］和磷酸酶PPM1A、MTMR4［7-8］等修飾調(diào)控。此外，Smad3的泛素化修飾-蛋白酶體降解調(diào)控也被廣泛報道［9-10］。然而Smad3能否被氧連糖基化修飾尚未見明確報道。

氧連糖基化修飾由OGT催化GlcNAc的供體二磷酸尿嘧啶GlcNAc（uridine diphosphate-acetylglucosamine，UDP-GlcNAc）以氧-糖苷鍵的形式共價結(jié)合到底物蛋白Ser/Thr側(cè)鏈羥基上，并由-乙酰氨基葡萄糖苷酶（-GlcNAcase，OGA）特異性水解氧-糖苷鍵從而降低底物氧連糖基化水平［11］。資料顯示，當(dāng)機(jī)體發(fā)生急性應(yīng)激損傷時可導(dǎo)致氧連糖基化水平的快速波動，是公認(rèn)的應(yīng)激壓力和細(xì)胞代謝感受器，而在應(yīng)激損傷階段迅速提高組織的氧連糖基化水平被證實(shí)具有組織保護(hù)作用，能夠增強(qiáng)抗損傷能力［12］。如葡萄糖胺通過提高腎組織氧連糖基化水平可緩解急性缺氧導(dǎo)致的腎功能障礙［13］；氧連糖基化修飾化學(xué)增強(qiáng)劑Thiamet-G可顯著減少大腦缺血再灌注損傷后的腦梗死面積，這與NF-κB p65亞基被氧連糖基化修飾后無法核內(nèi)移發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，減少組織中IL-1β和TNF-α的表達(dá)密切相關(guān)［14］；我們課題組前期研究也證實(shí)p65亞基發(fā)生氧連糖基化修飾能夠干擾其磷酸化激活［15］。在本項(xiàng)研究中，Smad3發(fā)生氧連糖基化修飾能夠競爭性抑制其磷酸化，從而無法形成功能異聚體近而阻礙其核內(nèi)移，但是否與氧連糖基化直接相關(guān)，還需要更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。以上結(jié)果表明，Smad3的氧連糖基化修飾與磷酸化修飾存在串?dāng)_（crosstalk）現(xiàn)象，進(jìn)一步深入研究有助于更好地理解Smad3的調(diào)節(jié)機(jī)制。

生化特征顯示，氧連糖基化修飾與磷酸化修飾的作用靶點(diǎn)均以Ser/Thr為主，因而存在大量底物蛋白上兩種PTMs發(fā)生串?dāng)_的證據(jù)，不僅在相同或相近位點(diǎn)存在競爭或協(xié)同修飾效應(yīng)，甚至在相距較遠(yuǎn)的氨基酸之間因空間構(gòu)象的接近仍會互相影響［16-18］。Smad3作為TGF-β1經(jīng)典信號軸中的關(guān)鍵胞內(nèi)蛋白，其C端SSXS基序內(nèi)Ser423/425被磷酸化是信號內(nèi)傳的重要標(biāo)志，并且其Thr179、Ser204/208/213甚至可以在不依賴胞外配體的情況下發(fā)生磷酸化修飾，在胚胎發(fā)育、腫瘤形成、組織纖維化等病理生理過程中發(fā)揮作用［19］。我們通過查詢糖基化修飾位點(diǎn)預(yù)測數(shù)據(jù)庫YinOYang 1.2［20］，顯示人類Smad3的Ser78/418/423發(fā)生氧連糖基化修飾的可能性超過80%，提示Ser423位點(diǎn)極有可能發(fā)生兩種PTMs的串?dāng)_，因而接下來我們將進(jìn)一步明確Smad3發(fā)生氧連糖基化修飾的具體位點(diǎn)及生物學(xué)效應(yīng)。

綜上所述，在本研究中我們首次獲得Smad3被氧連糖基化修飾的依據(jù)，證實(shí)快速提高氧連糖基化修飾水平對抑制MCFs增殖分化具有重要意義。由于采用免疫共沉淀除Smad3外還包含了與其相結(jié)合的其它蛋白，且尚未開發(fā)出直接檢測Smad3發(fā)生氧連糖基化修飾的抗體，我們后續(xù)將驗(yàn)證Smad3發(fā)生氧連糖基化修飾的可能位點(diǎn)，期望為更好地理解心肌梗死的病理生理機(jī)制提供參考資料。

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Effects of-GlcNAcylation of TGF-β1/Smad3 signaling axis on viability and differentiation of cultured mouse cardiac fibroblasts

Jin Hui1，Xie Zhong-jie2，Zhang Li-na1，Gong Kai-zheng1，Zhang Zhen-gang1，Li Ru-jun1△

（1，，225001，；2，，318020，）

To investigate the effect of-linked-acetylglucosamine （-GlcNAc） modification （-GlcNAcylation） of TGF-β1/Smad3 signaling axis on viability and differentiation of cultured mouse cardiac fibroblasts （MCFs） after hypoxia/reoxygenation （H/R）.Primarily cultured MCFs were incubated under hypoxic condition for 6 h and then exposed to normoxia for another 24 h to establish H/R cell model. Increased global-GlcNAcylation was achieved by infection with-GlcNAc transferase （OGT） adenovirus. The cells were randomly divided into null adenovirus preconditioning with normoxia （Ad.Null+Ctrl） and H/R （Ad.Null+H/R） groups，and OGT adenovirus preconditioning with normoxia （Ad.OGT+Ctrl） and H/R （Ad.OGT+H/R） groups. The mRNA levels of connective tissue growth factor （CTGF），α-smooth muscle actin （α-SMA），interleukin-1β （IL-1β） and IL-18 were detected by RT-qPCR. The protein levels of p-Smad3，Smad3，OGT，IL-1β and IL-18 were detected by Western blot.The-GlcNAcylation of Smad3 and interaction with OGT/Smad4 were detected by co-immunoprecipitation. The cell viability was measured by CCK-8 staining. Subcellular localization of Smad3 was revealed by confocal immunofluorescence.H/R caused a significant decrease in-GlcNAcylation of MCFs，while overexpression of OGT notably alleviated the reduction of-GlcNAcylation induced by H/R （<0.05）. Increased-GlcNAcylation inhibited the viability and differentiation of MCFs into myofibroblasts，and decreased the synthesis of collagen type I and the expression of IL-1β and IL-18 induced by H/R （<0.05）.-GlcNAcylation blocked the phosphorylation and nuclear accumulation of Smad3 which is the key component of TGF-β1 signaling axis.-GlcNAcylation inhibits the phosphorylation and nuclear translocation of Smad3，thus inhibiting TGF-β1/Smad3 signaling axis，and attenuates the functional changes of MCFs induced by H/R.

Myocardial ischemia-reperfusion injury； Myocardial fibrosis； Cardiac fibroblasts； TGF-β1/Smad3 signaling pathway；-GlcNAcylation

R542.2+2； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.02.005

1000-4718（2022）02-0222-08

2021-11-22

2022-01-26

［基金項(xiàng)目］江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No. BK20200937）；揚(yáng)州市科技計劃資助項(xiàng)目（No. YZ2019058）；揚(yáng)州市綠揚(yáng)金鳳計劃資助項(xiàng)目（No. YZLYJFJH2017YB118）

Tel： 0514-82981199； E-mail： li-rujun@126.com

（責(zé)任編輯：盧萍，羅森）