長期施氮對酸性紫色土氨氧化微生物群落及其硝化作用的影響

鄒溫馨，蘇衛(wèi)華，陳遠(yuǎn)學(xué)，陳新平，郎明

長期施氮對酸性紫色土氨氧化微生物群落及其硝化作用的影響

鄒溫馨1，蘇衛(wèi)華1，陳遠(yuǎn)學(xué)2，陳新平1，郎明1*

1西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院/重慶市土肥資源高效利用重點(diǎn)實驗室，重慶 400715；2四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源學(xué)院，成都 611130

【目的】研究長期施氮對酸性紫色土壤中氨氧化古菌（AOA）和氨氧化細(xì)菌（AOB）群落特征的影響，揭示氨氧化微生物群落的驅(qū)動因子及其調(diào)控硝化作用的微生物學(xué)機(jī)制?！痉椒ā恳劳兴拇ㄑ虐灿衩左w系施氮長期定位試驗（始于2010年），試驗處理包括5個供氮水平，即0（N0）、90（N90）、180（N180）、270（N270）和360（N360）kg N·hm-2，通過Illumina Miseq高通量測序技術(shù)測定AOA和AOB的群落，探究長期施氮對氨氧化微生物群落介導(dǎo)的硝化作用的影響?！窘Y(jié)果】長期施氮影響AOA和AOB的α-多樣性（包括豐富度指數(shù)和香農(nóng)-威納指數(shù)）、群落結(jié)構(gòu)和群落組成。其中，隨著施氮量的增加，AOA 豐富度指數(shù)無顯著變化，香農(nóng)-威納指數(shù)顯著降低，AOB 豐富度指數(shù)和香農(nóng)-威納指數(shù)均顯著增加；長期不同供氮水平顯著影響AOA和AOB的群落結(jié)構(gòu)，供氮水平的增加顯著降低AOB優(yōu)勢類群中Cluster 3a.1的相對豐度（＜0.05），同時顯著增加了Cluster 3a.2、Cluster 9和Cluster 1的相對豐度（＜0.05），而對AOA優(yōu)勢類群無顯著影響。土壤pH、全氮（TN）、有機(jī)質(zhì)（SOM）、NH4+-N和NO3--N均顯著影響AOA和AOB的α-多樣性，其中，pH與AOB 豐富度指數(shù)和香農(nóng)-威納指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01），而與AOA 香農(nóng)-威納指數(shù)呈顯著正相關(guān)，而TN、SOM、NH4+-N和NO3--N與AOB 豐富度指數(shù)和香農(nóng)-威納指數(shù)呈顯著正相關(guān)，與AOA 香農(nóng)-威納指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)。同時，pH、TN、NO3--N、SOM 和NH4+-N顯著影響AOA和AOB的群落結(jié)構(gòu)（＜0.05）。結(jié)構(gòu)方程模型（SEM）的結(jié)果表明，長期施氮通過降低土壤pH、提高TN和NO3--N含量、改變AOA和AOB的α-多樣性和群落結(jié)構(gòu)，進(jìn)而提高了土壤的硝化勢。【結(jié)論】長期施氮通過改變酸性紫色土壤pH、TN、NH4+-N和NO3--N和氨氧化微生物的α-多樣性和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響了硝化勢。

酸性紫色土；供氮水平；氨氧化細(xì)菌；氨氧化古菌；硝化勢

0 引言

【研究意義】微生物介導(dǎo)的硝化作用是氮素循環(huán)和植物獲得營養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)，它聯(lián)系著礦化、生物固持、氮損失等有關(guān)的一系列過程。硝化作用能為植物提供可利用的氮形態(tài)，維持生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定性，但是同時土壤硝化過程也是氮素?fù)p失的重要原因[1]。氨氧化古菌（AOA）和氨氧化細(xì)菌（AOB）是氨氧化過程[2]（硝化作用的第一步，也是限速步驟）主要的貢獻(xiàn)者，兩者在大多數(shù)土壤中共存。集約化農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中，供氮水平是影響氨氧化微生物α-多樣性、群落結(jié)構(gòu)和群落組成的重要因素之一，酸性紫色土受到酸化的強(qiáng)烈影響，長期施氮作用進(jìn)一步加劇了這一進(jìn)程，進(jìn)而影響了硝化作用，這一系列過程是連續(xù)的。因此，研究長期施氮對酸性紫色土壤中AOA和AOB群落特征的影響，揭示氨氧化微生物群落的驅(qū)動因子及其調(diào)控硝化作用的微生物學(xué)機(jī)制，有助于從微生物學(xué)角度探究長期施用不同水平氮肥造成的影響，為高效利用微生物提高氮素的利用率提供依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】施氮顯著改變了土壤性質(zhì)，影響了AOA和AOB的α-多樣性和群落特征[3-4]。之前的研究表明，AOA適宜生存在酸性[5]和氮受限的環(huán)境[6-7]，而AOB適宜生存在堿性[8]和氮富集環(huán)境[9-10]。前人研究認(rèn)為長期施氮會降低土壤中細(xì)菌的α-多樣性[11-12]，但是對于功能微生物多樣性的影響結(jié)果并不一致。35年中性沉積土長期施肥研究表明，施氮（525 kg N·hm-2·a-1）改變了土壤銨態(tài)氮濃度影響了AOA的α-多樣性，土壤pH的改變是影響AOB α-多樣性的主要影響因素[13]。而在堿性黑壚土中長期（24年）單施氮肥后增加了土壤中底物濃度，增加了土壤中AOB的多樣性（香農(nóng)-威納指數(shù)和豐富度），降低了AOA的多樣性[14-15]。酸性稻田土壤中長期施肥（22年）顯著改變了AOB的群落結(jié)構(gòu)，而對AOA群落結(jié)構(gòu)的影響較小[16]。TAO等[17]的研究表明，AOA和AOB的群落結(jié)構(gòu)都與施氮引起的有機(jī)質(zhì)改變密切相關(guān)。SONG等[18]研究發(fā)現(xiàn)，9年連續(xù)過量施用氮肥造成土壤酸化，其中AOA 和AOB 群落結(jié)構(gòu)均受到土壤酸化的強(qiáng)烈影響。6年長期施氮土壤由中性（pH=7.21）轉(zhuǎn)變?yōu)樗嵝裕╬H=6.13），并且施氮導(dǎo)致土壤pH的改變強(qiáng)烈影響AOB群落組成，對AOA群落組成的影響較小[19]。酸性（pH=4.66）紅壤中，長期（27年）施用氮肥（最高施氮量：120 kg N·hm-2·a-1）降低了土壤中pH，限制了底物（NH3）的釋放從而主要影響AOA的群落組成，對AOB的群落組成影響不大[20]。旱地土壤中長期施肥增加土壤全氮含量，顯著提高土壤硝化勢[21]；堿性砂壤土長期施用礦質(zhì)氮肥主要由于增加了有效態(tài)氮（NH4+-N）從而提高土壤硝化勢；但也有研究表明長期施氮通過降低土壤pH從而降低了土壤硝化勢[22]。研究還發(fā)現(xiàn)，長期（31年）的潮土中小麥-玉米輪作田間試驗表明，硝化勢與AOB的群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，而與AOA的群落結(jié)構(gòu)無顯著相關(guān)[23]。氨氧化微生物群落組成與硝化勢也呈顯著正相關(guān)[24]。但是關(guān)于長期施氮后土壤性質(zhì)的改變對氨氧化微生物群落特征的影響及其與土壤硝化勢關(guān)系的研究還不充分。紫色土土壤肥力高，是我國西南地區(qū)特有且重要的農(nóng)業(yè)土壤資源，四川盆地的紫色土面積占全國紫色土總面積的90%以上[25-26]。在紫色土中氮肥投入量高，土壤中的無機(jī)氮以硝態(tài)氮為主[27]，同時，區(qū)域氣候高溫、降水量多的特性導(dǎo)致土壤中硝態(tài)氮大量淋洗，氮損失和氮污染嚴(yán)重[28-29]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】關(guān)于開展長期施用不同水平氮肥后AOA和AOB群落特征、影響AOA和AOB群落變化的驅(qū)動因子以及對硝化過程調(diào)控作用的研究在酸性土壤中并不充分，需要深入探究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以四川雅安酸性紫色土為對象，基于9年的長期施氮管理，探究長期施氮對酸性土壤玉米體系中硝化作用的影響，揭示氨氧化微生物群落的驅(qū)動因子及其調(diào)控硝化作用的微生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

該試驗于四川雅安玉米體系施氮長期定位試驗（始于2010年）進(jìn)行，當(dāng)?shù)貙儆趤啛釒Ъ撅L(fēng)氣候，土壤類型為紫色濕潤雛形土。土壤基本理化性質(zhì)為全氮（TN）含量1.28 g·kg-1，有機(jī)質(zhì)（SOM）29.8 g·kg-1，pH 6.27，速效鉀71.2 mg·kg-1，有效磷35.9 mg·kg-1[30]。2010—2013 年為小麥/玉米/大豆間套作體系，設(shè)有5個供氮水平，小麥季施氮量分別為 0、60、120、180、240 kg·hm-2，玉米季施氮量分別為 0、97.5、195.0、292.5、390 kg·hm-2。磷肥（P2O512.5%）在小麥季和玉米季用量分別為90和75 kg·hm-2，鉀肥（K2O 60%）在小麥季和玉米季用量分別為90和105 kg·hm-2，大豆季不施肥。2014—2015年種植體系為單季玉米，肥料用量與之前玉米季試驗相同。2016—2018年為單季玉米體系，試驗設(shè)5個氮水平，施氮量分別為 0、90、180、270和360 kg N·hm-2（分別記為N0、N90、N180、N270和N360）。5個供氮（N）水平中單個氮水平為一個大區(qū)，大區(qū)內(nèi)共設(shè)置3個小區(qū)，大區(qū)之間間隔 2 m，小區(qū)之間無間隔，每個小區(qū)面積為 18 m2（2 m×9 m）。種植玉米品種為仲玉3號，玉米于2018年4月18日播種，同年9月15日收獲。所用氮肥類型為尿素，磷肥類型為過磷酸鈣，用量為 P2O575 kg·hm-2，鉀肥類型為硫酸鉀，用量為 K2O 105 kg·hm-2。施用30% 氮肥和所有磷、鉀肥作為底肥；拔節(jié)期追施30%氮肥，大喇叭口期追施40%氮肥。

1.2 土樣采集及理化特性的測定

2018年12月15日采集耕層（0—30 cm）土壤樣品，每個小區(qū)至少采集5個土壤位點(diǎn)作為一個混合樣品。新鮮土樣采集后放入盛有干冰的冰盒帶回實驗室，移去細(xì)小根系及有機(jī)物殘體后，新鮮土樣-80℃保存，用于土壤微生物群落、土壤水分、土壤硝態(tài)氮（NO3--N）和銨態(tài)氮（NH4+-N）的測定。風(fēng)干過篩的土樣用于pH、TN和SOM的測定。

以土水比為1﹕2.5用pH計（pHS-3C）測定pH，TN使用改進(jìn)克氏法和外加熱法測定，SOM使用重鉻酸鉀容量法-外加熱法滴定。土壤水分在105℃下烘至恒重后測定；新鮮土樣加入0.01 mol·L-1CaCl2振蕩浸提，過濾后用流動分析儀（Auto-Analyzer III，Bran + Luebbe，Norderstedt，Germany）測定土壤NO3--N和NH4+-N含量。以上各個指標(biāo)的測定和分析方法參照《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》[31]。

土壤硝化勢（potential nitrification rate）采用氯酸鹽抑制法進(jìn)行測定[32]。具體操作步驟如下：稱取5.0 g新鮮土壤樣品于50 mL三角瓶中，加入20 mL含有1 mmolL-1(NH4)2SO4和 10 mmol·L-1的 PBS 緩沖液（NaCl8.0 g·L-1、KCl 0.2 g·L-1、Na2HPO40.2 g·L-1、NaH2PO40.2 g·L-1、調(diào)節(jié)緩沖液pH至7.4），并加入20 mL 20 mmol·L-1的KClO3溶液，最終KClO3濃度為10 mmol·L-1，抑制亞硝酸鹽氧化。在 25℃條件下于黑暗處培養(yǎng) 24 h后，向三角瓶中加入10 mL 2 mol·L-1的 KCl 溶液，振蕩1 h，過濾后的浸提液，加入顯色劑，靜置20 min后，在2 h內(nèi)用紫外分光光度計在波長 540 nm的條件下測定吸光度值。硝化勢即為24 h培養(yǎng)過程中NO2--N的累積量。

1.3 土壤DNA 抽提和PCR擴(kuò)增

采用TIANGENTMSoil DNA Isolation Kit（Tiangen Biotech Co. Ltd.，Beijing，China）試劑盒提取土壤DNA，使用NanoDrop2000檢測DNA濃度與純度，同時通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量；使用PCR儀（ABI GeneAmp? 9700型）對AOA，AOB amoA 基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，AOA，AOB amoA 基因引物序列分別為：amoAF（5′-STAATGGTCTGGCTTA GACG-3′）/amoAR（5′-GCGGCCATCCATCTGTAT GT-3′）[33]和bamoA1F（5′-GGGGTTTCTACTGG TGGT-3′）/bamoA-2R（5′-CCCCTCKGSAAAGCCTT CTTC-3′）[34]。擴(kuò)增體系共20 μL，包含4 μL 5×FastPfu 緩沖液，2 μL 2.5 mmol·L-1dNTPs，0.8 μL 引物（5 μmol·L-1），0.4 μL FastPfu 聚合酶和10 ng DNA模板，其余加ddH2O補(bǔ)至20 μL。擴(kuò)增程序為：95℃預(yù)變性3 min，35個循環(huán)（95℃變性30 s，55℃退火30 s, 72℃延伸30 s），最后72℃延伸 10 min。

1.4 Illumina Miseq 測序

使用1%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，采用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit （Axygen Biosciences, Union City, CA, USA）進(jìn)行純化，Tris-HCl洗脫，1%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluor?-ST （Promega，USA）進(jìn)行檢測定量。按照Illumina MiSeq平臺（Illumina，San Diego，USA）標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2×300的文庫。最后使用Illumina公司的Miseq PE300平臺進(jìn)行測序，原始測序序列進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控，使用FLASH軟件進(jìn)行拼接，序列基于＞97%相似性水平，歸為一個操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）[35-36]。對序列進(jìn)行OTU聚類，并進(jìn)行注釋分析。原始數(shù)據(jù)提交到NCBI（National Center for Biotechnology Information）數(shù)據(jù)庫，序列號為PRJNA563795。

1.5 數(shù)據(jù)分析

土壤理化性質(zhì)（pH，TN，SOM，NH4+-N和NO3--N），AOA和AOB的α-多樣性，群落組成使用SPSS（21.0）進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），并利用Duncan法進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性檢驗。使用置換多元方差分析（Permutational multivariate analysis of variance，PERMANOVA）檢驗理化性質(zhì)與氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)之間關(guān)系的顯著性。

AOA和AOB的α-多樣性（sobs指數(shù)和香農(nóng)-威納指數(shù)）使用QIIME（quantitative insights into microbial ecology）計算。AOA和AOB群落結(jié)構(gòu)使用QIIME計算距離矩陣（基于Bray-Curtis算法），再使用R軟件（3.2.1）中“vegan”包進(jìn)行主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis，PCoA）。冗余分析（redundancy analysis，RDA）和熱圖（heatmap）分別用R軟件中“vegan”和“heatmap”包進(jìn)行計算。采用MEGA（7.0）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，使用Kimura 2-parameter距離模型，Bootstrap設(shè)為1000，使用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。采用AMOS軟件（IBM SPSS AMOS 24.0.0）構(gòu)建結(jié)構(gòu)方程模型（SEM）。以PCoA分析的第一主成分（PC1）作為AOA和AOB群落結(jié)構(gòu)的指標(biāo)，以sobs指數(shù)表示AOA和AOB的 α-多樣性。該模型基于已知因素之間的影響和關(guān)系，用最大似然估計法擬合模型[37]。模型使用擬合優(yōu)度指數(shù)（goodness-of-fit index，GFI；GFI≥0.90表示模型擬合較好），近似誤差均方根（root-mean-square error of approximation，RMSEA；RMSEA＜0.01表示擬合良好，如果RMSEA=0，表示模型完全擬合），擬合優(yōu)度的卡方檢驗（χ2goodness-of-fit test，χ2常與自由度df一起使用，χ2/df愈接近1，表示模型擬合愈好）進(jìn)行檢驗[38]。

2 結(jié)果

2.1 長期施氮對土壤理化性質(zhì)和硝化勢的影響

土壤全氮和有機(jī)質(zhì)含量隨施氮量的增加顯著增加，土壤pH隨施氮量的增加顯著降低，銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量隨施氮量的增加也顯著升高（表1）。施氮后土壤中硝化勢相比于不施氮土壤稍有增加，4個供氮水平之間無顯著差異（圖1）。

表1 不同施氮處理基本理化性質(zhì)

數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3。數(shù)據(jù)后的不同小寫字母表示施氮處理間差異顯著（＜0.05）。N0、N90、N180、N270和N360 分別表示施氮量為0、90、180、270和360 kg N·hm-2。下同

The value is the mean±standard deviation, n=3. Difference lowercase letters indicate the significant difference of different nitrogen application treatments (＜0.05). N0, N90, N180, N270, N360 indicate N application rate are 0, 90, 180, 270, 360 kg N·hm-2, respectively. The same as below

柱形圖上方的不同字母表示處理之間的顯著差異（P＜0.05）

2.2 長期施氮對土壤中AOA和AOB的α-多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響

AOA豐富度（sobs指數(shù)）隨施氮水平增加無顯著差異（圖2-A），施氮處理的AOB sobs指數(shù)較 N0處理顯著增加，N90、N180、N270、N360處理的sobs指數(shù)較N0處理分別增加了27.1%、29.7%、40.7%和37.3%（圖2-B）。AOA的香農(nóng)-威納指數(shù)隨施氮量的增加顯著降低（圖2-C）；而AOB的香農(nóng)-威納指數(shù)隨施氮量的增加顯著增加，N180、N270和N360處理香農(nóng)-威納指數(shù)顯著高于N0和N90處理（圖2-D）。

主坐標(biāo)分析（OTU水平）結(jié)果表明不同施氮處理中AOA，AOB群落結(jié)構(gòu)都具有顯著差異（PERMANOVA，AOA：2=0.75，= 0.001，AOB：2=0.68，=0.001）（圖3），且AOA，AOB群落分布相似，除N180和N270外，其他各處理間群落結(jié)構(gòu)差異顯著。

2.3 長期施氮對土壤中AOA和AOB群落組成的影響

基于優(yōu)勢OTU（相對豐度＞1%）構(gòu)建的AOA和AOB系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，本研究中AOA和AOB優(yōu)勢OTU各有11個。AOA的優(yōu)勢amoA OTU序列均屬于Group I.1b（圖4-A），主要分為4個分支：Clade A、Clade B3、Clade E、Clade，其中Clade A包含6個優(yōu)勢OTU，占AOA總OTU的74.3%—86.0%，但是，這4個分支在不同施氮處理條件下無顯著差異（圖4-B）。AOB 的優(yōu)勢amoA OTU序列均屬于屬，主要分為6個簇，Cluster 3a.1、Cluster 9、Cluster 11、Cluster 1、Cluster 3a.2和Cluster 3c（圖4-C）；AOB群落組成隨著施氮量的增加發(fā)生顯著變化，N0處理優(yōu)勢菌是Cluster 3a.1，占比為86.3%，隨著施氮量的增加，N180、N270和N360處理的Cluster 3a.1相對豐度顯著減少，占比分別是31.0%、22.0%和38.33%，而Cluster 9、Cluster 3a.2和other Clusters相對豐度在N180、N270、N360處理條件下顯著增加；Cluster11相對豐度隨施氮量增加無顯著差異，Cluster 1相對豐度在N180和N270處理最高，Cluster 3c相對豐度在N270處理增加（圖4-D）。

圖2 不同施氮量對AOA、AOB豐富度指數(shù)（A，B）和香農(nóng)-威納指數(shù)（C，D）的影響

圖3 不同施氮量AOA（A）和AOB群落（B）的主坐標(biāo)分析

2.4 長期施氮條件下，氨氧化微生群落特征的驅(qū)動因素及其與硝化勢的關(guān)系

Pearson相關(guān)性分析表明，AOB香農(nóng)-威納指數(shù)與pH呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01），與TN、NH4+-N、NO3--N含量呈顯著正相關(guān)（＜0.01），與SOM呈顯著正相關(guān)（＜0.05）。AOA香農(nóng)-威納指數(shù)與pH呈顯著正相關(guān)（＜0.01），與TN、SOM、NO3--N含量呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01），與NH4+-N含量呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05）。AOB 豐富度指數(shù)與pH呈極顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01），與NO3--N含量（＜0.01），其次是SOM，TN含量，NH4+-N含量（＜0.05）呈正相關(guān)。AOA 豐富度指數(shù)與環(huán)境因子無顯著相關(guān)性（表2）。

*和**分別表示顯著相關(guān)性為＜0.05和＜0.01

*and ** Respectively indicate the significant correlation is＜0.05 and＜0.01; PNR: Potential nitrification rate

Other，表示相對豐度＜1%的OTU，AOB群落組成中不同施氮處理中Cluster 3c 顯著性無明顯差異，在N0、N90、N180、N270處理未標(biāo)注

冗余分析（RDA）結(jié)果表明，RDA1軸和RDA2軸分別解釋了環(huán)境因子與土壤AOA群落結(jié)構(gòu)關(guān)系總差異的49.30%和13.84%；另外，AOB群落結(jié)構(gòu)的主要變異分布在RDA1軸，占總變異量的71.64%。pH（2=0.78，=0.001）、TN含量（2=0.64，=0.003）、NO3--N含量（2=0.59，=0.004）、SOM和NH4+-N含量（2=0.49，=0.021；2=0.51，=0.013）顯著影響了AOA群落結(jié)構(gòu)（圖5-A）。pH（2=0.85，=0.001）、TN含量（2=0.72，=0.001）、NO3--N含量（2=0.63，=0.004）、SOM含量（2=0.55，=0.012）和NH4+-N含量（2=0.41，=0.038）也顯著影響了AOB群落結(jié)構(gòu)（圖5-B）。

AOA和AOB群落組成和環(huán)境變量相關(guān)性熱圖分析表明，AOA群落組成與環(huán)境因素?zé)o顯著相關(guān)性（圖6-A）。AOB群落組成中，Cluster 3a.1與pH呈極顯著正相關(guān)（＜0.001），與TN含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（＜0.001），與SOM、NH4+-N、NO3--N含量呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01）。Cluster 9與pH呈極顯著負(fù)相關(guān)（＜0.001），與NO3--N含量呈極顯著正相關(guān)（＜0.001），與SOM、TN、NH4+-N含量呈顯著正相關(guān)（＜0.01）。Cluster 3a.2與NH4+-N含量呈極顯著正相關(guān)（＜0.001），與pH呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01），與TN、NO3--N含量都呈顯著正相關(guān)關(guān)系（＜0.01）。other與pH呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01），與TN、NH4+-N、NO3--N含量都呈顯著正相關(guān)關(guān)系（＜0.01），與SOM呈顯著正相關(guān)（＜0.05）。Cluster 1，Cluster 3c與pH呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05），與TN含量呈顯著正相關(guān)（＜0.05），Cluster 11僅與pH呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05）（圖6-B）。

TN：全氮，SOM：有機(jī)質(zhì)，NH4+-N：銨態(tài)氮，NO3--N：硝態(tài)氮。顯著性：*表示 0.01＜P＜0.05，** 表示0.001＜P＜0.01，*** 表示P＜0.01

AOA，AOB群落組成與環(huán)境變量進(jìn)行spearman相關(guān)性分析，other，表示相對豐度＜1%的OTU。*表示 0.01＜P＜0.05，** 表示0.001＜P＜0.01，*** 表示P＜0.001

Person相關(guān)性分析表明AOA Sobs指數(shù)和硝化勢呈顯著正相關(guān)（表3）。但AOA和AOB的群落組成與硝化勢無顯著相關(guān)（表4）。用結(jié)構(gòu)方程模型（SEM）探究了長期施氮對環(huán)境因子、氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)、α-多樣性（豐富度指數(shù)）和硝化勢的綜合效應(yīng)（圖7）。SEM很好地擬合了數(shù)據(jù)（χ2=10.36，df=15，CFI=1.000，NFI=0.945，IFI=1.027，RMSEA＜0.001）。結(jié)果表明，施氮量對環(huán)境因子（pH，TN，NO3--N）有顯著影響（路徑系數(shù)分別是0.87，0.89，0.94），其中，pH顯著影響了AOB的群落結(jié)構(gòu)。TN對AOA群落的α-多樣性存在顯著負(fù)效應(yīng)，而NO3--N則有顯著正效應(yīng)。不同施氮處理主要通過改變pH、TN和NO3--N進(jìn)而影響了AOA和AOB的α-多樣性和AOB的群落結(jié)構(gòu)，調(diào)控了土壤中硝化勢的改變。

表3 AOA、AOB的α-多樣性與硝化勢的Pearson相關(guān)性分析

*表示顯著相關(guān)性為＜0.05 * Indicates a significant correlation is＜0.05

表4 AOA、AOB優(yōu)勢屬（相對豐度＞1%）與硝化勢的Pearson相關(guān)性分析

箭頭的寬度表示因果效應(yīng)的強(qiáng)度。紅色和藍(lán)色箭頭分別表示各指標(biāo)之間的正、負(fù)關(guān)系。箭頭上面的數(shù)字表示路徑系數(shù)（P＜0.05為顯著路徑）。實線和虛線分別表示顯著路徑和非顯著路徑。每個指標(biāo)上方的百分?jǐn)?shù)表示R2值，即每個變量的方差解釋比例。最終模型與數(shù)據(jù)擬合良好，模型為：χ2=10.28，df=14，CFI=1.000，NFI=0.946，IFI=1.021，RMSEA＜0.001

3 討論

3.1 長期施氮對氨氧化微生物群落特征的影響

隨施氮量增加，AOA豐富度指數(shù)無差異，香農(nóng)-威納指數(shù)顯著降低，但顯著增加了AOB豐富度指數(shù)和香農(nóng)-威納指數(shù)。這與ZHANG等[39]在酸性土壤中施氮降低了AOB群落的α-多樣性而增加AOA群落的α-多樣性的研究結(jié)果不同；但是LIU等[40]研究表明隨著施氮量的增加，AOA 香農(nóng)-威納指數(shù)無顯著差異，說明AOA對氮投入的響應(yīng)存在不同。另外，高氮處理顯著增加了土壤有機(jī)質(zhì)和有效態(tài)氮的含量，而之前的研究表明AOB在氮富集的環(huán)境中發(fā)揮重要的作用[7,41]，這也是土壤中AOB群落的α-多樣性顯著升高的原因之一。也有研究指出AOB物種多樣性隨施氮量的增加而增加，可能是由于原始土壤中AOB物種密度較低所致[42]。

不同的施氮處理對AOA的群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響（圖3-A）。與以往在酸性土壤中的研究結(jié)果相似，即長期施氮對AOA群落結(jié)構(gòu)影響較大[43-44]。同時，不同施氮處理顯著影響了AOB的群落結(jié)構(gòu)（圖3-B）。主要原因可能是雖然隨著施氮量的增加，降低了土壤的pH，但最低仍可達(dá)到6.0左右的弱酸性環(huán)境，同時，施氮量的增加顯著提高了土壤全氮和有機(jī)質(zhì)的含量（表1），表明除pH的影響外，AOB群落結(jié)構(gòu)的改變依然受到土壤中氮有效性，全氮和有機(jī)質(zhì)的含量的驅(qū)動。在TANG等[45]的研究中發(fā)現(xiàn)TN和NO3--N都顯著影響了酸性水稻土中AOA和AOB的群落結(jié)構(gòu)。因此，土壤中氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)的改變受土壤理化性質(zhì)中各因素的協(xié)同影響。

隨施氮量增加AOBCluster3a.1相對豐度顯著減少（圖4-D），說明Cluster 3a.1在貧營養(yǎng)環(huán)境下富集并占優(yōu)勢，這在酸性蔬菜土壤上（pH=5.89）也發(fā)現(xiàn)了同樣的趨勢[22]。同樣，我們的結(jié)果與GUO等[13]在小麥-玉米輪作系統(tǒng)中的研究結(jié)果相似，即CK處理中Cluster 3a.1相對豐度最高，而Cluster 3a.2相對豐度在施氮處理中增加。本研究結(jié)果表明，Cluster 9相對豐度在N180、N270、N360處理顯著增加（圖5-D），長期施肥的酸性旱地土壤的研究結(jié)果也顯示Cluster 9占據(jù)重要位置[20]，推測pH可能是影響Cluster 9的主要環(huán)境因素。不同施氮量對AOA的群落組成影響不顯著，即使Clade A相對豐度最高，但是有研究結(jié)果也表明Clade A幾乎沒有硝化活性[46]，也可能是Clade A生態(tài)位更加寬泛[47]。不同施氮處理對Clade E相對豐度無顯著影響，可能是由于Clade E具有廣泛的活性和適應(yīng)性，因為其在土壤、鹽沼、河流沉積物中均有分布[48]。

3.2 長期施氮影響氨氧化微生物群落特征的驅(qū)動因子

長期施氮加劇酸性紫色土壤酸化，但是提高了土壤中的養(yǎng)分含量（表1）。AOB 豐富度指數(shù)、香農(nóng)-威納指數(shù)與pH呈顯著負(fù)相關(guān)，與TN、SOM、NH4+-N和NO3--N呈顯著正相關(guān)（表2），說明即使在酸性土壤中，養(yǎng)分的投入有助于提高AOB多樣性，證實了在富營養(yǎng)條件下有利于AOB生長。研究表示AOA在低pH和低底物濃度的環(huán)境中占主導(dǎo)地位[49-50]，研究結(jié)果表明養(yǎng)分增加共同效應(yīng)強(qiáng)于pH的降低，使得AOA失去了競爭生態(tài)位的有利條件。

本研究的結(jié)果表明長期施氮導(dǎo)致pH的降低是同時且強(qiáng)烈影響AOA和AOB群落結(jié)構(gòu)的重要驅(qū)動因子（圖4，圖7），面對復(fù)雜的土壤環(huán)境，AOA，AOB有不同的響應(yīng)，其中pH是影響AOA，AOB生態(tài)位重要驅(qū)動力[8]。JIANG等[51]認(rèn)為土壤pH對稻田氨氧化菌群落結(jié)構(gòu)的形成也起著重要作用。WERTZ 等表明無機(jī)氮含量與酸性森林土壤中AOB群落結(jié)構(gòu)顯著相關(guān)，且強(qiáng)于無機(jī)氮含量對AOA的群落結(jié)構(gòu)的影響[52]。李晨華等[53]研究表明，土壤TN含量是長期施肥中影響表層土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)的最重要的因素。養(yǎng)分增加和pH對AOA和AOB群落結(jié)構(gòu)的影響都起著重要的作用。

氨氧化微生物群落組成和環(huán)境因素相關(guān)性結(jié)果表明AOA的群落組成與環(huán)境變量影響并不顯著，而AOB群落組成與環(huán)境變量顯著相關(guān)（圖6），可能是因為紫色土長期施氮pH仍維持在6.0左右，并未限制底物的釋放，使得AOB比AOA占據(jù)更重要的位置。研究結(jié)果表明所有AOA優(yōu)勢屬都屬于，培養(yǎng)試驗結(jié)果顯示中所有培養(yǎng)的AOA都是嗜中性的，當(dāng)pH低于5.5時，這些AOA的硝化活性顯著降低，甚至不存在[54-55]。AOB中Cluster 3a.1與Cluster 3a.2對環(huán)境變量的反應(yīng)完全不同，研究表明Cluster 3a.2比Cluster 3a.1對高NH4+環(huán)境更敏感，更適應(yīng)富營養(yǎng)環(huán)境[13, 56]。pH是唯一影響AOB所有優(yōu)勢屬的環(huán)境因素，之前的研究也提到pH對氨氧化微生物群落組成有重要作用[57-58]。同時，長期施氮導(dǎo)致養(yǎng)分的增加，增加了AOB多數(shù)優(yōu)勢屬的相對豐度，說明在酸性土壤中，AOB與氨氧化所必需的營養(yǎng)基質(zhì)之間存在密切關(guān)系。

3.3 長期施氮條件下氨氧化微生物與硝化勢的關(guān)系

之前關(guān)于長期施氮條件下氨氧化微生物與硝化勢（PNR）關(guān)系的研究較少，研究主要集中在土壤理化性質(zhì)與硝化勢的直接關(guān)系。SONG等[18]和DUAN等[59]研究結(jié)果表明酸性土壤中pH和NO3--N都是顯著影響PNR的環(huán)境因素，與本研究得到的結(jié)果一致（表2）?？赡苡捎趐H和NO3--N對硝化勢的顯著正影響，導(dǎo)致硝化勢變化趨勢的微弱增加。本研究SEM結(jié)果發(fā)現(xiàn)理化性質(zhì)改變不同程度地影響了土壤中氨氧化微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性，其中氨氧化微生物多樣性與PNR顯著相關(guān)（圖7）。然而，在酸性棕壤中的研究發(fā)現(xiàn)PNR與AOB和AOA的多樣性均無顯著相關(guān)，這與我們的結(jié)果不同。在長期（9年）過量施氮種植蔬菜的土壤中，當(dāng)土壤pH為5.6—7.0時，AOB主要影響硝化勢，而當(dāng)土壤pH低于5.0，硝化勢的變化主要是由AOA造成[18]。在種植茶樹的酸性土壤中，12年長期過量施氮顯著而間接地影響硝化勢，長期施用氮肥增加了AOB而不是AOA對硝化勢的貢獻(xiàn)[60]。之前的研究表明，AOA在酸性土壤中對硝化勢具有更重要的影響[5]，而我們的試驗結(jié)果中AOA、AOB都對硝化作用產(chǎn)生顯著影響，可能由于長期施氮造成pH降低及TN、NO3--N增加的雙重影響在弱酸性紫色土中發(fā)揮同等重要的作用。

另外，近年來全程氨氧化微生物（comammox）的發(fā)現(xiàn)也改變了AOA和AOB在硝化作用中的地位。有研究表明，貧營養(yǎng)環(huán)境和一些極端環(huán)境對comammox生長更為有利[61]，因此未在我們的研究中進(jìn)行測定。除此之外，隨著技術(shù)的發(fā)展，使用DNA-SIP技術(shù)探究活性氨氧化微生物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)特征，宏基因組學(xué)技術(shù)挖掘更多關(guān)于氨氧化微生物的特征和信息也值得未來去探究。

4 結(jié)論

在酸性紫色土中，隨施氮量的增加，AOB群落的α-多樣性（香農(nóng)-威納指數(shù)和豐富度指數(shù)）顯著提高，AOA群落的香農(nóng)-威納指數(shù)降低，豐富度指數(shù)無顯著影響；不同施氮量顯著影響AOA和AOB的群落結(jié)構(gòu)和組成。其中，隨著施氮量的增加，AOB優(yōu)勢類群中Cluster 3a.1的相對豐度顯著降低，Cluster 3a.2、Cluster 9和Cluster 1的相對豐度顯著增加，而AOA優(yōu)勢類群中的Clade A、Clade B3和Clade等相對豐度的變化無明顯規(guī)律。綜合分析表明，長期施氮通過降低土壤pH、提高土壤中全氮和NO3--N含量，改變AOA和AOB群落的α-多樣性和群落結(jié)構(gòu)以及AOB的群落組成，進(jìn)而提高了土壤的硝化勢。

[1] BEECKMAN T, BEECKMAN F, MOTTE H. Nitrification in agricultural soils: impact, actors and mitigation. Current Opinion in Biotechnology, 2018, 50: 166-173.

[2] MARTENS-HABBENA W, BERUBE P M, URAKAWA H, TORRE J R D L, STAHL D A. Ammonia oxidation kinetics determine niche separation of nitrifying archaea and bacteria. Nature, 2009, 461(7266): 976-979.

[3] HAN J P, SHI J C, ZENG L Z, XU J M, WU L S. Impacts of continuous excessive fertilization on soil potential nitrification activity and nitrifying microbial community dynamics in greenhouse system. Journal of Soils and Sediments, 2017, 17: 471-480. doi: 10.1007/ s11368-016-1525-z.

[4] JIA Z J, HU X J, XIA W W, FORNARA D, NANNIPIERI P, TIEDJE J. Community shift of microbial ammonia oxidizers in air-dried rice soils after 22 years of nitrogen fertilization. Biology and Fertility of Soils, 2019, 55: 419-424.

[5] YAO H Y, GAO Y M, NICOL G W, CAMPBELL C D, PROSSER J I, ZHANG L M, HAN W Y, SINGH B K. Links between ammonia oxidizer community structure, abundance, and nitrification potential in acidic soils. Applied and Environmental Microbiology, 2011, 77(13): 4618-4625.

[6] WANG B Z, ZHAO J, GUO Z Y, MA J, XU H, JIA Z J. Differential contributions of ammonia oxidizers and nitrite oxidizers to nitrification in four paddy soils. The Isme Journal, 2015, 9(5): 1062-1075.

[7] PROSSER J I, NICOL G W. Archaeal and bacterial ammonia- oxidizers in soil: The quest for niche specialization and differentiation. Trends in Microbiology, 2012, 20(11): 523-531.

[8] HU H W, ZHANG L M, DAI Y, DI H J, HE J Z. pH-dependent distribution of soil ammonia oxidizers across a large geographical scale as revealed by high-throughput pyrosequencing. Journal of Soils and Sediments. 2013(8), 13: 1439-1449.

[9] DI H J, CAMERON K C, SHEN J P, WINEFIELD C S, O’ CALLAGHAN M, BOWATTE S, HE J Z. Nitrification driven by bacteria and not archaea in nitrogen-rich grassland soils. Nature Geoscience, 2009, 2(9): 621-624.

[10] OUYANG Y, NORTON J M, STARK J M, REEVE J R, HABTESELASSIE M Y. Ammonia-oxidizing bacteria are more responsive than archaea to nitrogen source in an agricultural soil. Soil Biology and Biochemistry, 2016, 96: 4-15.

[11] ZENG J, LIU X J, SONG L, LIN X G, ZHANG H Y, SHEN C C, CHU H Y. Nitrogen fertilization directly affects soil bacterial diversity and indirectly affects bacterial community composition. Soil Biology and Biochemistry, 2016, 92: 41-49.

[12] WANG F H, CHEN S M, WANG Y Y, ZHANG Y M, HU C S, LIU B B. Long-term nitrogen fertilization elevates the activity and abundance of nitrifying and denitrifying microbial communities in an upland soil: implications for nitrogen loss from intensive agricultural systems. Frontiers in Microbiology, 2018, 9: 2424.

[13] GUO J J, LING N, CHEN H, ZHU C, KONG Y L, WANG M, SHEN Q R, GUO S W. Distinct drivers of activity, abundance, diversity and composition of ammonia-oxidizers: evidence from a long-term field experiment. Soil Biology and Biochemistry, 2017, 115: 403-414.

[14] 武傳東, 閆倩, 辛亮, 王保莉, 曲東. 長期施用氮肥和磷肥對渭北旱塬土壤中氨氧化古菌多樣性的影響. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2012, 31(4): 743-749.

WU C D,YAN Q, XIN L, WANG B L, QU D.Effects of long-term nitrogen and phosphate fertilization on diversity of ammonia- oxidizing archaea in dry highland soil of Loess Plateau, China. Journal of Agro-Environment Science, 2012, 31(4): 743-749. (in Chinese)

[15] 程林, 劉桂婷, 王保莉, 曲東. 渭北旱塬長期施肥試驗中氨氧化細(xì)菌的多樣性及群落結(jié)構(gòu)分析. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2010, 29(7): 1333-1340.

CHENG L, LIU G T, WANG B L, QU D. Effects of long-term fertilization on diversity and composition of ammonia-oxidizing bacterium communities in Weibei dry-land. Journal of Agro- Environment Science, 2010, 29(7): 1333-1340. (in Chinese)

[16] WU Y C, LU L, WANG B Z, LIN X G, ZHU J G, CAI Z C, YAN X Y, JIA Z J. Long-term field fertilization significantly alters community structure of ammonia-oxidizing bacteria rather than archaea in a paddy soil. Soil Science Society of America Journal, 2011, 75(4): 1431-1439.

[17] TAO R, WAKELIN S A, LIANG Y C, CHU G X. Response of ammonia-oxidizing archaea and bacteria in calcareous soil to mineral and organic fertilizer application and their relative contribution to nitrification. Soil Biology and Biochemistry, 2017, 114: 20-30.

[18] SONG H, CHE Z, CAO W C, HUANG T, WANG J G, DONG Z R. Changing roles of ammonia-oxidizing bacteria and archaea in a continuously acidifying soil caused by over-fertilization with nitrogen. Environmental Science and Pollution Research, 2016, 23(12): 11964-11974.

[19] CHEN Y L, XU Z W, HU H W, HU Y J, HAO Z P, JIANG Y, CHEN B D. Responses of ammonia-oxidizing bacteria and archaea to nitrogen fertilization and precipitation increment in a typical temperate steppe in Inner Mongolia. Applied Soil Ecology, 2013, 68(3): 36-45.

[20] WANG X L, HAN C, ZHANG J B, HUANG Q R, DENG H, DENG Y C, ZHONG W H. Long-term fertilization effects on active ammonia oxidizers in an acidic upland soil in China. Soil Biology and Biochemistry, 2015, 84: 28-37.

[21] 徐白璐, 鐘文輝, 黃欠如, 秦紅益, 鄧歡, 韓成. 長期施肥酸性旱地土壤硝化活性及自養(yǎng)硝化微生物特征. 環(huán)境科學(xué), 2017, 38(8): 3473-3482.

XU B L, ZHONG W H, HUANG Q R, QIN H Y, DENG H, HAN C. Nitrification activity and autotrophic nitrifiers in long-term fertilized acidic upland soils. Environment Science, 2017, 38(8): 3473-3482. (in Chinese)

[22] ZHONG W H, BIAN B Y, GAO N, MIN J, SHI W M, LIN X G, SHEN W S. Nitrogen fertilization induced changes in ammonia oxidation are attributable mostly to bacteria rather than archaea in greenhouse-based high N input vegetable soil. Soil Biology and Biochemistry, 2016, 93: 150-159.

[23] AI C, LIANG G Q, SUN J W, WANG X B, HE P, ZHOU W. Different roles of rhizosphere effect and long-term fertilization in the activity and community structure of ammonia oxidizers in a calcareous fluvo-aquic soil. Soil Biology and Biochemistry, 2013, 57: 30-42.

[24] KONG Y L, LING N, XUE C, CHEN H, RUAN Y, GUO J J, ZHU C, WANG M, SHEN Q R, GUO S H. Long‐term fertilization regimes change soil nitrification potential by impacting active autotrophic ammonia oxidizers and nitrite oxidizers as assessed by DNA stable isotope probing. Environmental Microbiology, 2019, 21(4): 1224-1240.

[25] 何毓蓉. 中國紫色土(上篇). 北京: 科學(xué)出版社, 1991.

HE Y R. Chinese purple soil (Part 1). Beijing: Science Press, 1991. (in Chinese)

[26] 盧圣鄂, 王鎣燕, 陳勇, 涂仕華, 張小平, 辜運(yùn)富. 不同施肥制度對石灰性紫色水稻土中氨氧化古菌群落結(jié)構(gòu)的影響. 生態(tài)學(xué)報, 2016, 36(21): 6919-6927.

LU S E, WANG Y Y, CHEN Y, TU S H, ZHANG X P, GU Y F. Impact of different long-term fertilization systems on ammonia oxidation Archaea community structures in Calcareous Purple Paddy soil. Acta Ecologica Sinica, 2016, 36(21): 6919-6927. (in Chinese)

[27] LI Q Q, LUO Y L, WANG C Q, LI B, ZHANG X, YUAN D G, GAO X S, ZHANG H. Spatiotemporal variations and factors affecting soil nitrogen in the purple hilly area of Southwest China during the 1980s and the 2010s. Science of the Total Environment, 2016, 547: 173-181.

[28] YANG X L, ZHU B, LI Y L. Spatial and temporal patterns of soil nitrogen distribution under different land uses in a watershed in the hilly area of purple soil, China. Journal of Mountain Science, 2013, 10(3): 410-417.

[29] ZHU B, WANG T, KUANG F H, LUO Z X, TANG J L, XU T P. Measurements of nitrate leaching from a hillslope cropland in the Central Sichuan Basin, China. Soil Science Society of America Journal, 2009, 73(4): 1419-1426.

[30] 李青軍, 張炎, 胡偉, 孟鳳軒, 馮廣平, 胡國智, 劉新蘭. 氮素運(yùn)籌對玉米干物質(zhì)積累、氮素吸收分配及產(chǎn)量的影響. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報, 2011, 17(3): 755-760.

LI Q J, ZHANG Y, HU W, MENG F X, FENG G P, HU G Z, LIU X L.Effects of nitrogen management on maize dry matter accumulation nitrogen uptake and distribution and maize yield. Journal of Plant Nutrition and Fertilizers, 2011, 17(3): 755-760. (in Chinese)

[31] 魯如坤. 土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科技出版社, 2000.

LU R K. Analytical Methods of Soil Agricultural Chemistry. Beijing: Chinese Agricultural Science and Technology Press, 2000. (in Chinese)

[32] KUROLA J, SALKINOJA-SALONEN M, AARNIO T, HULTMAN J, ROMANTSCHUK M. Activity, diversity and population size of ammonia-oxidising bacteria in oil-contaminated landfarming soil. Fems Microbiology Letters, 2005, 250: 33-38.

[33] FRANCIS C A, ROBERTS K J, BEMAN J M, SANTORO A E, OAKLEY B B. Ubiquity and diversity of ammonia-oxidizing archaea in water columns and sediments of the ocean. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2005, 102(41): 14683-14688.

[34] ROTTHAUWE J H, WITZEL K P, LIESACK W. The ammonia monooxygenase structural gene amoA as a functional marker: molecular fine-scale analysis of natural ammonia-oxidizing populations. Applied and Environmental Microbiology, 1997, 63(12): 4704-4712.

[35] TANG Y Q, ZHANG X Y, LI D D, WANG H M, CHEN F S, FU X L, FANG X M, SUN X M, YU G R. Impacts of nitrogen and phosphorus additions on the abundance and community structure of ammonia oxidizers and denitrifying bacteria in Chinese fir plantations. Soil Biology and Biochemistry, 2016, 103: 284-293.

[36] LIU H Y, LI J, ZHAO Y, XIE K X, TANG X J, WANG S X, LI Z P, LIAO Y L, XU J M, DI H J, LI Y. Ammonia oxidizers and nitrite-oxidizing bacteria respond differently to long-term manure application in four paddy soils of south of China. Science of the Total Environment, 2018, 633: 641-648.

[37] GRACE J B. Structural Equation Modeling and Natural Systems. Cambridge: Cambridge University Press, 2006.

[38] HOOPER D, COUGHLAN J, MULLEN M R. Structural equation modeling: Guidelines for determining model fit. Electronic Journal on Business Research Methods, 2008, 6(1): 53-60.

[39] ZHANG L M, HU H W, SHEN J P, HE J Z. Ammonia-oxidizing archaea have more important role than ammonia-oxidizing bacteria in ammonia oxidation of strongly acidic soils. The Isme Journal, 2012, 6: 1032-1045.

[40] LIU S, COYNE M S, GROVE J H, FLYTHE M D. Tillage, not fertilization, dominantly influences ammonia-oxidizing archaea diversity in long-term, continuous maize. Applied Soil Ecology, 2020, 147: 103384.

[41] WANG S Y, WANG Y, FENG X J, ZHAI L M, ZHU G B. Quantitative analyses of ammonia-oxidizing Archaea and bacteria in the sediments of four nitrogen-rich wetlands in China. Applied Microbiology and Biotechnology, 2011, 90(2): 779-787.

[42] HE L L, BI Y C, ZHAO J, PITTELKOW C M, ZHAO X, WANG S Q, XING G X. Population and community structure shifts of ammonia oxidizers after four-year successive biochar application to agricultural acidic and alkaline soils. Science of the Total Environment, 2018, 619-620: 1105-1115.

[43] XIA W W, ZHANG C X, ZENG X W, FENG Y Z, WENG J H, LIN X G, ZHU J G, XIONG Z Q, XU J, CAI Z C, JIA Z J. Autotrophic growth of nitrifying community in an agricultural soil. The Isme Journal, 2011, 5: 1226-1236.

[44] LU L, HAN W Y, ZHANG J B, WU Y C, WANG B Z, LIN X G, ZHU J G, CAI Z C, JIA Z J. Nitrification of archaeal ammonia oxidizers in acid soils is supported by hydrolysis of urea. The Isme Journal, 2012, 6: 1978-1984.

[45] TANG H M, XIAO X P, LI C, CHENG K K, PAN X C, LI W Y. Effects of rhizosphere and long-term fertilization practices on the activity and community structure of ammonia oxidizers under double-cropping rice field. Acta Agriculturae Scandinavica, Section B-Soil & Plant Science, 2019, 69(4): 356-368.

[46] ALVES R J E, WANEK W, ZAPPE A, RICHTER A, SVENNING M M, SCHLEPER C, URICH T. Nitrification rates in Arctic soils are associated with functionally distinct populations of ammonia- oxidizing archaea. The Isme Journal, 2013, 7: 1620-1631.

[47] GUBRY-RANGIN C, HAI B, QUINCE C, ENGEL M, THOMSON B C, JAMES P, SCHLOTER M, GRIFFITHS R I, PROSSER J I, NICOL G W. Niche specialization of terrestrial archaeal ammonia oxidizers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 2011, 108(52): 21206-21211.

[48] ZHANG L M, DUFF A M, SMITH C J. Community and functional shifts in ammonia oxidizers across terrestrial and marine (soil/ sediment) boundaries in two coastal Bay ecosystems. Environmental Microbiology, 2018, 20(8): 2834-2853.

[49] GUBRY-RANGIN C, Graeme W N, PROSSER J I. Archaea rather than bacteria control nitrification in two agricultural acidic soils. Fems Microbiology Ecology, 2010, 74(3): 566-574.

[50] LI Y Y, CHAPMAN S J, NICOL G W, YAO H Y. Nitrification and nitrifiers in acidic soils. Soil Biology and Biochemistry, 2018, 116: 290-301.

[51] JIANG X J, HOU X Y, ZHOU X, XIN X P, WRIGHT A, JIA Z J. pH regulates key players of nitrification in paddy soils. Soil Biology and Biochemistry, 2015, 81: 9-16.

[52] WERTZ S, LEIGH A K K, GRAYSTON S J. Effects of long-term fertilization of forest soils on potential nitrification and on the abundance and community structure of ammonia oxidizers and nitrite oxidizers. Fems Microbiology Ecology, 2012, 79(1): 142-154.

[53] 李晨華, 張彩霞, 唐立松, 熊正琴, 王保戰(zhàn), 賈仲君, 李彥. 長期施肥土壤微生物群落的剖面變化及其與土壤性質(zhì)的關(guān)系. 微生物學(xué)報, 2014, 54(3): 319-329.

LI C H, ZHANG C X, TANG L S, XIONG Z Q, WANG B Z, JIA Z J, LI Y.Effect of long-term fertilizing regime on soil microbial diversity and soil property.Acta Microbiologica Sinica, 2014, 54(3): 319-329. (in Chinese)

[54] KIM J G, JUNG M Y, PARK S J, RIJPSTRA W I C, SINNINGHE DAMSTé J S, MADSEN E L, MIN D, KIM J S, KIM G J, RHEE S K. Cultivation of a highly enriched ammonia-oxidizing archaeon of thaumarchaeotal group I.1b from an agricultural soil. Environmental Microbiology, 2012, 14(6): 1528-1543.

[55] TOURNA M, STIEGLMEIER M, SPANG A, KONNEKE M, SCHINTLMEISTER A, URICH T, ENGEL M, SCHLOTER M, WAGNER M, RICHTER A, SCHLEPER C. Nitrososphaera viennensis, an ammonia oxidizing archaeon from soil. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 2011, 108(20): 8420-8425.

[56] LI P P, HAN Y L, HE J Z, ZHANG S Q, ZHANG L M. Soil aggregate size and long-term fertilization effects on the function and community of ammonia oxidizers. Geoderma, 2019, 338: 107-117.

[57] XIAO H F, SCHAEFER D A, YANG X D. pH drives ammonia oxidizing bacteria rather than archaea thereby stimulate nitrification undercolonization. Soil Biology and Biochemistry, 2017, 114: 12-19.

[58] HU H W, ZHANG L M, DAI Y, DI H J, HE J Z. pH-dependent distribution of soil ammonia oxidizers across a large geographical scale as revealed by high-throughput pyrosequencing. Journal of Soils and Sediments, 2013, 13(8): 1439-1449.

[59] DUAN P P, FAN C H, ZHANG Q Q, XIONG Z Q. Overdose fertilization induced ammonia-oxidizing archaea producing nitrous oxide in intensive vegetable fields. Science of the Total Environment, 2019, 650: 1787-1794.

[60] YANG X D, NI K, SHI Y Z, YI X Y, JI L F, MA L F, RUAN J Y. Heavy nitrogen application increases soil nitrification through ammonia-oxidizing bacteria rather than archaea in acidic tea (L.) plantation soil. Science of the Total Environment, 2020, 717: 137248.

[61] KITS K D, SEDLACEK C J, LEBEDEVA E V, HAN P, BULAEV A, PJEVAC P, DAEBELER A, ROMANO S, ALBERTSEN M, STEIN L Y, DAIMS H, WAGNER M. Kinetic analysis of a complete nitrifier reveals an oligotrophic lifestyle. Nature, 2017, 549(7671): 269-272.

Effects of Long-Term Nitrogen Application on Ammonia Oxidizer Communities for Nitrification in Acid Purple Soil

ZOU WenXin1, SU WeiHua1, CHEN YuanXue2, CHEN XinPing1, LANG Ming1*

1College of Resources and Environment, Southwest University/Chongqing Key Laboratory of Efficient Utilization of Soil and Fertilizer Resources, Chongqing 400715;2College of Resource Sciences, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130

【Objective】The purpose of this study was to explore the effects of long-term nitrogen (N) application on the community characteristics of ammonia oxidizing archaea (AOA) and ammonia oxidizing bacteria (AOB) in acid purple soil, and to reveal the driving factors of ammonia oxidizer communities and the microbial mechanism to regulate nitrification.【Method】Relying on the long-term gradient N fertilization maize field experiment in Sichuan (beginning in 2010), the treatments included five N supply levels: 0 (N0), 90 (N90), 180 (N180), 270 (N270) and 360 (N360) kg N·hm-2. Illumina Miseq high-throughput sequencing technology was used to determine the communities of AOA and AOB, so as to explore the effect of long-term gradient N application on the nitrification mediated by ammonia oxidizer communities. 【Result】Long-term N application affected the α-diversity (including sobs index and Shannon-Wiener index), community structure and community composition of AOA and AOB. As N application rate increased, the sobs index of AOA did not change significantly, while the Shannon-Wiener index of AOA decreased significantly, however, both the sobs index and Shannon-Wiener index of AOB increased significantly; long-term gradient N fertilization significantly affected the community structure of AOA and AOB. The relative abundance of the dominant AOB groups namedCluster 3a.1 significantly reduced while Cluster 3a.2, Cluster 9 and Cluster 1 significantly increased with the increased of the N application (＜0.05); there were no obvious rules for the relative abundance of the dominant AOA group named clade A. pH, TN, SOM, NH4+-N and NO3--N all significantly affected the α-diversity of AOA and AOB. pH was significantly negatively correlated with AOB sobs index and Shannon-Wiener index, and significantly positively correlated with AOA Shannon-Wiener index. TN, SOM, NH4+-N and NO3--Nwere significantly positively correlated with the AOB sobs index and Shannon-Wiener index, and were significantly negatively correlated with the AOA Shannon-Wiener index. Meanwhile, pH, TN, NO3--N, SOM, NH4+-N significantly affected the community structure of AOA and AOB (＜0.05). Moreover, the results of structural equation modeling (SEM) comprehensively showed that long-term gradient N application reduced pH, increased the TN and NO3--Ncontent, and affected the α-diversity and community structure of AOA and AOB, which indirectly increased soil PNR. 【Conclusion】Long-term N application affected the soil PNR by changing the soil pH, TN, SOM, NH4+-N, NO3--N, the α-diversity and community structure of ammonia oxidizers.

acid purple soil; gradient nitrogen fertilization; ammonia oxidizing bacteria; ammonia oxidizing archaea; potential nitrification rate

2021-01-06；

2021-03-10

國家自然科學(xué)基金（32002126）、國家玉米產(chǎn)業(yè)體系（CARS-02-15）、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)（XDJK2019C065）、國家重點(diǎn)研發(fā)計劃（2018YFD0200700，2017YFD0200206）

鄒溫馨，E-mail：zouwx060@163.com。通信作者郎明，E-mail：langming@swu.edu.cn

（責(zé)任編輯 李云霞）