中華蜜蜂氣味結(jié)合蛋白AcerOBP7的表達及結(jié)合特性

趙慧婷，彭竹，姜玉鎖，趙淑果，黃麗，杜亞麗，郭麗娜

中華蜜蜂氣味結(jié)合蛋白AcerOBP7的表達及結(jié)合特性

趙慧婷1*，彭竹1，姜玉鎖1，趙淑果1，黃麗1，杜亞麗2，郭麗娜2

1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801；2山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801

【目的】中華蜜蜂（，簡稱中蜂）是我國本土蜂種，也是重要的傳粉昆蟲和經(jīng)濟昆蟲。氣味結(jié)合蛋白（odorant binding protein，OBP）是蜜蜂嗅覺感知中的關(guān)鍵蛋白。在前人對中蜂基因序列特征分析的基礎(chǔ)上，本研究進一步對其表達特性及與氣味物質(zhì)的結(jié)合能力進行探究，為揭示氣味結(jié)合蛋白在中蜂嗅覺系統(tǒng)中的作用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)?！痉椒ā坎捎胵RT-PCR檢測在工蜂不同組織和發(fā)育階段的表達特性；通過原核表達系統(tǒng)獲得AcerOBP7融合蛋白，使用Ni-NTA柱進行蛋白純化；采用熒光競爭結(jié)合法，以1-NPN（N-phenyl-1-naphthylamine）為熒光探針，測定AcerOBP7與信息素及植物揮發(fā)物的結(jié)合能力；設(shè)計并合成ds，采用飼喂法對該基因進行沉默，通過qRT-PCR測定沉默效率；結(jié)合RNAi，利用EAG檢測并比較對照組與干擾組中蜜蜂觸角對待測物質(zhì)反應(yīng)值的差異?！窘Y(jié)果】qRT-PCR結(jié)果顯示，mRNA在工蜂觸角中的表達量極顯著高于其他組織（＜0.01），且在20日齡時表達量最高，在1日齡時表達量最低。成功構(gòu)建了pET28a/AcerOBP7表達載體，通過大腸桿菌原核表達系統(tǒng)獲得了高純度的重組蛋白。與37種配體分子的熒光競爭結(jié)合試驗表明，AcerOBP7與9-ODA、1-壬醇結(jié)合能力最強，Ki值均為1.85 μmol·L-1，其次與(+)-檸檬烯、1-辛烯-3-醇、芳樟醇、反式肉桂酸乙酯、桉樹腦、(+)-3-蒈烯及壬醛有較強的結(jié)合活性，Ki 值分別為1.87、2.66、2.72、3.05、3.88、4.14和4.40 μmol·L-1，與所選擇的幼蟲信息素均無結(jié)合能力。使用飼喂dsRNA的方法成功干擾了的表達，干擾效率最高可達70.63%。干擾后的EAG試驗表明，中蜂觸角對所測氣味物質(zhì)的反應(yīng)強度均有所下降，其中1-辛烯-3-醇、壬醛、桉樹腦和9-ODA的EAG相對值顯著降低（＜0.05）?！窘Y(jié)論】在中蜂采集蜂觸角中高表達，重組蛋白能與多種氣味分子結(jié)合，表明AcerOBP7是一種廣譜型結(jié)合蛋白，推測其可能在工蜂采集和哺育蜂王的行為中發(fā)揮著重要作用。另外，1-辛烯-3-醇、壬醛、桉樹腦和9-ODA可能是AcerOBP7結(jié)合特異性較高的配體物質(zhì)。

中華蜜蜂；氣味結(jié)合蛋白；表達模式；蛋白純化；結(jié)合特性

0 引言

【研究意義】昆蟲通過嗅覺來進行覓食、交配和尋找寄主等行為和生理活動，并通過識別信息素、植物揮發(fā)物和動物氣味等多種化學(xué)物質(zhì)，與種群中成員進行聯(lián)絡(luò)和信息交流[1-2]。對昆蟲嗅覺識別機理以及氣味物質(zhì)與嗅覺蛋白間分子互作的研究，對于制定通過干擾嗅覺行為的控制策略來開發(fā)昆蟲引誘劑或趨避劑具有現(xiàn)實意義。昆蟲外周嗅覺系統(tǒng)涉及多種嗅覺相關(guān)蛋白，其中，氣味結(jié)合蛋白（odorant binding protein，OBP）是感受外界化學(xué)刺激，并運載、釋放化學(xué)信息的重要蛋白[3-4]。蜜蜂是一類社會性昆蟲，嗅覺在蜜蜂幾乎所有的生物學(xué)行為中都具有重要作用，為蜂群內(nèi)部凝聚力的維持和外出采集行為提供了重要的感覺網(wǎng)絡(luò)[5]。中華蜜蜂（，簡稱中蜂）是我國重要的經(jīng)濟蜂種，有許多獨特的生物學(xué)特性，如能從零星的蜜源植物中檢測到微量的氣味物質(zhì)從而找到蜜源，對瓦螨（）等寄生蟲具有高抗性，以及耐低溫環(huán)境等優(yōu)良特性[6]。對中蜂OBP進行研究有助于了解其靈敏的化學(xué)感受機制，為有效指導(dǎo)和利用中蜂生產(chǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】昆蟲OBP是一類小分子的水溶性蛋白，由嗅覺感器中的助細胞分泌到感器淋巴液中[4]。OBP被認為可以結(jié)合疏水性氣味分子，并將它們運送到氣味受體（odorant receptor，OR），還可以保護氣味分子免受感器淋巴液中氣味降解酶的影響[7-8]。目前，OBP基因家族已經(jīng)在棉鈴蟲（）、草地螟（）、中華按蚊（）等多種昆蟲中被鑒定[9-11]，為昆蟲嗅覺分子機制的深入研究打下了基礎(chǔ)[12-13]。通過生物信息學(xué)方法，在西方蜜蜂（）基因組中鑒定了21個OBP，是目前已知的OBP數(shù)量較小的昆蟲種類[14]。蜜蜂OBP家族基因序列具有高度的異質(zhì)性，每個OBP基因可能執(zhí)行不同的功能[15]。中蜂與西方蜜蜂的嗅覺蛋白基因序列具有高度的相似性[16]。自昆蟲OBP基因被鑒定以來，其表達特性及功能成為了研究的熱點。一般認為在觸角高表達的OBP與嗅覺功能相關(guān)[17]，在非嗅覺器官中高表達的OBP可能具有其他廣泛的功能[18]。目前對昆蟲OBP功能的研究主要采用熒光競爭結(jié)合、RNAi及電生理等手段[19-21]。研究昆蟲OBP在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中亦具有潛在的應(yīng)用價值。利用化合物與OBP的結(jié)合親和力，將OBP作為篩選活性化合物的分子靶點，從而減少臍橙螟（）候選引誘劑氣味物質(zhì)的數(shù)量，與該領(lǐng)域常用的其他試錯篩選法相比，不但節(jié)省時間，還降低了研究成本[22]。Leal等[23]利用CquiOBP1作為結(jié)合靶點，結(jié)合反向和常規(guī)化學(xué)生態(tài)學(xué)方法來鑒定非天然配體，促進了商品化致倦庫蚊（）產(chǎn)卵引誘劑的研發(fā)。近年來對中蜂OBP也開展了一系列研究，如比較了中蜂和意大利蜜蜂（）的序列特征、表達模式，并利用熒光競爭結(jié)合試驗檢測了兩個同源基因與感染白堊病的蜜蜂幼蟲揮發(fā)性物質(zhì)苯甲醇、2-苯乙醇和乙酸苯乙酯3種配體的結(jié)合特性[12]；通過體外誘導(dǎo)AcerOBP12重組蛋白的表達，探究了與吡蟲啉的結(jié)合機理[24]；利用熒光競爭結(jié)合試驗研究了與蜜蜂多種信息素成分如下頜骨信息素、對羥基苯甲酸甲酯和反式-9-氧代-2-癸烯酸（9-ODA）的結(jié)合特性[25]；Guo等[26]研究了在非生物脅迫作用下的表達模式。【本研究切入點】陳藝杰等[27]克隆了中蜂并分析了其序列特征，發(fā)現(xiàn)AcerOBP7為classical OBP亞家族的一種分泌蛋白。但表達特性及嗅覺功能有待于進一步明確。【擬解決的關(guān)鍵問題】利用qRT-PCR技術(shù)對在中蜂不同發(fā)育階段及組織中的表達水平進行檢測；通過熒光競爭結(jié)合試驗，確定AcerOBP7蛋白與信息素及植物揮發(fā)物的結(jié)合能力；聯(lián)合RNAi及EAG試驗進一步鑒定AcerOBP7的特異性配體物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 供試中蜂

試驗用中蜂于2019年采自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)中蜂場。

qRT-PCR用樣本：選擇健康蜂群，將即將羽化出房的巢脾置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱（溫度（34±1）℃，相對濕度（75±5）%）中。待新蜂出房后，使用無毒無味的顏料標記1日齡工蜂胸部（約2 000只），把剛羽化出房的蜜蜂記為1日齡，標記后隨機放入3個蜂箱中，隨后收集不同發(fā)育階段（1、5、10、15、20、25、30日齡）的觸角樣本，每個樣本為80只蜜蜂，設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。另外在巢門口采集后足攜帶花粉的采集蜂，分離并收集觸角（80只）、頭（去觸角，8只）、胸（8只）、腹（3只）、足（20只）、翅（80只）。將收集到的組織樣本立即投入液氮中，充分研磨后置于1.5 mL EP管中，加入1 mL Trizol，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

RNAi用樣本：在巢門口采集后足攜帶花粉的采集蜂，用消毒鑷子輕輕夾住其胸部，放至木盒中。將木盒置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱（溫度（28±1）℃，相對濕度（75±5）%）中，饑餓30 min后分別飼喂30%糖水、含有ds、ds的30%糖水，每組3個重復(fù)，并于飼喂后24、48、72、96 h分別收集蜜蜂全組織（去除腹部）。將收集到的組織樣本立即投入液氮中，研磨至粉末狀后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設(shè)計

利用在線工具Primer3.0 Plus設(shè)計qRT-PCR及dsRNA用引物序列，選用東方蜜蜂作為熒光定量的內(nèi)參基因（GenBank登錄號：HM640276.1），選用綠色熒光蛋白（GenBank登錄號：JQ064510.1）作為RNAi試驗的陰性對照。所需引物詳細信息見表1。

1.3 總RNA提取和cDNA合成

按照Trizol（Invitrogen，美國）試劑盒說明書提取中蜂不同發(fā)育階段的觸角、采集蜂不同組織及RNAi飼喂后各時間段蜜蜂組織的總RNA。經(jīng)Nanodrop 2000c微量核酸蛋白測定儀（ThermoFisher，美國）測定RNA純度和濃度后，根據(jù)PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser（perfect real-time）試劑盒（Takara，大連）說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈，合成后置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

使用SYBR ? Premix Ex TaqTMII（Takara，大連）試劑盒在StepOnePlus實時熒光定量PCR儀（ABI，美國）上進行qRT-PCR，反應(yīng)體系為15 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，共42個循環(huán)。熔解曲線反應(yīng)條件：95℃ 15 s，60℃ 1 min。分別以工蜂1日齡觸角、采集蜂觸角中的表達量為基準，采用2-ΔΔCt法對在工蜂不同發(fā)育階段和不同組織的表達量進行分析，每個樣品做3 次技術(shù)重復(fù)。

1.5 AcerOBP7原核表達載體構(gòu)建

根據(jù)中蜂觸角轉(zhuǎn)錄組測序得到的基因完整的ORF序列，去除信號肽（前19個氨基酸），設(shè)計帶有H I和d III（Takara，大連）酶切位點的引物序列（表 1），以采集蜂觸角cDNA為模板進行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收的目的片段連接到表達載體pET-28a（+）上，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中（全式金，北京），次日，挑取菌落振蕩培養(yǎng)12 h（37℃，220 r/min），用Plasmid Mini Kit I試劑盒提取質(zhì)粒DNA（OMEGA，美國）并測序驗證（生工生物工程上海股份有限公司）。

1.6 AcerOBP7原核表達及分離純化

將測序驗證后的重組質(zhì)粒pET-28a/AcerOBP7轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21（DE3）感受態(tài)細胞，涂板培養(yǎng)后挑取單菌落于LB培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)（37℃，220 r/min，12 h），將少量培養(yǎng)后的菌液按體積比1﹕1 000接種于新鮮的LB培養(yǎng)液（含Kan 50 μg·mL-1）中，37℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600=0.8時，加入終濃度1 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h，然后離心收集菌體，將菌體重新懸浮后超聲波破碎，12 000 r/min離心30 min，收集上清和沉淀，SDS-PAGE檢測蛋白的表達情況。

表1 引物信息列表

酶切位點和T7啟動子序列分別用“～”和“_”表示The wavy lines represent the restriction sites. The underlines represent the T7 promote sequence

500 mL LB培養(yǎng)基大量表達目的蛋白，誘導(dǎo)后離心收集菌體，用25 mL 50 mmol·L-1Tris-HCl（pH 7.4）懸浮，超聲破碎后離心取上清，保存沉淀，SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白表達形式。含有重組目的蛋白的溶液參照His標簽蛋白純化試劑盒說明書進行親和層析蛋白純化，純化后利用凝血酶（索萊寶，北京）切除His-tag，再次純化，經(jīng)超濾凝縮管（Millipore，上海）濃縮及復(fù)性后，將得到的目的蛋白置于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

一個月零三天后，也就是6月10日，《沮水巫音》被列入國家級非遺保護名錄，這對?？祦碚f，是一件大好事，極大地提升了保康的文化內(nèi)涵，打響了文化品牌。我第一時間打電話把這個好消息告訴給王述金，電話的那頭傳來的是老王悲喜交加的哭泣聲。

1.7 熒光競爭結(jié)合試驗

熒光競爭結(jié)合試驗選取37種氣味標品物質(zhì)（阿拉丁，上海），包括1種蜂王信息素，2種告警信息素、4種那氏信息素、7種幼蟲信息素和23種植物揮發(fā)物。該試驗在RF-5301PC熒光分光光度計（Shimadzu，日本）上完成，具體操作過程：在熒光比色皿中加入AcerOBP7蛋白溶液（終濃度為1 μmol·L-1），記錄最大熒光值，加入1-NPN（N-pheny-1-naphthylamine），吹打混勻后靜置2 min使充分反應(yīng)，掃描并記錄熒光強度，1-NPN濃度1—10 μmol·L-1依次遞增，記錄最大熒光值。利用GraphPad Prism 8.0軟件對1-NPN濃度和其對應(yīng)的熒光最大值數(shù)據(jù)進行非線性回歸擬合分析，并用Scatchard法線性化該曲線，計算AcerOBP7與1-NPN的結(jié)合常數(shù)。為了測定AcerOBP7與待測氣味分子的結(jié)合特性，將溶于甲醇的氣味標品樣（終濃度為l μmol·L-1）依次加到熒光比色皿中，濃度1—10 μmol·L-1依次遞增，記錄最大熒光值。氣味分子與蛋白1﹕1結(jié)合，根據(jù)氣味物質(zhì)的IC50值，計算配體的解離常數(shù)Ki，公式為Ki = IC50/[I +（1-NPN）/K1-NPN]。其中，IC50為配體替換50%探針時的濃度，1-NPN為未結(jié)合1-NPN濃度，K1-NPN為OBP/1-NPN復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)。

1.8 RNA干擾及EAG試驗

設(shè)計RNAi試驗沉默目的基因，具體步驟參照T7 RiboMAXTMExpress RNAi System說明書，合成兩對的dsRNA，經(jīng)濃度和質(zhì)量檢測后，保存至-80℃?zhèn)溆谩⒉煞鄯涫占聊竞兄?，饑餓30 min后，飼喂含有dsRNA的30%糖水。每30只蜜蜂作為一個生物學(xué)重復(fù)，共設(shè)置3個重復(fù)。每只蜜蜂的dsRNA飼喂量為8 μg，將蜜蜂置于人工培養(yǎng)箱中。飼喂后24、48、72和96 h分別采樣，經(jīng)RNA提取及反轉(zhuǎn)錄后，利用qRT-PCR技術(shù)檢測的沉默效率。以飼喂30%糖水和ds作為空白對照和陰性對照。

選取熒光競爭結(jié)合試驗中與AcerOBP7結(jié)合能力較強的氣味物質(zhì)于昆蟲觸角電位測量儀（Syntech，荷蘭）上進行EAG試驗。將再次采集的采粉蜂分別飼喂30%糖水和含有dsRNA的30%糖水，選取最佳干擾時間進行EAG試驗。

待測氣味物質(zhì)的終濃度為300 μg·μL-1。剪取長3 cm，寬1 cm條狀濾紙，折疊成“V”形后塞入巴斯德管內(nèi)。調(diào)好EAG系統(tǒng)后，用手術(shù)刀片隨機將蜜蜂一側(cè)觸角自基部切下，輕輕切除觸角兩尖端的小部分，用導(dǎo)電膠將觸角固定在金屬電極上，將安裝好的觸角與氣流端口垂直放置。待屏幕上顯示的基線穩(wěn)定后，吸取10 μL配置好的待測樣品均勻滴加在巴斯德管內(nèi)的濾紙條上（測試前后以液體石蠟為對照）。每次刺激時間為0.5 s，刺激間隔為30 s。每種氣味物質(zhì)至少重復(fù)測定10根觸角。

1.9 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel初步記錄整理后，采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進行分析，兩組間比較采用獨立樣本檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，處理組間兩兩比較采用Duncan法。將數(shù)據(jù)錄入Graphpad Prism 8.0軟件中進行作圖。

2 結(jié)果

2.1 AcerOBP7表達譜分析

在工蜂不同發(fā)育階段觸角中均有表達，且在20日齡的表達量最高，極顯著高于其他日齡（＜0.01）；在1日齡觸角中表達量最低，極顯著低于其他日齡（圖1）。在采集蜂各組織中均能檢測到的表達，但表達量存在顯著差異，其中觸角的表達量最高，極顯著高于其他組織（＜0.01）；除足部外的其他組織均呈微量表達，且表達量差異不顯著（＞0.05）（圖2）。

組間無相同字母表示差異極顯著（P＜0.01）。圖2同

An：觸角Antenna；H：頭Head；T：胸Thorax；B：腹Abdomen；L：足Leg；W：翅Wing

2.2 AcerOBP7的原核表達和純化

重組質(zhì)粒pET28a/AcerOBP7經(jīng)測序鑒定正確無誤后轉(zhuǎn)入表達菌株BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)出目的蛋白。SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白主要以包涵體形式表達，通過尿素變性、純化及透析復(fù)性后用凝血酶切除 His-tag，對切除標簽后的蛋白進行再次純化，純化后的蛋白預(yù)測分子量約為14 kD。電泳結(jié)果顯示在預(yù)期的位置出現(xiàn)單一清晰的條帶，說明分離的蛋白純度較高，可用于后續(xù)熒光競爭結(jié)合試驗（圖3）。

2.3 AcerOBP7的熒光結(jié)合試驗

采用Bradford蛋白濃度測定法測定純化后AcerOBP7的蛋白濃度為0.071 mg·mL-1。通過Scachard方程對AcerOBP7與1-NPN的結(jié)合曲線進行線性化處理，計算出二者的結(jié)合常數(shù)Kd=3.18 μmol·L-1（圖4-a），可以看出目的蛋白與熒光探針間具有較好的結(jié)合活性。測定了AcerOBP7與37種氣味化合物的結(jié)合能力（表2），解離常數(shù)越小，表示蛋白與氣味分子間的結(jié)合能力越強。結(jié)果顯示，AcerOBP7可以與蜂王信息素、告警信息素、那氏信息素及多種植物揮發(fā)性氣味分子結(jié)合，其中，結(jié)合能力最強的是蜂王信息素9-ODA及植物揮發(fā)物1-壬醇，Ki值均為1.85 μmol·L-1，其次AcerOBP7與(+)-檸檬烯、(+)-3-蒈烯、1-辛烯-3-醇、芳樟醇、桉樹腦、反式肉桂酸乙酯及壬醛也有較強的結(jié)合活性，Ki 值分別為1.87、4.14、2.66、2.72、3.88、3.05和 4.40 μmol·L-1，與所測試的7種幼蟲信息素組分無結(jié)合能力。圖4-b為AcerOBP7與部分氣味物質(zhì)的結(jié)合曲線。

M：蛋白分子量標準Protein marker；1：IPTG誘導(dǎo)前pET28a/AcerOBP7 before induced by IPTG；2：IPTG誘導(dǎo)后pET28a/AcerOBP7 after induced by IPTG；3：超聲破碎后離心的上清液Centrifugal supernatant after ultrasonication；4：超聲破碎后離心的沉淀Centrifugal precipitation after ultrasonication；5：蛋白流穿液Protein waste liquid；6：洗雜流穿液Washing waste liquid；7—9：分別為50、100和300 mmol·L-1咪唑溶液洗脫后的AcerOBP7 AcerOBP7 eluted with 50, 100 and 300 mmol·L-1 imidazole solution, respectively；10：切除His標簽后純化的AcerOBP7 Purified AcerOBP7 without His-tag

2.4 RNAi沉默效果

以飼喂dsRNA后24 h糖水組的表達量為基準，分析飼喂不同dsRNA后在不同時間表達量的變化，從而確定最佳干擾條件。由圖5可以看出，設(shè)計的兩個dsRNA片段均能在不同程度上沉默的表達水平。

在飼喂dsRNA 24、48、72和96 h后，的表達量均顯著低于糖水組和ds組（＜0.05）。其中，ds沉默效率更強，且最佳干擾時間為飼喂后48 h，沉默效率達70.63%（圖5）。

a：1-NPN 與AcerOBP7的結(jié)合及Scatchard分析The binding result and relative Scatchard plot of 1-NPN with AcerOBP7；b：AcerOBP7與部分氣味物質(zhì)的競爭結(jié)合曲線Competitive binding curves of AcerOBP7 to some of the odorant compounds

表2 氣味物質(zhì)與AcerOBP7的結(jié)合數(shù)據(jù)

“-”表示不能計算出IC50值“-” indicates that the IC50value can’t be calculated

**：P＜0.01，組間差異極顯著extremely significant differences between groups；*：P＜0.05，組間差異顯著Significant differences between groups。圖6同The same as Fig. 6

2.5 AcerOBP7干擾后的EAG反應(yīng)

根據(jù)熒光競爭結(jié)合試驗的結(jié)果，篩選出(+)-3-蒈烯、1-壬醇、(+)-檸檬烯、芳樟醇、桉樹腦、反式肉桂酸乙酯、1-辛烯-3-醇、壬醛和9-ODA，共9種與AcerOBP7結(jié)合能力較強的氣味物質(zhì)用于后續(xù)EAG試驗。

依據(jù)RNAi干擾效率的分析，選取沉默效率較高的dsRNA片段（ds）及最佳干擾時間（48 h）對目的基因再次進行沉默。結(jié)果顯示（圖6），工蜂觸角對1-辛烯-3-醇和壬醛的反應(yīng)較強烈；與30%糖水組相比，飼喂dsRNA后干擾組的EAG相對值均有所下降，其中，觸角對桉樹腦、1-辛烯-3-醇和9-ODA的EAG值極顯著降低（＜0.01），對壬醛的EAG值顯著降低（＜0.05），說明這4種物質(zhì)與AcerOBP7結(jié)合的特異性較好。

圖6 飼喂dsAcerOBP7后觸角對不同揮發(fā)物的EAG反應(yīng)

3 討論

3.1 AcerOBP7 mRNA在采集蜂觸角中高表達

蜜蜂是真社會性昆蟲，蜂群里的蜂王、雄蜂和工蜂各司其職，分工明確。工蜂隨其日齡增長和外界蜜粉源變化情況執(zhí)行不同的任務(wù)。一般來說，從事巢內(nèi)哺育、清理等工作的工蜂稱為內(nèi)勤蜂，出巢采集花粉、花蜜和水等的工蜂稱為采集蜂[28]。本研究熒光定量分析結(jié)果顯示，在工蜂觸角中的表達量極顯著高于其他組織，與西方蜜蜂同源基因的表達模式一致[13]。另外，在不同發(fā)育階段的工蜂觸角中均有表達，且20日齡時表達量最高。這一時期的工蜂正處于壯年期，采集力旺盛[29]，初步推測在中蜂的采集行為中發(fā)揮作用；在1日齡時表達水平最低，可能是由于蜜蜂嗅覺神經(jīng)元在其羽化后2 d才開始成熟，導(dǎo)致嗅覺基因表達量低[30]。為進一步探討在采集蜂中可能發(fā)揮的作用，測定了其在采集蜂不同組織中mRNA的相對表達量，發(fā)現(xiàn)在采集蜂觸角中表達量極顯著高于其他組織。觸角是昆蟲主要的嗅覺器官[31]，因此推測該基因與采集蜂執(zhí)行嗅覺功能相關(guān)。

3.2 AcerOBP7是一種廣譜型氣味結(jié)合蛋白

昆蟲氣味結(jié)合蛋白（OBP）可以廣泛識別并轉(zhuǎn)運多種類型的氣味化合物。熒光競爭結(jié)合試驗是目前研究OBP結(jié)合特性與功能較基礎(chǔ)和經(jīng)典的方法，在棉鈴蟲、銅綠麗金龜（）、綠盲蝽（）、小菜蛾（）、斑翅果蠅（）等昆蟲中得到了廣泛的應(yīng)用[32-34]。AcerOBP7能夠與蜂王信息素、告警信息素、那氏信息素以及植物揮發(fā)物等多種氣味配體物質(zhì)結(jié)合，表明該蛋白是一種廣譜型結(jié)合蛋白，與先前報道的AcerASP1（AcerOBP1）、AcerOBP10、AcerOBP11、AcerOBP14、AcerOBP15的結(jié)合特性類似，其中AcerASP1與AcerOBP10是以信息素結(jié)合為主的多功能結(jié)合蛋白[25,35-38]。這些對中蜂OBP的研究也印證了一個觀點：同一個OBP基因可能調(diào)控昆蟲對多種揮發(fā)物的識別過程[39]。但是，上述OBP均是在工蜂觸角中表達量較高的基因，在其他組織高表達的OBP是否也具有類似的功能，還有待進一步研究。

在本試驗測試的37種氣味物質(zhì)中，與AcerOBP7結(jié)合能力最強的是9-ODA和1-壬醇，其次為(+)-檸檬烯等植物揮發(fā)物。9-ODA是蜂群中蜂王上顎腺分泌的蜂王信息素的主要活性成分，可以引誘雄蜂的追蹤和交配，吸引工蜂形成侍從圈，抑制工蜂卵巢發(fā)育，還能夠激勵工蜂出巢采集食物[31]；1-壬醇是桉樹蜜等的揮發(fā)物成分之一[40]；(+)-檸檬烯是一種優(yōu)良的天然植物精油[41]。通過熒光競爭結(jié)合試驗結(jié)果推測工蜂通過識別這些氣味物質(zhì)，進而從事采集、哺育蜂王等工作。

3.3 AcerOBP7在中蜂采集和哺育蜂王行為中行使其嗅覺功能

利用RNAi技術(shù)可使靶標基因在mRNA水平被有效沉默，是一種高效的研究基因功能的試驗手段，主要實施方法有注射、浸泡、飼喂等，其中飼喂法是通過給昆蟲飼喂含有人工合成或微生物體內(nèi)合成的dsRNA食物以達到目的基因沉默的方法，該方法對昆蟲機械損傷小，簡便易行[42-43]。RNAi已在黑腹果蠅（）、蜘蛛、布氏錐蟲（）等生物體上得到了廣泛應(yīng)用[44-46]，在蜜蜂功能研究中也相繼采用了該技術(shù)。由于蜜蜂以花蜜為食，各種物質(zhì)可由腸道吸收進入血淋巴，從而使得蜜蜂可以采用飼喂方法實現(xiàn)對目的基因的沉默。有研究表明，通過飼喂dsRNA對意大利蜜蜂進行沉默，目的基因的表達量顯著降低[47]；郭麗娜等[48]通過飼喂不同的dsRNA片段，篩選出了中蜂氣味受體基因的有效干擾序列。本試驗中，飼喂不同片段的dsRNA后，mRNA表達水平與對照組相比顯著降低，說明dsRNA的攝入可以有效干擾目的基因的表達，促進了AcerOBP7的功能研究。

EAG技術(shù)已應(yīng)用于多種昆蟲對環(huán)境中氣味物質(zhì)反應(yīng)強度的檢測試驗[49-51]。為進一步探討的嗅覺生理功能，依據(jù)熒光競爭結(jié)合試驗及RNAi的結(jié)果，測定并分析了中蜂觸角對9種氣味物質(zhì)的EAG數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在飼喂ds后，觸角對桉樹腦、1-辛烯-3-醇、9-ODA和壬醛的EAG反應(yīng)值均顯著性降低，說明這4種物質(zhì)與AcerOBP7之間不僅結(jié)合力較強，而且結(jié)合的特異性較好，很可能為AcerOBP7的配體物質(zhì)。另外，因為9-ODA是蜂王信息素的重要組分，其余3種物質(zhì)為植物揮發(fā)物成分，推測與工蜂出巢采集和哺育蜂王的行為密切相關(guān)。

蜜蜂是自然界中十分重要的授粉昆蟲，其生物學(xué)行為受環(huán)境中多種化學(xué)物質(zhì)的協(xié)同影響，可以通過對蜜蜂OBP功能的研究，將多種單一揮發(fā)性物質(zhì)按比例配置[52-53]，再結(jié)合生物信息學(xué)手段（如分子對接）、行為學(xué)試驗（如趨避或吸引）、大田試驗等，共同探討植物揮發(fā)物或花香物質(zhì)與蜜蜂行為的關(guān)系，從而為蜂群高效飼養(yǎng)及授粉提供新的思路。

4 結(jié)論

在中蜂采集蜂觸角中高表達，且AcerOBP7可以與蜂王信息素9-ODA及多種植物揮發(fā)性物質(zhì)結(jié)合，推測其可能在工蜂采集、飼喂蜂王等行為中發(fā)揮重要作用。蜂王信息素9-ODA和植物揮發(fā)物桉樹腦、1-辛烯-3-醇、壬醛可能是AcerOBP7蛋白的配體分子。

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Expression and binding properties of odorant binding protein AcerOBP7 in

ZHAO HuiTing1*, Peng Zhu1, JIANG YuSuo1, Zhao ShuGuo1, Huang Li1, Du YaLi2, GUO LiNa2

1College of Life Sciences, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi;2College of Animal Science, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi

【Objective】is the indigenous bee of China, which is also one of the important pollinator and economic insect. Odorant binding proteins (OBPs) are the key proteins in the olfactory perception of. Based on the previous analysis about the sequence characteristics of, the present study intends to further research its expression profiles and binding properties, so as to provide basic data for revealing the role of OBPs in the olfactory system of.【Method】In this paper, qRT-PCR was used to detect the spatio-temporal expression characteristics ofAcerOBP7 protein was obtained by prokaryotic expression system, and the recombinant protein was purified using Ni-NTA column. Competitive fluorescence binding method was adopted, with 1-NPN (N-phenyl-1-naphthylamine) was used as a fluorescent probe, to determine the binding affinity of AcerOBP7 with pheromone and plant volatiles. dswas designed and synthesized, and the gene was silenced by feeding method, the silencing efficiency was detected by qRT-PCR. Combined with RNAi method, EAG was conducted to test and compare the difference of response values of AcerOBP7 to the candidate volatiles between the control and RNAi group.【Result】qRT-PCR results showed thatexpressed significantly higher in the antennae of worker bees than that in other tissues (＜0.01), and the expression reached to the highest level at 20-day-old and the lowest at 1-day-old. The pET28a/AcerOBP7 expression vector was successfully constructed, and the high-purity recombinant protein was obtained using theprokaryotic expression system. Fluorescence competition binding assay showed that AcerOBP7 had the strongest binding affinities with 9-ODA and 1-nonanol among 37 ligand molecules, with the Ki values was both 1.85 μmol·L-1, followed by (+)-limonene, 1-octene-3-ol, linalool, trans-ethyl-cinnamate, eucalyptol, (+)-3-carene and nonanal, and the Ki values were 1.87, 2.66, 2.72, 3.05, 3.88, 4.14 and 4.40 μmol·L-1, respectively, while AcerOBP7 had no binding ability with all the tested larval pheromone components.was successfully silenced by feeding dsRNA, and the highest interference efficiency could reach to 70.63%. The results of EAG assay after RNAi showed that the EAG values response to the tested odorant chemicals were all decreased, and the relative EAG values of 1-octen-3-ol, nonanal, eucalyptol and 9-ODA decreased significantly (＜0.05).【Conclusion】is highly expressed in antennae of the forager bees and the recombinant protein can bind to a variety of odor molecules, suggesting that AcerOBP7 is a binding protein with broad spectrum, which may play an important role in the foraging behavior and feeding the queen of the worker bees. In addition, 1-octen-3-ol, nonanal, eucalyptol and 9-ODA are the ligands with high binding specificity to AcerOBP7.

; odorant binding protein (OBP); expression profile; protein purification; binding property

2021-07-28；

2021-08-30

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（31502021）、山西農(nóng)業(yè)大學(xué)校青年科技創(chuàng)新（2019003）

趙慧婷（通信作者），E-mail：zhaohting@126.com。彭竹，E-mail：pzhu66@126.com。趙慧婷和彭竹為同等貢獻作者

（責(zé)任編輯 岳梅）