早期自發(fā)性高血壓大鼠末梢微循環(huán)功能障礙和形態(tài)異常研究*

王春曉 楊 銳 仉紅剛 李炳蔚 張秋菊

高血壓病是最常見的慢性病之一[1],部分高血壓患者并無明顯癥狀,但容易引發(fā)心腦腎等實質(zhì)性器官的損傷[2-4],如腦卒中、心肌梗死,嚴(yán)重時可導(dǎo)致死亡。持續(xù)的高血壓會導(dǎo)致血管的舒縮力下降與血管內(nèi)皮的損傷[3],進(jìn)而導(dǎo)致血管通透性增加及各種免疫粘附分子異常表達(dá),引起慢性血管內(nèi)皮炎癥[4]。當(dāng)損傷超過了血管內(nèi)皮自我修復(fù)能力時表現(xiàn)為血管功能受損。由于微血管的修復(fù)能力沒有大血管的修復(fù)能力強,所以微循環(huán)功能障礙往往出現(xiàn)較早，且越來越得到重視[5]。因此,如何早期發(fā)現(xiàn)微循環(huán)改變是控制高血壓發(fā)病亟待解決的重要問題。本文通過低周齡高血壓模型大鼠耳廓邊緣微循環(huán)檢測分析，探討早期高血壓微循環(huán)功能和形態(tài)變化特征。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組

8周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠(SHR組)和正常血壓WKY大鼠(對照組)各6只,體重180-200g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。實驗前進(jìn)行普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)，于12h明暗交替、溫度22-25℃、濕度40-60%環(huán)境中，自由飲水和進(jìn)食，2天后進(jìn)行實驗。

1.2 主要儀器與試劑

大鼠血壓測量儀(Softron BP-2010A，中國)；激光多普勒血流成像儀(LDI)購自英國Moor Instruments公司；高功率針式激光多普勒微循環(huán)檢測儀(moor VMS-LDF1 )購自Moor Instruments公司；激光微循環(huán)形態(tài)和功能分析儀CapiScope CAM1(Capillary Anemometer, KK Research Technology, Devon, 英國)；小動物氣體麻醉機ASA 1680(ASA，英國)；異氟烷(批號：045747，北京友誠生物科技有限公司)；醫(yī)用氧氣(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞資源中心)。

1.3 檢測指標(biāo)和方法

實驗大鼠持續(xù)吸入2%異氟烷與醫(yī)用氧氣的混合氣體，麻醉后仰臥固定于實驗操作臺，耳緣部位去毛后測量以下指標(biāo)。

1.3.1 血壓：采用Softron BP-2010A大鼠血壓測量儀測量血壓。前一晚大鼠禁食不禁水，第二天白天于22 ℃左右室溫條件下，將大鼠放置血壓儀保溫桶內(nèi)，暴露大鼠尾巴，采用尾套法將測量儀套至尾巴近端，待保溫箱溫度升溫并穩(wěn)定至38 ℃后，對大鼠進(jìn)行血壓測量。每只大鼠至少測量6次，取平均值。

1.3.2 血流灌注量：采用激光多普勒血流成像儀 LDI掃描大鼠耳廓，定量檢測大鼠耳廓末梢皮膚單位面積里面的微血管血流灌注情況。

1.3.3 平均血流速度和血細(xì)胞聚集度及小波轉(zhuǎn)換：以高功率針式激光多普勒微循環(huán)檢測儀moor VMS-LDF1采取單點多時長式監(jiān)測方法定量監(jiān)測大鼠耳廓斜上方部位的微血管血流速度及血細(xì)胞聚集度，獲取的正弦波式LDF信號經(jīng)moor VMS-PC Version 3.1分析軟件轉(zhuǎn)換為高斯函數(shù)Morlet小波。得到相應(yīng)指標(biāo)的數(shù)值后，使LDF信號轉(zhuǎn)換成五個不同生理來源的特征頻段。通過小波轉(zhuǎn)換后可將不同生理來源的特征頻段轉(zhuǎn)換為橫坐標(biāo)為頻率、縱坐標(biāo)為振幅值的二維和三維圖像。

1.3.4 微血管形態(tài)和功能性微毛細(xì)血管定量分析：將有血流通過的微毛細(xì)血管定義為功能性微毛細(xì)血管，以激光微循環(huán)形態(tài)和功能分析儀CapiScope CAM1取2個以上視野檢測大鼠耳廓皮膚微血管功能動態(tài)圖，每個視野測量面積為980.4μm×784.3μm。再通過數(shù)據(jù)分析軟件對實時動態(tài)圖像進(jìn)行分析獲取大鼠耳廓直徑范圍小于100μm的功能性微毛細(xì)血管的總長度、迂曲度和密度等指標(biāo)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠血壓比較

表1顯示SHR組收縮壓、舒張壓、平均動脈壓和脈壓差均較對照組升高(P<0.01)。

表1 兩組大鼠血壓值的比較

2.2 兩組大鼠耳廓觀察和微血流灌注量比較

明場圖片，對照組大鼠耳廓呈紅色，SHR大鼠耳廓相對較白(圖1A、1C)，LDI掃描成像對照組大鼠耳廓血流灌注充盈，而SHR大鼠耳廓呈缺血狀態(tài)(圖1B、1D)。定量分析SHR大鼠血流灌注量明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

注：A、B為對照組，C、D為SHR組，A和C為明場耳廓照片，B和D為激光掃描血流成像圖1 兩組大鼠耳廓微循環(huán)肉眼觀察和多普勒激光成像掃描圖

2.3 兩組大鼠耳緣微循環(huán)血流速度、血細(xì)胞聚集度比較

經(jīng)過小波分析得到的不同生理來源的特征頻段分別為頻率區(qū)間為2.0- 5.0Hz的Band 1心臟活動來源、頻率區(qū)間為0.4-2.0Hz的Band 2呼吸活動來源、頻率區(qū)間為0.15-0.4Hz的Band 3肌源性活動來源、頻率區(qū)間為0.05-0.15Hz的Band 4神經(jīng)活動來源及頻率區(qū)間為0.01-0.05Hz的Band 5內(nèi)皮細(xì)胞來源。

SHR組大鼠耳緣微循環(huán)平均血流速度顯著低于對照組(P<0.05)；平均血細(xì)胞聚集度與對照組比較無明顯差異(P>0.05)，小波分析，不同生理來源的耳緣末梢血流速度與對照組無明顯差異(P>0.05)，血細(xì)胞聚集度的Band 1、Band 2較對照組顯著增加(P<0.05)，而Band 3、Band 4、Band 5與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2、表2。

注：A、C為對照組，B、D為SHR組；A、B為血流速度小波分析圖，C、D為血細(xì)胞聚集度小波分析圖圖2 大鼠耳緣微血管血流速度與血細(xì)胞聚集度小波分析3D圖

表2 兩組大鼠平均血流速度、血細(xì)胞聚集度和功能性微毛細(xì)血管指標(biāo)比較

2.4 兩組大鼠耳緣微循環(huán)形態(tài)指標(biāo)比較

結(jié)果顯示，SHR組與對照組大鼠相比其耳廓有效微血管密度明顯稀疏(P<0.01)，微血管迂曲度也有降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

SHR組大鼠不同直徑微血管總長度均較對照組減少，尤其直徑30-50μm的微血管總長度減少顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、表2。

注：A為對照組、B為SHR組實時拍攝圖；C為微血管定量分析模式圖(視野尺寸：980.4μm×784.3μm)圖3 大鼠耳緣微血管密度分布分析

2.5 微循環(huán)指標(biāo)和血壓變化的相關(guān)性分析

圖4顯示，耳廓微循環(huán)的血流灌注、平均血流速度(包括Band 3、Band 5)與其血壓指標(biāo)值呈顯著或一定負(fù)相關(guān)，功能性微血管密度、直徑<50μm微血管總長度及微血管迂曲度與其血壓呈強或較強負(fù)相關(guān)，而Band 1、Band 2和Band 5血細(xì)胞聚集度與其血壓呈強或較強正相關(guān)(P<0.01或P<0.05)。這些微循環(huán)指標(biāo)間亦存在不同程度的相互關(guān)系。

圖4 Pearson相關(guān)分析圖

3 討 論

原發(fā)性高血壓發(fā)病原因復(fù)雜，一直是重要的研究熱點[1,6]。有研究[7, 8]報道原發(fā)性高血壓患者93%以上存在微循環(huán)障礙，其中近50%存在原發(fā)性微循環(huán)障礙，其他為繼發(fā)性和伴發(fā)性微循環(huán)障礙。雖然高血壓與微循環(huán)障礙的因果關(guān)系尚不明確，但是目前研究支持改善微循環(huán)能夠有效減少高血壓患者靶器官損害[9,10]。

本文結(jié)果顯示高血壓大鼠早期出現(xiàn)顯著的血壓升高外，末梢微循環(huán)血流灌注量、平均血流速度均顯著降低，小波分析顯示心臟活動來源及呼吸活動來源的血細(xì)胞聚集度亦顯著增加，提示該階段已經(jīng)存在外周微小血管的阻力增加。從微循環(huán)形態(tài)和功能檢測結(jié)果顯示，高血壓早期的末梢微循環(huán)功能性微血管密度顯著降低(P<0.01)，不同直徑功能性微毛細(xì)血管的總長度均減少，其中直徑30-50μm的顯著減少，均有力地說明高血壓早期的末梢微循環(huán)的微毛細(xì)血管的形態(tài)和功能均有明顯改變。

高血壓發(fā)病的早期末梢微循環(huán)形態(tài)和功能變化特征是什么？傳統(tǒng)的激光多普勒血流成像儀和針式檢測儀都是通過采集血流信號來反應(yīng)微血管血流量和微血流速度以及血細(xì)胞聚集度，但無法觀察和判斷功能性微毛細(xì)血管的改變。而激光微循環(huán)形態(tài)和功能分析儀可以直觀測量功能性微毛細(xì)血管的形態(tài)、分布和功能變化，本文采用上述三種方法相互補充，能夠有效地檢測和分析末梢微循環(huán)形態(tài)和功能。

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，SHR大鼠微血流灌注、平均血流速度、功能性微血管的密度直徑<50μm微血管總長度與其收縮壓、舒張壓、平均動脈壓和脈壓差的升高之間存在顯著負(fù)相關(guān)，而心源性和呼吸源性血細(xì)胞聚集度與其顯著正相關(guān)，結(jié)合本實驗室之前報道[11]的8周齡高血壓大鼠存在臟器微循環(huán)障礙，本文結(jié)果進(jìn)一步支持了末梢微循環(huán)功能障礙與早期高血壓發(fā)生發(fā)展的密切相關(guān)。

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