原子熒光法測定生活飲用水中硒的方法驗證

◎ 李木子

（安徽磬鄉(xiāng)水務(wù)有限公司，安徽 宿州 234200）

在檢驗檢測機構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定過程中，實驗室申報檢驗檢測能力所選擇的方法是技術(shù)審核關(guān)鍵要素之一。檢驗檢測機構(gòu)應(yīng)建立和保持檢測方法控制程序，使用標(biāo)準(zhǔn)方法前應(yīng)開展方法驗證，使用非標(biāo)準(zhǔn)方法前應(yīng)開展方法確認(rèn)，以證實能夠滿足檢驗檢測方法的各項參數(shù)性能要求[1]。方法驗證或確認(rèn)是實驗室建立可靠分析系統(tǒng)的基礎(chǔ)，也是化學(xué)分析的必要程序。第三方檢驗檢測機構(gòu)類的實驗室普遍采用標(biāo)準(zhǔn)方法，如國際、區(qū)域或國家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布的方法、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和經(jīng)確認(rèn)溯源至國家計量標(biāo)準(zhǔn)且符合方法性能指標(biāo)的科技書籍、期刊、制造商提供的方法。因此，對標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行方法驗證是實驗室應(yīng)關(guān)注的工作重點。

方法驗證是一項人員參與范圍廣、工作任務(wù)量大、技術(shù)要求高的質(zhì)量控制活動。實驗室應(yīng)統(tǒng)籌部署、科學(xué)分工、提高驗證效率和結(jié)果滿意度?？梢罁?jù)實驗室的程序文件和作業(yè)指導(dǎo)書等體系文件的技術(shù)指導(dǎo)流程，由技術(shù)負(fù)責(zé)人組織檢測人員進(jìn)行檢測方法選用、驗證試驗開展、方法驗證報告編寫等實驗活動；質(zhì)量負(fù)責(zé)人組織審核人員對方法驗證活動全過程進(jìn)行監(jiān)督審核。具體來說，實驗室應(yīng)對檢驗檢測能力中所涉及到的產(chǎn)品、項目、參數(shù)逐一進(jìn)行驗證，但方法驗證內(nèi)容及其結(jié)果輸出的多少應(yīng)結(jié)合經(jīng)濟成本和技術(shù)水平綜合研判，驗證內(nèi)容可以包含（但不限于）分析系統(tǒng)適應(yīng)性、空白試驗、準(zhǔn)確度（正確度和精密度）、檢出限和測定下限、線性及校準(zhǔn)、測量不確定度等[2]。驗證內(nèi)容的評價應(yīng)參照標(biāo)準(zhǔn)方法，以符合標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定值或范圍的要求為宜，標(biāo)準(zhǔn)方法中有未涉及時，應(yīng)參照其他標(biāo)準(zhǔn)評價要求。筆者著重闡明利用氫化物原子熒光法測定生活飲用水中硒方法性能的驗證，以期幫助同行加深對方法驗證的理解。

1 材料與方法

1.1 方法依據(jù)

《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法 金屬指標(biāo)》（GB/T 5750.6—2006）氫化物原子熒光法測定生活飲用水及水源水中的硒[3]。

1.2 實驗原理

在鹽酸介質(zhì)中以硼氫化鈉（NaBH4）作為還原劑，將硒還原成硒化氫（SeH4），由載氣（Ar2）帶入原子化器中進(jìn)行原子化，在硒特種空心陰極燈照射下，基態(tài)硒原子被激發(fā)至高能態(tài)，在去活化回到基態(tài)時，發(fā)射出特征波長的熒光，在一定濃度范圍內(nèi)其熒光強度與硒含量成正比，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量。

1.3 儀器和試劑

AFS-933原子熒光分光光度計（北京吉天儀器有限公司）；IKAC-MAG HP10電熱板（德國艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司）；硝酸（ρ=1.42 g·mL-1，優(yōu)級純）；高氯酸（ρ=1.68 g·mL-1，優(yōu)級純）；鹽酸（ρ=1.19 g·mL-1，優(yōu)級純）；氫氧化鈉（優(yōu)級純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；硼氫化鈉（優(yōu)級純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；鐵氰化鉀（優(yōu)級純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；硒標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 mg·L-1，批號：B2103428，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司）；超純水（電導(dǎo)率0.055 μs·cm-1，25 ℃）。

1.4 操作步驟

1.4.1 樣品預(yù)處理

向25 mL水樣中加入2.5 ml硝酸-高氯酸等體積混合液，在電熱板上加熱消解。當(dāng)溶液冒白煙時，取下冷卻。再加入2.5 mL鹽酸溶液（1+1），繼續(xù)加熱至溶液冒白煙時，將6價硒還原成4價硒。取下冷卻，用純水轉(zhuǎn)移至比色管中，用純水定容至10 mL，同時做空白試驗。

1.4.2 測定條件

負(fù)高壓：270 V；燈電流80 mA；爐高8.5 mm；載氣流量 400 mL·min-1；屏蔽氣流量 800 mL·min-1；測量方式：標(biāo)準(zhǔn)曲線法；讀數(shù)方式：峰面積；延遲時間1.5 s；讀數(shù)時間7 s；進(jìn)樣體積0.5 mL；載流：鹽酸溶液（5+95）；還原劑：硼氫化鈉的氫氧化鈉溶液（稱取10.0 g硼氫化鈉溶于2 g·L-1的氫氧化鈉溶液500 mL）。

開機，設(shè)置儀器最佳條件，點燃原子化器爐絲，穩(wěn)定30 min后開始測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程Y=aX+b。根據(jù)所測樣品的熒光強度從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查樣品消解溶液中硒元素的質(zhì)量濃度。

1.4.3 計算

樣品中硒的質(zhì)量濃度計算公式，見式（1）：

式中：ρ（Se）為樣品中硒的質(zhì)量濃度，mg·L-1；ρ為樣品消解液測定濃度，μg·L-1。

2 驗證內(nèi)容與分析

2.1 人員驗證

2.1.1 人員信息

檢測人員經(jīng)培訓(xùn)合格取得技術(shù)人員上崗證后，方可在授權(quán)范圍內(nèi)開展實驗活動。因此需對實驗室檢測人員基本信息和擅長技能領(lǐng)域進(jìn)行驗證，如畢業(yè)院校、專業(yè)、從業(yè)年限、使用設(shè)備時長、培訓(xùn)情況等，并建立動態(tài)技術(shù)檔案。

2.1.2 人員監(jiān)督

實驗室不僅需要保證人員持證上崗，還應(yīng)定期對檢測人員進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)督，確保檢測人員能力保持在較高水平。監(jiān)督內(nèi)容應(yīng)涉及到正確性和熟練地使用設(shè)備、樣品的選擇和制備、方法選擇的正確和檢測效率等。人員監(jiān)督過程中如出現(xiàn)不符合項，應(yīng)及時采取預(yù)防措施，并在改正前限制其參與重要檢測活動。

2.2 設(shè)備驗證

對設(shè)備的檔案信息、狀態(tài)、技術(shù)參數(shù)、檢定/校準(zhǔn)等方面進(jìn)行驗證，驗證結(jié)果見表1。

表1 儀器設(shè)備驗證結(jié)果表

2.3 物料

按照《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法 水樣采集與保存》（GB/T 5750.2—2006）[4]的要求，水樣存放于聚乙烯瓶中并且硝酸酸化至pH≤2，需在保質(zhì)期14 d內(nèi)檢測完畢。

2.4 環(huán)境

實驗室配備有空調(diào)系統(tǒng)，于8:00和15:00進(jìn)行溫濕度的監(jiān)測記錄，結(jié)果表明，實驗室可以達(dá)到溫度（20±3）℃、相對濕度（65±5）%的環(huán)境水平。

2.5 方法性能

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

綜合考慮實驗成本及實際樣品濃度，確定標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0～10.0 μg·L-1。用分度吸量管移取1 mL硒標(biāo)準(zhǔn)溶液于100 mL容量瓶中，混勻后定容至刻度線，制成硒中間稀釋液。從硒中間稀釋液中移取1 mL于100 mL容量瓶中，混勻后定容至刻度線，制成硒標(biāo)準(zhǔn)使用液備用。分別移取上述硒標(biāo)準(zhǔn)使用液0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL 和1.0 mL于10 mL比色管中，標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液中分別加入1 mL鹽酸（ρ=1.19 g·mL-1），1 mL鐵氰化鉀溶液（100 g·L-1），混勻后用純水定容至刻度線，使硒的質(zhì)量濃度分別為 0 μg·L-1、1.0 μg·L-1、2.0 μg·L-1、4.0 μg·L-1、6.0 μg·L-1、8.0 μg·L-1和 10.0 μg·L-1。 硒 元素標(biāo)準(zhǔn)曲線測定數(shù)據(jù)見表2。

表2 硒元素標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果表

依據(jù)《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法 水質(zhì)分析質(zhì)量控制》（GB/T 5750.3—2006）要求[5]，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)一般≥0.999，本次制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.999 6，滿足其要求。

2.5.2 檢出限及測定下限

方法檢出限是使用特定分析方法可從待測樣品中判定目標(biāo)物質(zhì)存在的最小濃度或最小量，具有定性的作用，故僅研究方法檢出限，對儀器檢出限不做討論。方法檢出限的計算和評價方式多樣，本文采用全程序空白測試結(jié)果來估算方法檢出限，對空白溶液進(jìn)行20次測量并根據(jù)公式（2）進(jìn)行結(jié)果分析。

式中：MDL為方法檢出限；σwb為空白平行測定（批內(nèi)）標(biāo)準(zhǔn)偏差（測定次數(shù)≥20）。

本文采納《環(huán)境監(jiān)測分析方法標(biāo)準(zhǔn)制訂技術(shù)導(dǎo)則》（HJ 168—2020）中關(guān)于測定下限的規(guī)定[6]，即一般4倍的方法檢出限表示為測定下限，檢出限及測定下限結(jié)果見表3。

表3 硒元素的熒光值及濃度結(jié)果表

由表3可知，硒元素的濃度平均值為0.091 7 μg·L-1，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.012 9，硒元素的方法檢出限為0.059 0 μg·L-1，測定下限為 0.236 0 μg·L-1。為方便數(shù)據(jù)計算使用，測定下限的最終結(jié)果取0.3 μg·L-1，標(biāo)準(zhǔn)方法中介紹氫化物原子熒光法中硒的最低檢測質(zhì)量濃度為0.4 μg·L-1，測試結(jié)果滿足方法要求。

2.5.3 精密度

精密度表征在獨立測試結(jié)果間的一致程度，通常用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD表示。用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制低、中、高3個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為樣品，按照標(biāo)準(zhǔn)方法全程序平行測定8次，測定數(shù)據(jù)及結(jié)果見表4。

表4 精密度測試結(jié)果表（單位：μg·L-1）

由表4可知，低、中、高濃度梯度測試樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.520%、1.430%、1.690%，滿足《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法 金屬指標(biāo)》（GB/T 5750.6—2006）中相對標(biāo)準(zhǔn)偏差＜5.0%要求。此外，低濃度測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差偏大，中濃度、高濃度測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較小，因此日常檢測時應(yīng)適當(dāng)增加低濃度樣品的測定次數(shù)，以減少偶然誤差，并且使待測樣品的濃度盡可能落在標(biāo)準(zhǔn)曲線測定范圍的中上段。

2.5.4 正確度

正確度是指無窮多次重復(fù)性測定結(jié)果的平均值與參考值之間的接近程度，通常用偏倚表示，而測量結(jié)果的偏倚用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加標(biāo)測定樣品回收率進(jìn)行評估，用以排除可能存在的系統(tǒng)誤差。取3份25 mL相同水樣，分別移取濃度為10 μg·L-1的加標(biāo)液體積0.1 mL、0.4 mL、0.6 mL加入上述水樣，按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行消解預(yù)處理。經(jīng)測定，水樣消解液質(zhì)量濃度為0.352 μg·L-1。按照式（3）對加標(biāo)回收率進(jìn)行計算：

式中：P為加標(biāo)回收率；μa為加標(biāo)水樣消解液測定值；μb為水樣消解液測定值；m為加入標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)量。結(jié)果見表5。

由表5可以看出低、中、高濃度梯度加標(biāo)回收率分別為90%、104%、106%，均在《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法 金屬指標(biāo)》（GB/T 5750.6—2006）中加標(biāo)回收率85.0%～116.0%范圍內(nèi)。

表5 低、中、高濃度加標(biāo)回收測試結(jié)果表

另外《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法 水質(zhì)分析與控制》（GB/T 5750.3—2006）介紹了對標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行分析，比較測定值與保證值的相對誤差來評價正確度的方法。實驗使用壇墨質(zhì)檢生產(chǎn)的水中硒標(biāo)準(zhǔn)樣品[編號為BY400018， 標(biāo) 準(zhǔn) 值 為 8.07 μg·L-1， 擴 展 不 確 定 度（k=2）：0.58 μg·L-1]，按照作業(yè)指導(dǎo)書稀釋 25倍后再平行測定 6 次，結(jié)果分別為：7.92 μg·L-1、8.47 μg·L-1、8.62 μg·L-1、8.31 μg·L-1、8.25 μg·L-1和 8.29 μg·L-1，平均值為8.31 μg·L-1，相對誤差為2.97%。結(jié)果滿足《水和廢水監(jiān)測分析方法》（第四版）質(zhì)量控制指標(biāo)中關(guān)于熒光光度法測定硒的實驗室內(nèi)相對誤差≤±15%的要求[7]。

3 結(jié)論

依據(jù)《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法 金屬指標(biāo)》（GB/T 5750.6—2006）介紹的氫化物原子熒光法進(jìn)行了毒理指標(biāo)硒的方法驗證，證實了實驗室在人員、設(shè)備、物料、環(huán)境、方法性能等方面均滿足檢測要求，通過分析方法性能實驗數(shù)據(jù)可知：標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為 0.999 6；方法檢出限為 0.059 0 μg·L-1，測定下限為0.3 μg·L-1；低、中、高濃度梯度樣品的精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.520%、1.430%、1.690%；低、中、高濃度梯度加標(biāo)量的加標(biāo)回收率分別為90%、104%、106%；標(biāo)準(zhǔn)樣品測試的相對誤差為2.97%。綜上，實驗室具備開展生活飲用水中硒的檢測能力。