超高效液相色譜-質(zhì)譜法同時測定水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物、孔雀石綠及氯霉素殘留量的方法驗證

◎ 母昌立，王 蓓，遲志娟，王 姣，周益政，王淳純，劉培培

（1.江蘇省太倉市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心，江蘇 太倉 215412；2.北京六角體科技發(fā)展有限公司，北京 101102）

在《食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》（中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告 第250號）中明令禁止孔雀石綠、硝基呋喃類、氯霉素等3類6種藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用，在動物性食品中不得檢出。為此，國家相關(guān)部門出臺了相應的檢測標準[1-3]。除了國家標準檢測方法之外，針對3類6種藥物的殘留檢測，國內(nèi)外文獻也相繼報道了酶聯(lián)免疫吸附法[4]、色譜法[5]、質(zhì)譜法[6-9]。

綜合上述檢測標準及文獻報道，沒有3類6種藥物同時前處理進行檢測的報道，因此，本文驗證了北京六角體科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)的水產(chǎn)品中孔雀石綠、硝基呋喃類代謝物、氯霉素前處理試劑盒在本實驗室的適用性。此次驗證包括產(chǎn)品適用范圍、標準曲線、線性相關(guān)系數(shù)、檢測靈敏度、檢測精密度及方法回收率。

1 材料與方法

1.1 材料

本方法以鯽魚、河蝦和河蟹為試驗材料，驗證該產(chǎn)品是否滿足本實驗室的要求。

1.2 試劑與耗材

水產(chǎn)品中孔雀石綠、硝基呋喃類代謝物、氯霉素前處理試劑盒（包含檢測試劑A、檢測試劑B和固相萃取柱），北京六角體科技發(fā)展有限公司；呋喃唑酮代謝物（AOZ）、阜南他酮代謝物（AMOZ）、呋喃西林代謝物（AHD）和呋喃妥因代謝物（SEM）混合標準溶液、氯霉素（CAP）標準溶液、孔雀石綠（MG）和隱色孔雀石綠（LMG）混合標準溶液、氯霉素-D5標準溶液、AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3和SEM-13C15N2混合標準溶液、孔雀石綠-D5和隱色孔雀石綠-D5混合標準溶液、氯霉素-D5標準溶液，以上標準溶液濃度均為100 mg·L-1，天津阿爾塔科技有限公司；乙酸銨（色譜純）、甲醇（色譜純、乙腈（色譜純、正己烷（色譜純）和甲酸（色譜純），美國Fisher公司；GHP微孔濾器（0.22 μm），美國Waters公司；魚肉粉中孔雀石綠（含隱色孔雀石綠）質(zhì)控樣，大連中食國實檢測技術(shù)有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

5500型高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國AB公司；3-18K高速離心機：德國Sigma公司；渦旋振蕩器：德國IKA公司；恒溫水浴鍋（DK-600）：上海冉繪實業(yè)有限公司。

1.4 前處理方法

取絞碎的試料4.0 g置離心管中，加100 ng·mL-1的氯霉素 -D5標準工作液，AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3、SEM·HCl-(1，2-15N2，13C)混合標準工作液和孔雀石綠-D5和隱色孔雀石綠-D6混合標準工作液各100 μL，再加4.0 mL檢測試劑A，1.0 mL衍生化試劑，充分混勻后，65 ℃超聲提取20 min，其間搖勻2～3次。超聲后加入2.5 mL檢測試劑B，振蕩混勻，加入一管提取劑1、5.0 mL提取劑2，振蕩10 min，8 000 r·min-1離心5 min。

用5.0 mL提取劑2活化固相萃取柱，取3.0 mL上清液過活化后的固相萃取柱，并擠干柱體，用離心管接流出液，備用。用2.0 mL乙腈+0.5 mmol·L-1乙酸銨緩沖溶液（75+25，v/v）洗脫固相萃取柱，收集洗脫液，渦旋混勻后備用。

硝基呋喃類代謝物、氯霉素待測液：取1.0 mL洗脫液添加到流出液中，50 ℃下氮氣吹干，用1.0 mL水復溶，再用1.0 mL正己烷去除油脂，下層即為硝基呋喃類代謝物和氯霉素的待測液，經(jīng)0.22 μm濾膜，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定。

孔雀石綠待測液：剩余洗脫液即為孔雀石綠待測液，經(jīng)0.22 μm濾膜，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定。

1.5 檢測方法

1.5.1 硝基呋喃類代謝物檢測方法

硝基呋喃類代謝物的檢測參照母昌立等[9]的方法。

1.5.2 氯霉素檢測方法

色譜柱：C18，50 mm×2.1 mm，3 μm；流動相：水（A）+甲醇（B）=60+40；流速：0.5 mL·min-1；進樣量：5 μL；柱溫：40 ℃；離子源：電噴霧ESI，負離子；掃描方式：多反應監(jiān)測MRM；氣簾氣：206.84 kPa（30.0 psi）；霧化氣：344.73 kPa（50.0 psi）；輔助氣：344.73 kPa（50.0 psi）；離子源溫度：550 ℃。監(jiān)測離子對及對應質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.5.3 孔雀石綠檢測方法

色譜柱：C18，50 mm×2.1 mm，3 μm；流動相：乙腈 +5 mmol·L-1乙酸銨 =75+25；0.5 mL·min-1；進樣量：1 μL；柱溫：40 ℃；離子源：電噴霧ESI，正離子；掃描方式：多反應監(jiān)測MRM；氣簾氣：206.84 kPa（30.0 psi）；霧化氣：344.73 kPa（50.0 psi）；輔助氣：344.73 kPa（50.0 psi）；離子源溫度：550 ℃。監(jiān)測離子對及對應質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 氯霉素、孔雀石綠及其同位素標記物的主要質(zhì)譜參數(shù)表

1.6 標準曲線的制作

1.6.1 硝基呋喃類代謝物標準曲線制作

精密量取適量的AOZ、AMOZ、AHD、SEM混合標準工作液，置于不同離心管中。按1.4處理，制得0.2 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、4.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和 20.0 ng·mL-1系列濃度，利用1.5.1方法進行測定，每個濃度測定2次。

1.6.2 氯霉素和孔雀石綠標準曲線制作

分別精密量取適量的100 ng·mL-1的氯霉素和孔雀石綠標準工作液于10 mL容量瓶中，加入100 ng·mL-1的對應同位素內(nèi)標標準工作液250 μL，用流動相定容，制得 0.2 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、4.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和 20.0 ng·mL-1系列濃度，利用1.5.2和1.5.3進行測定，每個濃度測定2次。

1.7 靈敏度的驗證

在對應標準中，硝基呋喃類代謝物在動物源食品中的檢測限為 0.25 ng·g-1，定量限為 0.50 ng·g-1[1]，氯霉素在動物源食品中的檢測限為0.1 ng·g-1，定量限為0.2 ng·g-1[3]，孔雀石綠和隱色孔雀石綠動物源食品中的檢測限為0.5 ng·g-1[2]。在每種樣品中加入適量的目標化合物標準溶液，使各化合物在樣品中的濃度分別為檢測限和定量限，重復10次，按照1.4進行前處理，1.5進行檢測。若濃度為檢測限時，信噪比≥3，則檢測限滿足要求；若濃度為定量限時，信噪比≥10，則定量限滿足要求[10]。

1.8 精密度的驗證

《食品動物中禁止使用的藥品及其他化合物清單》（中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告 第250號）規(guī)定，硝基呋喃類代謝物、氯霉素和孔雀石綠均為禁用藥物，在動物性食品中均不得檢出。因此，在添加濃度為檢測限、2倍檢測限和10倍檢測限3個濃度[11]，每種樣品每個濃度重復10次，計算相對標準偏差。

1.9 回收率的驗證

在每種樣品中加入適量的待測物混合標準溶液，使其在樣品中的濃度分別為檢測限、2倍檢測限和10倍檢測限濃度，每種樣品每個濃度重復10次，按照1.4進行前處理，1.5進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線

以目標物的濃度為橫坐標，對應濃度目標物峰面積與相應同位素內(nèi)標峰面積比值為縱坐標，得到各目標物的標準曲線線性方程及相關(guān)系數(shù)（見表2）。由表2看出，各待測物線性方程的相關(guān)系數(shù)均大于0.99，相關(guān)性良好，可用于準確定量[11]。

表2 AOZ、AMOZ、AHD、SEM、CAP、MG和LMG的線性方程及相關(guān)系數(shù)表

2.2 靈敏度

在每種樣品中加入適量的待測物混合標準溶液，使其在樣品中的濃度分別為檢測限和定量限濃度，重復10次。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，當待測物濃度為檢測限濃度時，信噪比均＞3；待測物濃度為定量限濃度時，信噪比均＞10。由此可見，本產(chǎn)品的方法檢測限和定量限均滿足實驗室的要求。

2.3 精密度和回收率

每種樣品在檢測限、2倍檢測限和10倍檢測限3個濃度進行檢測，重復10次，檢測后得到表3所示結(jié)果。由表3可以看出，6種化合物在鯽魚、河蝦和河蟹中添加回收率均在60%～120%，相對標準偏差＜30%，滿足各對應檢測標準的要求。

表3 AOZ、AMOZ、AHD、SEM、CAP、MG和LMG在鯽魚、河蝦和河蟹的精密度和添加回收率表

2.4 質(zhì)控樣測定

利用1.4的前處理方法處理魚肉粉中孔雀石綠（含隱色孔雀石綠）質(zhì)控樣，利用1.5.3的檢測方法進行檢測，檢測結(jié)果與質(zhì)控樣證書相符。

3 結(jié)論

經(jīng)過驗證，北京六角體科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)的水產(chǎn)品中孔雀石綠、硝基呋喃類代謝物、氯霉素前處理試劑盒的適用范圍、標準曲線、線性相關(guān)系數(shù)、檢測靈敏度、檢測精密度及方法回收率均滿足要求。本實驗室利用此產(chǎn)品對購自大連中食國實檢測技術(shù)有限公司的魚肉粉中孔雀石綠（含隱色孔雀石綠）質(zhì)控樣進行測定，檢測結(jié)果滿意。