血清熱休克蛋白70自身抗體在乳腺癌中的診斷價值*

梁超文 練 標 張銀仙 謝長樂

廣東省開平市中心醫(yī)院腫瘤外科 529300

近年來，全球乳腺癌發(fā)病率呈上升趨勢，是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤[1]。另一方面，在西方國家的乳腺癌患者中，近年來出現了死亡率下降的情況，這主要是由于對于此類疾病的早期篩查與診斷得到了普及與技術上的發(fā)展[2]。所以對于乳腺癌的早期篩查與防治是十分必要的，同時這樣的措施也是有效提升乳腺癌患者生存率，提升患者保乳手術治療可能性的關鍵所在。目前用于乳腺癌的檢查方法，如乳房X光檢查和超聲等，用于早期乳腺癌篩查并不十分理想[2-4]。有研究數據指出，在早期腫瘤疾病的篩查過程中，對于患者的腫瘤相關抗原抗體進行篩查能夠在一定程度上基于血清分子標志物情況對于患者實際情況進行了解。基于此，本次研究特運用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清Hsp70自身抗體在125例乳腺癌患者、33例乳腺良性腫瘤患者和127例健康體檢者中的水平，探討熱休克蛋白70(Hsp70)自身抗體在乳腺癌患者中的診斷意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集我院2019年4月—2021年3月125例乳腺癌和33例乳腺良性腫瘤患者血清標本。本次研究中所有患者均未開展相應的治療，且通過病理切片檢查確診為乳腺腫瘤患者，乳腺癌及乳腺良性腫瘤組患者均為女性，年齡40～72歲，平均年齡(51.2±14.2)歲；健康對照組患者均為女性，年齡40～72歲，平均年齡(51.3±14.1)歲；三組患者基線資料比較基本無差異(P>0.05)，同時患者對于本次研究知情且簽署同意書，研究經我院倫理委員會表決通過?；颊呔∑涑科鹜庵莒o脈血3ml進行血清制取，并低溫保存。

1.2 儀器和檢測試劑 酶標儀采用賽默飛世爾THERMO Multiskan FC，96孔酶標板采用海門浩天生物有限公司出產，相關試劑均采購自舟山同生生物科技公司與廈門英科新創(chuàng)公司。

1.3 Hsp70自身抗體的檢測 對于患者血清中的Hsp70自身抗體采用酶聯免疫吸附法進行檢測，于96孔酶標板將Hsp70重組蛋白(PBS稀釋0.8μg/ml)進行包被，保持溫度4℃過夜，次日將酶標板孔內液體棄去，采用PBST對于96孔酶標板進行洗板，次數為3次，隨后每孔加入200μl封閉液，封閉液主要成分為1%牛血清蛋白與PBST，37℃孵育1h；洗板，加入100μl 1∶110稀釋的乳腺癌患者、乳腺良性腫瘤患者、健康對照者血清樣品和質控樣品(將50例乳腺癌患者的血清混合制成)，陰性對照為封閉液，陽性對照為兔抗p53多克隆抗體，所有檢測均做兩平行孔，37℃溫箱孵育1h；洗板，加入羊抗人或羊抗兔IgG-HRP(1∶10 000稀釋)，孵育1h(37℃)；洗板5次，每孔加入顯色液100μl(TMB-過氧化氫)，37℃避光顯色15min；加入終止液50μl，酶標儀檢測各樣品的A值(即A450nm-A630nm)，即測定波長為450nm、校正波長為630nm。

1.4 統(tǒng)計學方法 本次研究中采用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件進行數據分析，并采用GraphPad Prism進行ROC數據的繪制，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 血清Hsp70自身抗在乳腺癌患者中的水平 血清Hsp70自身抗體在乳腺癌組、乳腺良性腫瘤組和健康對照組中的OD值分別為0.110±0.078、0.077±0.048和0.061±0.037。乳腺癌組和乳腺良性腫瘤組血清Hsp70自身抗體水平高于健康對照組的水平，差異有統(tǒng)計學意義(Z=-7.165，P<0.001；Z=-2.065，P=0.039)；更重要的是，與乳腺良性腫瘤組相比較，乳腺癌組血清Hsp70自身抗體的水平同樣顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(Z=-3.084，P=0.002)，見圖1。

圖1 血清Hsp70自身抗體的水平箱線圖

2.2 血清Hsp70自身抗體在乳腺癌中的診斷效能 根據ROC曲線分析(圖2)和約登指數，當檢測乳腺癌患者血清Hsp70自身抗體的cutoff值為0.060時，區(qū)分健康體檢者的AUC值為0.761(95%置信區(qū)間：0.702～0.820)，敏感度為82.4%，特異度為62.2%；區(qū)分乳腺良性腫瘤患者的AUC值為0.675(95%置信區(qū)間：0.569～0.781)，敏感度為80.0%，特異度為45.5%；區(qū)分乳腺良性腫瘤患者與健康體檢者的AUC值為0.746(95%置信區(qū)間：0.690～0.802)，敏感度為84.8%，特異度為56.6%。

圖2 Hsp70自身抗體區(qū)分乳腺癌與不同對照組的ROC曲線

3 討論

目前，臨床上常用的乳腺癌相關血清腫瘤標志物癌胚抗原和CAl53等，對于監(jiān)測復發(fā)轉移和療效評估具有很好的價值，然而，在早期乳腺癌患者，這些標志物的診斷敏感度低，只有在晚期乳腺癌才具有較高的敏感性。近年來大量研究表明，相對于正常人，在腫瘤的早期階段，患者血清中針對腫瘤相關抗原的自身抗體水平就顯著升高[5-8]，提示自身抗體在惡性腫瘤早期診斷具有潛在應用價值。更重要的是，EarlyCDT-lung是一項聯合檢測7種自身抗體標志物的血液檢查，已經在臨床上證實有助于早期發(fā)現無癥狀的肺癌患者，而且EarlyCDT-lung的關鍵優(yōu)勢在于能夠比“CT(標準診斷影像學檢查)”更早地幫助鑒定肺癌風險，具有更高特異性[8]。在乳腺癌方面，研究已表明在乳腺癌患者診斷5年前的無癥狀階段自身抗體就呈現陽性結果[9]。有國外研究發(fā)現，與正常對照者相比，ZRF自身抗體和KRR1自身抗體在早期乳腺癌患者血清中的水平均顯著升高[8]。這些研究提示，腫瘤自身抗體在乳腺癌患者血清中是存在的，有潛力作為一種有效的乳腺癌早期診斷方法。

熱休克蛋白(Heat shock proteins，HSPs)是一組廣泛存在于生物體內、高度保守的應激蛋白。作為分子伴侶，在細胞內主要參與蛋白質跨膜轉運、裝配分選解等過程，并且在創(chuàng)傷、感染和惡性腫瘤等應激狀態(tài)下被誘導表達[9]。Hsp70作為熱休克蛋白家族的一員，已被證實在多種腫瘤中高表達，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、預后和腫瘤免疫等發(fā)揮重要作用[10-11]。研究表明，針對腫瘤相關抗原的自身抗體的產生和腫瘤相關抗原本身的突變和過表達等密切相關[12]。崔曉梅等[13]的研究表明，Hsp70在乳腺癌組織細胞中高表達。Yang等學者[14]的研究證實了Hsp70自身抗體在乳腺癌患者的水平高于健康對照者，而且聯合包括Hsp70自身抗體在內的5種自身抗體組合，對乳腺癌的診斷敏感度和特異度達到了82.7%和100.0%。在本研究中，相對于健康體檢者與乳腺良性腫瘤患者，血清Hsp70自身抗體在乳腺癌患者中的水平顯著升高，表明Hsp70自身抗體可以區(qū)分乳腺癌患者和健康者，更重要的是，Hsp70自身抗體有助于區(qū)分乳腺良惡性腫瘤。另一方面，本研究結果表明，Hsp70自身抗體對于乳腺癌具有較好的敏感度(80%以上)，有利于將Hsp70自身抗體作為一種乳腺癌的篩查工具以幫助發(fā)現更多無癥狀乳腺癌患者，然而，其特異度相對較差，診斷鑒定乳腺癌患者仍需借助影像學技術和病理檢查。

綜上所述，Hsp70自身抗體與乳腺癌患者存在相關性，可以幫助區(qū)分乳腺良惡性腫瘤，是篩查乳腺癌一種潛在的血清分子標志物。但本研究的樣本量較小，而且未能統(tǒng)計分析納入本研究的乳腺癌患者臨床病理資料，因此，未來仍需要通過大樣本的早期乳腺癌患者對Hsp70自身抗體進行診斷效能驗證。