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    不同內(nèi)型哮喘小鼠模型中的小氣道功能研究及其機(jī)制初探

    2022-03-04 10:46:46薛藝抒傅強(qiáng)包婺平郝慧娟張旻
    臨床肺科雜志 2022年3期
    關(guān)鍵詞:內(nèi)型小氣重塑

    薛藝抒 傅強(qiáng) 包婺平 郝慧娟 張旻

    支氣管哮喘(以下簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘)是以氣道慢性炎癥、氣道高反應(yīng)性及氣道重塑為主要特征的異質(zhì)性疾病,根據(jù)不同內(nèi)型及個(gè)體化治療的目的,可將哮喘分為T(mén)ype2(T2)型哮喘和非T2型哮喘。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn),小氣道功能的異常存在于不同嚴(yán)重程度的哮喘患者[1-3];我們的臨床研究也發(fā)現(xiàn)小氣道功能異常者的激發(fā)試驗(yàn)陽(yáng)性率明顯增高[4]。呼吸描記圖末端的減慢被認(rèn)為是與小氣道的氣流阻塞有關(guān)的最早變化,因此,肺功能中的變量,如用力呼氣50%時(shí)的瞬時(shí)流速(Forced expiratory flow at 50% of Forced Vital Capacity[FVC],F(xiàn)EF50)、用力呼氣75%時(shí)的瞬時(shí)流速(Forced expiratory flow at 75% of FVC,F(xiàn)EF75)和最大呼氣中段流量 (Forced expiratory flow between 25% and 75% FVC,MMEF) 常被用于預(yù)測(cè)人類(lèi)小氣道功能障礙[5]。然而,在動(dòng)物哮喘模型中哮喘中小氣道功能障礙的觀察和研究仍缺乏。通過(guò)建立兩種不同內(nèi)型的哮喘模型,本文檢測(cè)小鼠的小氣道功能,并分析其與氣道炎癥、氣道反應(yīng)性、氣道重塑的相關(guān)性,為小氣道功能障礙在動(dòng)物哮喘模型中的作用機(jī)制提供依據(jù)。

    資料與方法

    一、 材料

    C57BL/6小鼠(無(wú)特殊病原體級(jí),雄性,5~6周齡,體重18~20g)購(gòu)自上海吉輝實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(滬)2017-0012,飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心內(nèi)。飼養(yǎng)環(huán)境溫度21℃至25℃,濕度40%至60%,自由喂養(yǎng)水和食物(不含OVA),采用12小時(shí)為周期的光-暗循環(huán)。所有處理流程和實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院動(dòng)物研究倫理委員會(huì)的規(guī)定執(zhí)行(倫理批號(hào): 2019-A011-01)。舒泰50(Virbac S.A., France),拜特速眠新(拜特生物科技研究所有限公司,長(zhǎng)沙),蘇木素-伊紅染色試劑盒(谷歌生物科技,武漢);卵清蛋白 ( OVA ) ( grade V&Ⅱ, Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo. , USA) , 小鼠IL-4、IL-5、IL-17A,、TNF-α ELISA試劑盒(ANOGEN, Ontario, Canada),小鼠IL-13 ELISA試劑盒(Invitrogen, California, USA)。

    二、方法

    1 兩種內(nèi)型哮喘模型建立

    將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組,每組6只。T2型哮喘模型(OVA組):在第0天和第7天進(jìn)行卵清蛋白(ovalbumin,OVA)(1mg/kg)+明礬(體積同OVA)腹腔注射致敏小鼠,從第14天至第22天,隔天以PBS配制5% OVA霧化吸入30分鐘,并在休息30分鐘后吸入空氣2小時(shí);非T2型哮喘模型(OVA+ozone組):其余操作同OVA組,每次OVA霧化結(jié)束休息30分鐘后,吸入2.5 ppm的臭氧2小時(shí);對(duì)照組(Control組):在第0天和第7天進(jìn)行PBS腹腔注射,從第14天開(kāi)始隔天PBS霧化吸入30分鐘,隨后空氣吸入2小時(shí)至第22天。

    2 小鼠肺功能檢測(cè)

    最后一次臭氧暴露后24小時(shí),以舒泰50(25mg/kg)和拜特速眠新(10mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠,確認(rèn)其完全昏睡且痛覺(jué)喪失后,將小鼠固定于泡沫操作板上,剪開(kāi)頸部皮膚后鈍性分離周?chē)M織,充分暴露氣管,預(yù)先將一生理鹽水浸濕的結(jié)扎線置于氣管下,隨后在甲狀軟骨下的環(huán)狀軟骨上沿氣管橫徑剪一小口,將氣管插管插入氣管中,將結(jié)扎線打結(jié),固定氣管插管。連接小鼠的氣管插管至EMMS eDacq FM(模擬強(qiáng)迫振蕩)系統(tǒng)體積描記器上的接頭,根據(jù)EMMS數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)eDacq軟件中預(yù)設(shè)的程序,模擬經(jīng)典的臨床肺活量測(cè)定法檢測(cè)小鼠大、小氣道功能。該系統(tǒng)計(jì)算的參數(shù)包括用力肺活量(Forced Expiratory Volume,F(xiàn)VC)和呼氣中期流量。其中EF50、FEF75、MMEF提示小氣道功能。

    3 小鼠氣道反應(yīng)性檢測(cè)

    隨后進(jìn)行有創(chuàng)的氣道阻力與順應(yīng)性檢測(cè)。將小鼠置入EMMS R&C系統(tǒng)的體積描記器中,采用微型通氣系統(tǒng)維持輔助通氣,控制通氣頻率為180次/分,潮氣量為210μl,將氣管插管導(dǎo)管與EMMS R&C系統(tǒng)呼吸流量測(cè)定儀和壓力傳感器連接。eDacq軟件自動(dòng)記錄流速的變化與壓力的變化,并計(jì)算氣道阻力(RL)。與傳感器連接后,待小鼠呼吸平穩(wěn)后通過(guò)霧化給藥系統(tǒng)吸入10μl PBS(給藥時(shí)間30秒),停止霧化后RL的檢測(cè)與記錄啟動(dòng),霧化PBS后的3分鐘所記錄的RL的均值即為激發(fā)前的基礎(chǔ)值,隨后逐次吸入遞增濃度(4,8,16,32,64,128和256mg/mL)的氯化乙酰膽堿(Acetylcholine chloride,ACh)溶液,每次加樣體積、霧化時(shí)間和記錄持續(xù)時(shí)長(zhǎng)需與基線檢測(cè)保持相同。記錄RL,并計(jì)算其較基線 (霧化PBS后測(cè)得的均值) 增加的百分比(%)。使RL比基線升高100%所需的ACh濃度記為PC100,為了方便數(shù)據(jù)分析,將RL曲線的橫坐標(biāo)變轉(zhuǎn)換為對(duì)數(shù)形式。將-log PC100作為反映氣道反應(yīng)性的指征。

    4、 肺泡灌洗液中的細(xì)胞因子檢測(cè)

    氣道阻力檢測(cè)結(jié)束后,并以1.5% 戊巴比妥(200mg/kg)腹腔注射麻醉處死小鼠,將0.6mL冰PBS經(jīng)氣管插管緩慢注入肺部進(jìn)行全肺灌洗,抽吸2~3次,每只小鼠灌洗3次,收集支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)。將回收的 BALF在3000rpm、4℃條件下,離心10min,吸取上清液,用作細(xì)胞因子蛋白檢測(cè)。根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),檢測(cè)IL-4、IL-5、IL-13、IL-17A、TNF-α的表達(dá)水平。

    5 肺組織學(xué)檢測(cè)及免疫組織化學(xué)染色

    小鼠肺組織用4%多聚甲醛(20cmH2O的壓力注入)固定后,經(jīng)脫水,石蠟包埋,切片,脫蠟后進(jìn)行蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin staining,HE)染色和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)抗體處理,分別觀察氣道炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和平滑肌增生的情況。在20倍或40倍光鏡下,根據(jù)支氣管或小血管周?chē)装Y細(xì)胞浸潤(rùn)情況進(jìn)行炎癥評(píng)分[6]:0分,支氣管或小血管周?chē)鷰缀鯖](méi)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);1分:支氣管或小血管周?chē)加猩倭垦装Y細(xì)胞浸潤(rùn);2分:支氣管或血管周?chē)谎装Y細(xì)胞包繞,細(xì)胞層較薄(≤5層);3分:支氣管或血管周?chē)缓駥蛹?xì)胞(>5層)圍繞。每只小鼠計(jì)數(shù)至少10個(gè)視野,將其炎癥評(píng)分的均數(shù)作為觀察值進(jìn)行比較、分析。并對(duì)每只小鼠選取10個(gè)視野,計(jì)數(shù)具有完整橫切面的支氣管旁嗜酸性粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞,計(jì)數(shù)寬度(測(cè)量時(shí)與支氣管垂直)控制在100μm左右。計(jì)算每只小鼠的支氣管旁不同炎癥細(xì)胞的密度(個(gè)/100μm)的均值并統(tǒng)計(jì)分析。

    三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用GraphPad PRISM 5.0版本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Kruskal-Wallis 單因素方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)進(jìn)行多組間的比較,差異有顯著性時(shí)進(jìn)一步用S-N-K法進(jìn)行兩兩比較。采用Spearman分析不同變量之間的相關(guān)性。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    一、 兩種內(nèi)型的哮喘小鼠均出現(xiàn)小氣道功能障礙

    三組小鼠之間FVC值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1A)。兩種內(nèi)型的哮喘模型中均存在小氣道功能障礙。與對(duì)照組相比,非T2型哮喘小鼠模型的MMEF、FEF50和FEF75均下降 (圖1 B-D),T2型哮喘小鼠中MMEF、FEF50也降低(圖1 B-C)。兩種哮喘模型相比較,OVA+ozone組小鼠較OVA組表現(xiàn)出小氣道功能更差的趨勢(shì),但其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    圖1 兩種內(nèi)型的哮喘小鼠的小氣道功能(n=18,每組6只)。

    采用EMMS FM系統(tǒng)檢測(cè)小鼠小氣道功能。(A) FVC。(B-D)小鼠小氣道功能 (MMEF、FEF50、FEF75)。*P<0.05,**P<0.01。

    二、 兩種內(nèi)型的哮喘模型均表現(xiàn)出相應(yīng)的氣道炎癥

    與對(duì)照組相比,兩種哮喘模型小鼠的氣道中均出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),并伴有支氣管壁增厚(圖2A),炎癥評(píng)分也顯示兩組小鼠的氣道炎癥較對(duì)照組均加重(圖2B)。OVA組較OVA+ozone組表現(xiàn)出更多的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2D),而OVA+ozone組則表現(xiàn)出更多的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2C)。

    OVA組和OVA+ozone組Th2相關(guān)細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13水平均高于對(duì)照組(圖2E-G),其中OVA組的IL-13表達(dá)水平較OVA+ozone組更高。IL-17A在兩種哮喘模型中也都表現(xiàn)為顯著升高,其中OVA+ozone組IL-17A水平顯著高于OVA組(圖2H)。

    圖2 小鼠的氣道炎癥的病理改變(HE染色,n=18,每組6只)及細(xì)胞因子水平變化(ELISA法,n=18,每組6只)

    三、 兩種內(nèi)型的哮喘模型均表現(xiàn)出氣道高反應(yīng)性

    三組小鼠經(jīng)PBS霧化后的基線肺阻力(RL)值組間未表現(xiàn)出明顯差異。兩種哮喘模型中,RL濃度反應(yīng)曲線都呈現(xiàn)左移的趨勢(shì),表明與對(duì)照組小鼠相比,兩種哮喘模型的氣道反應(yīng)性均增加(圖3A)。與對(duì)照組相比,T2型哮喘模型小鼠在64和256 mg/mL ACh濃度刺激下的RL值升高;OVA+ozone誘導(dǎo)的非T2型哮喘模型在8、、32 、64 和256mg/mL ACh濃度下均表現(xiàn)出較對(duì)照組顯著增加的氣道阻力。更直觀地,將OVA組和OVA+ozone組的-log PC100與對(duì)照組相比,我們發(fā)現(xiàn)兩種哮喘小鼠模型均存在氣道高反應(yīng)性,并且OVA+ozone組似乎表現(xiàn)出更強(qiáng)的氣道反應(yīng)性,但其與OVA組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異 (圖3B)。

    圖3 小鼠的氣道反應(yīng)性(n=18, 每組6只)。

    (A)HE染色切片的代表性顯微照片(放大倍率為400倍,圖中紅色箭頭指向典型嗜酸性粒細(xì)胞,藍(lán)色箭頭指向典型中性粒細(xì)胞)。(B)氣道炎癥評(píng)分。(C)中性粒細(xì)胞密度(每100微米)。(D)嗜酸性粒細(xì)胞密度(每100微米)。(E-H)小鼠BALF中炎癥細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13及IL-17A的水平。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

    采用EMMS R&C系統(tǒng)檢測(cè)小鼠氣道阻力。(A) 氣道阻力(RL)隨ACh濃度增加的平均百分比(橫坐標(biāo)為ACh濃度取對(duì)數(shù)值)。(B) -logPC100 (使RL較基線增加100%所需的乙酰膽堿濃度)。圖A中*代表與對(duì)照組比較的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

    四、兩種內(nèi)型的哮喘模型均表現(xiàn)出氣道重塑

    OVA組和OVA+ozone組的小鼠較對(duì)照組均出現(xiàn)明顯的氣道平滑肌增生(圖4A)。OVA+ozone小鼠中的氣道平滑肌增生比OVA組更明顯(圖4B)。

    圖4 小鼠氣道平滑肌改變(免疫組織化學(xué)法,n=18,每組6只)

    五、兩種哮喘模型中小氣道功能與氣道炎癥、氣道反應(yīng)性及氣道重塑相關(guān)小氣道功能指標(biāo)中,MMEF、FEF50在哮喘模型組較對(duì)照組表現(xiàn)出較大差異(圖1B-C),所以此處以MMEF、FEF50作為代表,分析了其與反映氣道炎癥的BALF細(xì)胞因子水平、代表氣道阻力的-logPC100及反映氣道重塑的α-SMA陽(yáng)性面積百分比的相關(guān)性。結(jié)果顯示MMEF及FEF50與氣道阻力、氣道平滑肌增生呈現(xiàn)出良好的負(fù)相關(guān)性(圖5A-B、G-H)。BALF中的炎性細(xì)胞因子也與小氣道功能呈現(xiàn)出相關(guān)性(圖5C-F、I-L),其中IL-17A與MMEF(r=-0.6677,P=0.0025)和FEF50(r=-0.6677,P=0.0031)均呈現(xiàn)較其他幾種所測(cè)細(xì)胞因子更強(qiáng)的相關(guān)性。

    圖5 小氣道功能與氣道炎癥、氣道反應(yīng)性、氣道重塑的相關(guān)性(n=18,每組6只)

    討 論

    本研究中,OVA和OVA+ozone兩種小鼠模型均表現(xiàn)出T2和非T2型哮喘的相應(yīng)特征,均存在氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性以及氣道重塑,但OVA組小鼠表現(xiàn)出更高的嗜酸性粒細(xì)胞炎癥及Th2型細(xì)胞因子,模擬了T2型哮喘內(nèi)型;OVA +ozone組則表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)以及Th17相關(guān)細(xì)胞因子水平升高,與我們之前的研究結(jié)果相似[6],模擬了非T2型哮喘內(nèi)型。小氣道功能的異常在哮喘患者的臨床研究中起著重要作用[3,7],但在臨床患者中難于模擬或收集足夠的T2型和非T2型哮喘病例進(jìn)行研究,本研究在小鼠中建立上述兩種內(nèi)型的哮喘模型,將哮喘中小氣道功能的研究擴(kuò)展到動(dòng)物模型中。

    已有部分研究從病理學(xué)角度對(duì)從小鼠小氣道的病理進(jìn)行了不同的探討和定義,包括根據(jù)支氣管肺泡管連接處的距離、氣道直徑<100μm或<400μm等方式[8-10],但對(duì)于小鼠小氣道的定義尚未達(dá)成共識(shí)。從肺功能的角度評(píng)估小鼠小氣道功能的研究仍缺乏,本研究采用模擬人類(lèi)肺功能測(cè)定的EMMS eDacq FM系統(tǒng)檢測(cè)小鼠氣道功能,探索了兩種哮喘內(nèi)型中小氣道功能是否存在異常及其可能的機(jī)制。

    氣道高反應(yīng)性、氣道炎癥和氣道重塑是哮喘的典型特征,在哮喘的病理生理機(jī)制中起重要作用[11]。所以我們根據(jù)不同的代表性指標(biāo),分析了小氣道與以上三者的相關(guān)性。我們的研究表明,小氣道功能指標(biāo)如FEF50、MMEF與BALF中IL-4、IL-5、IL-13和IL-17A水平提示的氣道炎癥的嚴(yán)重程度相關(guān)。既往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在哮喘中小氣道存在與大氣道相似甚至更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng),伴有IL-4、IL-5 mRNA的表達(dá)增加[12-14]。本研究的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了小氣道功能異常與氣道炎癥程度的相關(guān)性,對(duì)于小氣道的干預(yù)在哮喘氣道炎癥的治療中不可忽視。小氣道功能障礙與氣道高反應(yīng)性的相關(guān)性在臨床研究中已有較多發(fā)現(xiàn)[15-17],本課題組的前期臨床研究也發(fā)現(xiàn)小氣道功能障礙可能參與了慢性咳嗽患者氣道高反應(yīng)性的發(fā)生[18]。本研究進(jìn)一步在小鼠模型中驗(yàn)證了哮喘環(huán)境下氣道高反應(yīng)性與小氣道功能障礙密切相關(guān),針對(duì)具有小氣道功能障礙的患者,能到達(dá)更遠(yuǎn)端氣道的氣霧劑可能對(duì)其治療具有更大的幫助。慢性氣道重塑是哮喘的基礎(chǔ)表征之一[19],氣道平滑肌增厚是氣道重塑的一種主要表現(xiàn),α-SMA由平滑肌細(xì)胞表達(dá)并作為平滑肌細(xì)胞的標(biāo)記物[20]。 哮喘中的氣道重塑除了涉及大氣道外,也涉及小氣道[21-22],但關(guān)于哮喘中小氣道功能障礙與氣道重塑的關(guān)系研究仍較少。本研究中兩種哮喘小鼠模型中均出現(xiàn)氣道重塑,并與小氣道功能障礙表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性。說(shuō)明在哮喘環(huán)境下,氣道重塑也發(fā)生在(A) MMEF與氣道反應(yīng)性的相關(guān)性。(B) MMEF與氣道重塑的相關(guān)性。(C-F) MMEF與BALF中炎性細(xì)胞因子的相關(guān)性。(G) FEF50與氣道反應(yīng)性的相關(guān)性。(H) FEF50與氣道重塑的相關(guān)性。(I-L) FEF50與BALF中炎性因子的相關(guān)性。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。ns,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

    小氣道,并可能與小氣道功能障礙共同促進(jìn)哮喘的發(fā)生發(fā)展。有研究表明中性粒細(xì)胞可能參與促進(jìn)氣道重塑[23],這可能有助于解釋本研究中非T2型哮喘模型比T2型哮喘模型更嚴(yán)重的氣道重塑的結(jié)果。

    此外,盡管T2型和非T2型哮喘模型小氣道功能的結(jié)果相近,但小氣道功能障礙可能存在不同的機(jī)制。OVA組中Th2相關(guān)細(xì)胞因子如IL-13水平更高,而OVA+ozone則誘導(dǎo)產(chǎn)生更高水平的IL-17A以及更嚴(yán)重的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。OVA+ozone組更嚴(yán)重的氣道平滑肌增生,也可能影響這一內(nèi)型哮喘的小氣道功能。因此,這兩類(lèi)哮喘的治療可能需要更個(gè)體化的方案,有必要對(duì)它們參與小氣道功能異常的潛在信號(hào)通路進(jìn)行進(jìn)一步研究。

    綜上所述,小氣道功能障礙存在于不同內(nèi)型的哮喘中,其發(fā)病機(jī)制與氣道炎癥的嚴(yán)重程度、氣道反應(yīng)性以及氣道重塑的情況密切相關(guān),并且在T2型和非T2型哮喘模型中,小氣道功能障礙的機(jī)制可能不同,仍需進(jìn)一步研究探索是否干預(yù)相應(yīng)細(xì)胞因子可以恢復(fù)小氣道功能。

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