五味子醇甲對腦缺血再灌注損傷大鼠室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的影響

楊繼蘋，臧 瑞，李 正，楊利強，徐偉杰，武煜明，鄧儀昊

缺血性腦卒中是我國發(fā)病率、致殘率、死亡率相對較高的一種疾病，中醫(yī)將其歸為“中風(fēng)”“偏枯”等范疇。中風(fēng)，有內(nèi)風(fēng)和外風(fēng)之別。外風(fēng)多因感受“六淫”之首的風(fēng)邪所致，風(fēng)性善行數(shù)變，易襲陽位，能使皮膚腠理開泄。故而出現(xiàn)惡風(fēng)、汗出、頭痛、皮膚瘙癢等癥狀。臨床中風(fēng)病人多屬于內(nèi)風(fēng)，系由內(nèi)傷病證所致，又稱腦卒中。針對腦缺血，西醫(yī)治療在超早期(即起病在3～6 h內(nèi))主要是溶栓、應(yīng)用抗凝劑，后期主要采取功能康復(fù)鍛煉等治療，但大部分病人治療后神經(jīng)功能恢復(fù)收效頗微，嚴(yán)重殘疾者可達40%以上[1-3]。通過數(shù)年的臨床及基礎(chǔ)研究，雖然對缺血性腦卒中的發(fā)生機制有了進一步了解，但真正用于治療的神經(jīng)保護藥物卻很少。目前主要溶栓藥物為組織型纖溶酶原激活劑(tPA)，但其應(yīng)用時間窗短，因此，約50%以上的病人治療后仍有神經(jīng)功能障礙等后遺癥，嚴(yán)重影響病人及家屬生活質(zhì)量，加重家庭、社會經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。

五味子醇甲是五味子木脂素中藥理活性作用較強的有效成分，研究發(fā)現(xiàn)五味子對中樞神經(jīng)系統(tǒng)影響廣泛，其能通過抑制細(xì)胞色素介導(dǎo)作用、調(diào)節(jié)氨基丁酸水平等，從而發(fā)揮較好的鎮(zhèn)靜、催眠、改善抑郁及治療腦卒中、帕金森病作用，通過調(diào)控Janus激酶2(JAK2)/信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(STAT3)信號通路抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)損傷[4-6]?，F(xiàn)有研究表明，地黃飲子血中的移行成分主要來源于五味子，因此，五味子被認(rèn)為是地黃飲子入血后成分的主要來源藥材[7]。給家兔灌喂地黃飲子湯劑后，通過腦脊液檢測分析，追溯其來源后發(fā)現(xiàn)了五味子醇甲，其是地黃飲子中唯一存在于腦脊液中的有效成分[8-11]。前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，五味子醇甲既能夠促進體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化，又能誘導(dǎo)缺血半影區(qū)神經(jīng)元自噬，促進大腦中動脈阻塞(MCAO)大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)、腦梗死面積的減少，從而發(fā)揮腦保護作用[12-13]。但五味子醇甲能否促進腦缺血再灌注損傷大鼠室管膜下區(qū)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖的機制尚缺乏系統(tǒng)研究。本研究探討五味子醇甲促進腦缺血再灌注損傷大鼠室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的潛在機制，為進一步探討五味子醇甲促進神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的分子機制奠定動物實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級、體質(zhì)量250～280 g的SD雄性大鼠90只，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，于室溫18～26 ℃正常喂養(yǎng)。

1.2 藥品與試劑 五味子醇甲購自Selleck生物科技公司，使用前用二甲基亞砜(DMSO)將其稀釋至所需濃度備用。辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔、β-肌動蛋白(β-actin)、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)等均購自于Abcam公司；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)試劑購自北京索萊寶公司。

1.3 實驗儀器 熒光顯微鏡購自日本尼康公司，腦立體定位儀、微量注射泵購于上海玉研科學(xué)儀器有限公司，冰凍離心機購自萊卡。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組 90只SD雄性大鼠隨機選30只通過TTC染色測量腦梗死面積并進行神經(jīng)功能缺損評分，30只用于蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測，30只大鼠用于免疫熒光檢測。隨機分為5組：假手術(shù)組、MCAO組、五味子醇甲低劑量組[40 μg/(kg·d)]、五味子醇甲中劑量組[80 μg/(kg·d)]、五味子醇甲高劑量組[160 μg/(kg·d)]。

1.4.2 造模 參照Zea Longa法用MCAO線栓法制作大腦中動脈栓塞模型[14]。方法如下：SD 大鼠腹腔注射10%水合氯醛(360 mg/kg)進行深度麻醉，鈍性分離肌肉及周圍組織，暴露分離左側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，經(jīng)頸外動脈的小切口插入MCAO栓線，距離血管分叉處(18±2)mm進入左大腦中動脈進行閉塞，并于頸外動脈遠(yuǎn)端結(jié)扎該動脈，固定線栓。MCAO組及給藥組大鼠于術(shù)后90 min取出栓線以實現(xiàn)再灌注。

1.4.3 給藥方法 用10%水合氯醛(360 mg/kg)將大鼠深度麻醉后取俯臥位，用腦立體定位儀固定，確定給藥管的下管位置(前囟后約0.9 mm，距中線旁約1.4 mm，距硬腦膜深約4.0 mm)。牙科鉆開孔，固定給藥套管。五味子醇甲低劑量組、五味子醇甲中劑量組、五味子醇甲高劑量組SD大鼠左側(cè)腦室用微量進樣器通過給藥管給予五味子醇甲，藥量為每天5 μL，速度為1 μL/min，療程為7 d。假手術(shù)組SD大鼠則給予對照劑，給藥結(jié)束后留針5 min。此外，免疫熒光所有組別SD大鼠單獨通過腹腔再給予5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)每天50 mg/kg，連續(xù)給藥7 d[15]。

1.4.4 Western Blot檢測 給藥7 d后每組隨機抽取6只大鼠，麻醉后迅速斷頭取腦，在冰上取左側(cè)大腦的室管膜下區(qū)組織制備蛋白樣本，BCA法檢測各組樣本蛋白濃度。配分離膠，上樣、電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h后標(biāo)一抗，4 ℃搖床孵育1 h后4 ℃冰箱過夜。次日，洗膜、HRP標(biāo)記的二抗稀釋液封膜、孵育2 h、加ECL化學(xué)發(fā)光底物、暗盒壓片。蛋白條帶用Image J軟件進行灰度值分析。

1.4.5 免疫熒光檢測 給藥7 d后每組隨機抽取6只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛深度麻醉，4%多聚甲醛灌流，快速冰凍切片，切片厚度約為20 μm。腦片經(jīng)0.2% TritonX-100室溫孵育透化、10%牛血清白蛋白溶液(BSA)室溫封閉、滴加一抗封閉過夜。第2天滴加熒光二抗室溫避光孵育1 h、DAPI復(fù)染細(xì)胞核、抗淬滅劑封片處理后通過熒光顯微鏡對各組腦片的室管膜下區(qū)進行拍照。

2 結(jié) 果

2.1 五味子醇甲對MCAO大鼠腦梗死面積的影響 在MCAO術(shù)后第7天處死SD大鼠，進行TTC染色，計算其腦梗死面積。結(jié)果顯示：與MCAO組比較，五味子醇甲治療后SD大鼠腦梗死面積縮小明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，隨著藥物濃度的增加，SD大鼠的腦梗死面積逐漸減小。由此推測五味子醇甲能減輕MCAO大鼠的腦組織損傷，且高劑量的五味子醇甲對MCAO大鼠腦組織的神經(jīng)保護作用最明顯。詳見圖1。

與MCAO組比較，＊ P<0.05，# P<0.01。

2.2 Western Blot檢測五味子醇甲對MCAO大鼠室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的影響 研究證實巢蛋白(Nestin)能作為神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，抗神經(jīng)細(xì)胞核蛋白(Hu)作為神經(jīng)元的標(biāo)志蛋白[15-16]。為了研究五味子醇甲對MCAO大鼠室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的影響，分別用Nestin和Hu抗體進行Western Blot實驗。圖2結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，MCAO組、五味子醇甲低劑量組、五味子醇甲中劑量組、五味子醇甲高劑量組神經(jīng)干細(xì)胞增殖標(biāo)記的Nestin蛋白、Hu蛋白表達增高；與MCAO組比較，五味子醇甲高劑量組Nestin蛋白、Hu蛋白表達明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明高劑量五味子醇甲干預(yù)后神經(jīng)干細(xì)胞增殖較明顯，即高劑量五味子醇甲干預(yù)后神經(jīng)干細(xì)胞明顯分化為神經(jīng)元。由此推測，五味子醇甲能夠上調(diào)Nestin和Hu蛋白表達而促進缺血再灌注損傷大鼠室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用，且高劑量的五味子醇甲的神經(jīng)保護作用最明顯。

與MCAO組比較，＊ P<0.05；與假手術(shù)組比較，# P<0.01。

2.3 免疫熒光法評估五味子醇甲對MCAO大鼠室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的影響 Brdu作為細(xì)胞增殖的標(biāo)記蛋白，通過觀察Brdu和DAPI融合成的熒光顯微圖像評估神經(jīng)干細(xì)胞的增殖情況[18]。免疫熒光分析結(jié)果(見圖3)進一步證明，與MCAO組比較，大鼠大腦中動脈栓塞再灌注后五味子醇甲高劑量組Brdu標(biāo)記的陽性神經(jīng)干細(xì)胞比例明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但五味子醇甲低劑量組、五味子醇甲中劑量組Brdu標(biāo)記的陽性神經(jīng)干細(xì)胞比例雖有一定增高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。由此得出，五味子醇甲高劑量組對神經(jīng)干細(xì)胞增殖的促進作用最明顯。Hu作為神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的標(biāo)志蛋白，通過觀察Hu和DAPI融合成的熒光顯微圖像評估神經(jīng)干細(xì)胞的分化情況發(fā)現(xiàn)，大腦中動脈栓塞再灌注后，神經(jīng)干細(xì)胞的分化作用不明顯，但給予五味子醇甲干預(yù)治療后神經(jīng)干細(xì)胞開始分化為神經(jīng)元，與MCAO組比較，五味子醇甲高、中、低劑量組治療后SD大鼠Hu蛋白標(biāo)記的陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且高劑量五味子醇甲干預(yù)后SD大鼠Hu蛋白標(biāo)記的陽性神經(jīng)元數(shù)量升高最明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，詳見圖4，由此得出五味子醇甲干預(yù)治療可促進神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元，并且以高劑量的五味子醇甲作用最明顯。

與MCAO組比較，＊ P<0.05；與假手術(shù)組比較，# P<0.01。

與MCAO組比較，＊ P<0.05；與假手術(shù)組比較，# P<0.01。

3 討 論

缺血性腦卒中是我國常見病、多發(fā)病，隨著高血壓、高血脂、糖尿病等發(fā)病率的增長，使得腦卒中發(fā)生的潛在危險因素也增加，腦缺血再灌注后產(chǎn)生的損傷更是增加了該病的致死率和致殘率。由于缺血性腦卒中導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)受損，而受損組織通過神經(jīng)元自身再生修復(fù)的可能性微乎其微，因此，本研究的中心為具有較強分化潛能和更新能力神經(jīng)干細(xì)胞。長期以來，人們認(rèn)為成年的哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞沒有再生能力，然而近年來研究表明，成年的哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的海馬齒狀回(DG)、室管膜下區(qū)(SVZ)仍然存在神經(jīng)發(fā)生[17]。作為治療中風(fēng)所致后遺癥、喑痱證的經(jīng)典方劑“地黃飲子”已被證實其具有良好的神經(jīng)保護作用，在肌肉萎縮、肢體痙攣和舌強不能言等諸多方面具有良好的療效[18-19]。其機制主要涉及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)相關(guān)信號通路被激活、調(diào)節(jié)因子腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、表皮生長因子(EGF)的表達而促進內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖、抗氧化應(yīng)激等而達到神經(jīng)保護作用[20-23]。五味子醇甲是五味子入血后的主要成分，且其能透過血腦屏障，藥理作用廣泛，可作用于心血管系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等多個系統(tǒng)，然而其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用不容忽視。五味子醇甲可提高海馬區(qū)多巴胺(DA)和5-羥色胺(5-HT)的含量而促進大鼠覺醒，并可提高大鼠記憶能力而保護大腦[24]。五味子醇甲可通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化從而抑制腦內(nèi)炎癥反應(yīng)而發(fā)揮腦保護作用[25]。五味子醇甲能減輕APP/PSI雙轉(zhuǎn)基因癡呆性小鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷和改善突觸功能而預(yù)防阿爾茨海默病[26]。五味子醇甲既能夠促進體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化[12]，又能誘導(dǎo)MCAO大鼠缺血半影區(qū)神經(jīng)元自噬從而促進其神經(jīng)功能的恢復(fù)而發(fā)揮神經(jīng)保護作用[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組SD大鼠均未出現(xiàn)神經(jīng)功能損傷，TTC染色未見梗死區(qū)；MCAO缺血再灌注后所有SD大鼠出現(xiàn)不同程度的腦梗死，五味子醇甲藥物干預(yù)治療后，腦梗面積明顯縮小，且五味子醇甲高劑量組對減少術(shù)后SD大鼠腦梗死面積作用更明顯，該結(jié)果與Zhou 等[9]的研究結(jié)論相一致，即高劑量組的五味子醇甲能夠減輕神經(jīng)功能損傷、降低神經(jīng)功能評分，由此推測五味子醇甲對腦缺血再灌注損傷大鼠具有一定的保護作用[13]。本研究通過Western Blot、免疫熒光組織化學(xué)法進行綜合評估，結(jié)果表明：與假手術(shù)組和MCAO組比較，五味子醇甲高劑量組大鼠室管膜下區(qū)Nestin、Hu、Brdu蛋白表達均明顯升高，且五味子醇甲低劑量組、五味子醇甲中劑量組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，由此得出，五味子醇甲可能通過促進缺血再灌注損傷大鼠室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化相關(guān)蛋白Nestin、Brdu、Hu表達水平，從而促進室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化為神經(jīng)元，從而發(fā)揮腦缺血再灌注損傷保護作用，且高劑量的五味子醇甲治療對神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化作用更明顯。

綜上所述，本研究結(jié)果可能有助于進一步明確五味子醇甲促進神經(jīng)功能恢復(fù)的病理機制研究，從而為豐富預(yù)防和治療腦缺血的方法提供實驗依據(jù)。