低溫與GA3對(duì)大蒜氣生鱗莖萌發(fā)的影響

何九軍 趙淑玲 王 昱 王讓軍 楊小錄

（隴南師范高等?？茖W(xué)校農(nóng)林技術(shù)學(xué)院/隴南特色農(nóng)業(yè)生物資源研究開發(fā)中心 甘肅 成縣 742500）

大蒜(Allium sativumL)屬百合科(Liliacea)蔥屬(Allium tistalosum)的一個(gè)栽培種，是短縮莖盤上側(cè)芽葉鞘膨大而成的蒜瓣所組成的近球形鱗莖。大蒜營養(yǎng)十分豐富，具有較好的藥用價(jià)值和食療作用，其中的微量元素硒具有抗衰老、保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的功能。而大蒜的殺菌、抗癌、降低血脂、抗衰老等作用使它成為少有的天然保健食品[1]。但隨著大蒜種植面積的擴(kuò)大和產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，大蒜生產(chǎn)中存在的問題也日趨凸顯。大蒜主要以蒜瓣(地下鱗莖)進(jìn)行無性繁殖，長期的無性繁殖使大蒜體內(nèi)感染的病毒會(huì)逐代傳遞并積累，造成病害逐年加重和大蒜種性退化，而大蒜離體微繁技術(shù)可以有效解決上述問題[2]。氣生鱗莖由蒜薹頂端花苞內(nèi)的鱗芽長成，遺傳穩(wěn)定，且數(shù)量多、體積小、萌芽率高、操作簡單，是離體條件下進(jìn)行大蒜脫毒育苗的首選外植體材料[3]。大蒜莖尖脫毒及快繁技術(shù)國內(nèi)外已有大量研究報(bào)道[4]，并已在實(shí)踐中應(yīng)用。但此項(xiàng)技術(shù)實(shí)施起來較為復(fù)雜，需要較為嚴(yán)格的研究條件和較高的成本，不便于在生產(chǎn)部門開展。另外，大蒜氣生鱗莖是由病毒含量較少的大蒜莖尖分生組織分化形成，而此過程具有一定的自然脫毒作用，形成的氣生鱗莖具有攜帶病毒低和種質(zhì)純化的潛在優(yōu)勢(shì)，通常能提高大蒜畝產(chǎn)20%～40%。但是大蒜氣生鱗莖和蒜瓣一樣都具有較長的休眠期，可通過人為干擾打破其休眠。本研究就是通過在低溫(4℃)的環(huán)境下和外源GA3的處理下對(duì)氣生鱗莖進(jìn)行調(diào)控，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常環(huán)境下保存的氣生鱗莖相比，萌發(fā)率、丙二醛(MDA)含量均有較大變化，這說明通過低溫(4℃)環(huán)境和外源GA3處理后，氣生鱗莖代謝發(fā)生了變化，進(jìn)而為打破大蒜氣生鱗莖的休眠提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器。PHS-250-Ⅱ恒溫恒濕培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)；5424型冷凍離心機(jī)(Eppendorf)；SP-723PC分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)；GA3(國藥集團(tuán))、酸性茚三酮等試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)。本試驗(yàn)以1年生“漢中蒜”氣生鱗莖為材料，大蒜氣生鱗莖由成縣店村種植基地提供。2020年6月中旬采收大蒜氣生鱗莖，收獲后在室溫下攤晾10 d待用。大蒜氣生鱗莖用0.4%高錳酸鉀消毒30 min，用蒸餾水沖洗干凈，控干水分，再分別用不同濃度的GA3(0 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L)浸泡12 h，然后將浸泡液倒掉，將氣生鱗莖放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱，溫度設(shè)置為4℃，濕度為70%。處理時(shí)間分別是7 d、14 d、21 d、28 d、35 d。每個(gè)處理做3次重復(fù)。

表1 大蒜氣生鱗莖低溫及GA3處理

1.2.2 發(fā)芽率測(cè)定。4℃處理后的大蒜氣生鱗莖播種在發(fā)芽盒中，按椰糠和育苗基質(zhì)1∶1混合，每發(fā)芽盒中播種20粒氣生鱗莖，將發(fā)芽盒放置在隴南師專智能溫室中，除草，澆灌清水，經(jīng)常觀察，每隔10 d做一次發(fā)芽記錄。以常溫下的大蒜氣生鱗莖為對(duì)照(CK)。發(fā)芽率統(tǒng)計(jì)公式：發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽種子總粒數(shù)/試驗(yàn)種子總粒數(shù))×100%。

1.2.3 大蒜氣生鱗莖單果重、縱橫徑等測(cè)定。大蒜氣生鱗莖采摘后隨機(jī)抽取100頭氣生鱗莖，測(cè)定氣生鱗莖的單果重量、縱橫徑。用電子分析天平精確稱單果重，用游標(biāo)卡尺測(cè)定縱徑和橫徑。隨機(jī)抽取50頭氣生鱗莖測(cè)定氣生鱗莖數(shù)量及重量。

1.2.4 丙二醛(MDA)和可溶性糖含量的測(cè)定。在處理的第7 d、第14 d、第21 d、第28 d、第35 d進(jìn)行丙二醛(MDA)和可溶性糖含量測(cè)定。剝?nèi)馍[莖外的蒜皮(葉鞘)，取肉質(zhì)鱗莖進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定方法：參考林艷[5]等方法并略做改動(dòng)。精確稱取去掉葉鞘的氣生鱗莖0.1 g，取10%TCA的1 ml在研缽中研磨成勻漿，再加4 ml TCA移入離心管，離心機(jī)中離心10 min(4 000 r/min)。取離心后的上清液2 ml到空白管，加入2 ml TBA搖勻，100℃水浴15 min，待冷卻后再離心1次，取離心后的上清液用分光光度計(jì)測(cè)定在450 nm、532 nm、600 nm下的吸光值。丙二醛含量及可溶性糖含量計(jì)算公式如下：

(1)和(2)式中CMDA、C糖分別表示丙二醛(MDA)、可溶性糖的濃度；A450、A532、A600分別表示在450 nm、532 nm、600 nm測(cè)得的吸光值。

MDA含量(μmol/g)=MDA濃度×提取液體積/植物組織鮮重……(3)

可溶性糖含量(μmol/g)=可溶性糖含量×提取液體積/植物組織鮮重……(4)

根據(jù)公式(1)、(2)、(3)、(4)計(jì)算出MDA含量和可溶性糖含量。

1.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法。用Statistics23軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，用比較平均值單因素Anova檢驗(yàn)進(jìn)行方差分析，獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析(0.05水平)，數(shù)據(jù)用平均值(Means)標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，用Origin2018軟件做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜氣生鱗莖單果重、縱橫徑及氣生鱗莖形態(tài)指標(biāo)2.1.1 大蒜氣生鱗莖單果重、縱橫徑測(cè)定結(jié)果。對(duì)隨機(jī)取的100頭氣生鱗莖進(jìn)行單因素方差分析。大蒜氣生鱗莖平均單果重為22.42g，最大單果重為33.0053g，最小單果重為10.1365g；最大果縱徑為3.70cm，最小果縱徑為2.20cm；最大果橫徑為4.70cm，最小果橫徑為2.50cm；最大果縱橫比為1.0571，最小果縱橫比為0.6170。

2.1.2 大蒜氣生鱗莖數(shù)量及重量測(cè)定結(jié)果。隨機(jī)抽取50頭大蒜氣生鱗莖，分別測(cè)定氣生鱗莖上著生鱗芽的數(shù)量、莖鱗芽的重量。大蒜氣生鱗莖上著生鱗芽最多的是56個(gè)，著生鱗芽最少的是9個(gè)。蒜鱗芽重量最大的是1.9953g，鱗芽重量最小的是0.0428g。

2.2 大蒜氣生鱗莖萌發(fā)率

2.2.1 低溫下不同GA3對(duì)大蒜氣生鱗莖萌發(fā)率的影響。由圖1可以看出，在4℃低溫以及不同濃度GA3處理下，各處理組大蒜氣生鱗莖的萌發(fā)率與CK相比，均有提高，其中以D處理組的萌發(fā)率最高，達(dá)到98.33%，CK的萌發(fā)率為85.00%，C、D處理組萌發(fā)率與CK相比有差異(P＜0.05)，推測(cè)，低溫和GA3處理能打破大蒜氣生鱗莖休眠，提高萌發(fā)率。

圖1 低溫與GA3對(duì)大蒜氣生鱗莖萌發(fā)率的影響

2.2.2 低溫及不同處理時(shí)間對(duì)大蒜氣生鱗莖萌發(fā)率的影響。圖2是A、B、C、D各組在分別處理7d、14d、21 d、28 d、35 d后對(duì)大蒜氣生鱗莖萌發(fā)率的影響。從圖2可以看出，4℃低溫處理及較高濃度的GA3對(duì)大蒜氣生鱗莖的萌發(fā)有促進(jìn)作用。4℃低溫處理7 d，A組萌發(fā)率與對(duì)照組相比，沒有差異；B組、C組在4℃低溫處理21 d、28 d時(shí)，與CK相比，有差異(P＜0.05)；D組4℃低溫處理21～35 d時(shí)，與對(duì)照組相比，差異極明顯(P＜0.01)?？梢姡蜏靥幚?1～35d以及一定濃度GA3對(duì)大蒜氣生鱗莖的萌發(fā)均有促進(jìn)作用。總體來看，低溫處理28 d，GA3含量200 mg/L處理對(duì)打破大蒜氣生鱗莖休眠效果較好。從方差分析結(jié)果(表2)可以看出，不同GA3濃度處理及低溫處理對(duì)大蒜氣生鱗莖萌發(fā)率有影響(p＜0.05)。

圖2 低溫及不同處理時(shí)間對(duì)大蒜氣生鱗莖萌發(fā)率的影響

表2 不同處理大蒜氣生鱗莖萌發(fā)率方差分析

圖3為大蒜氣生鱗莖發(fā)芽形態(tài)圖，從大蒜氣生鱗莖發(fā)芽觀察可以看出，大蒜氣生鱗莖萌發(fā)時(shí)先長出根，生根3 d左右有芽長出，其形態(tài)與正常大蒜鱗莖發(fā)芽相同。

圖3 大蒜氣生鱗莖發(fā)芽形態(tài)圖

2.3 低溫與GA3對(duì)大蒜氣生鱗莖MDA含量的影響。丙二醛一定程度上可反映外界環(huán)境對(duì)植物脅迫作用，圖4是不同處理組大蒜氣生鱗莖MDA含量變化圖，從圖中可以看出，在4℃低溫下以及不同濃度GA3處理下對(duì)大蒜氣生鱗莖的丙二醛含量均有影響。常溫處理組的MDA含量在第14 d升高隨后再下降，考慮在7月底至8月初當(dāng)?shù)貧鉁刈兓^大，室溫最高溫度多達(dá)33℃，對(duì)大蒜氣生鱗莖影響較大，故其MDA含量急劇升高是對(duì)外界環(huán)境的積極響應(yīng)。在低溫處理相同天數(shù)時(shí)，MDA的含量與對(duì)照組相比整體下降，第14 d、21 d、28 d、35 d大蒜氣生鱗莖MDA含量與對(duì)照組相比均有差異(P＜0.05)。在低溫和GA3處理下大蒜氣生鱗莖MDA含量緩慢下降，推測(cè)低溫和GA3處理對(duì)大蒜氣生鱗莖的細(xì)胞膜未造成損害[6]。不同處理大蒜氣生鱗莖MDA含量方差分析結(jié)果見表3，從中可以看出，不同GA3濃度處理與低溫對(duì)大蒜氣生鱗莖MDA含量的影響差異極為顯著(P=0.000＜0.01)。

圖4 低溫與GA3對(duì)大蒜氣生鱗莖MDA含量的影響

表3 不同處理大蒜氣生鱗莖MDA含量方差分析

2.4 低溫與GA3對(duì)大蒜氣生鱗莖可溶性糖含量的影響。可溶性糖是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，由于其分子量小，在植物含水量一定的情況下，通過可溶性糖的增加，能增加植物細(xì)胞液的水勢(shì)，穩(wěn)定植物內(nèi)環(huán)境。由圖5看出，各處理組的可溶性糖含量隨處理時(shí)間的增加，總體呈增長趨勢(shì)。其中GA3在150mg/L、200 mg/L處理、低溫第21～35 d處理下可溶性糖的含量增加明顯，與對(duì)照相比有差異(P＜0.05)。不同處理大蒜氣生鱗莖可溶性糖含量方差分析結(jié)果見表3，從中可以看出，大蒜氣生鱗莖在不同GA3濃度處理與低溫不同處理下，對(duì)可溶性糖含量的影響差異極為顯著(P=0.000＜0.01)。

圖5 低溫與GA3對(duì)大蒜氣生鱗莖可溶性糖含量的影響

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)中，4℃低溫處理及較高濃度的GA3對(duì)大蒜氣生鱗莖的萌發(fā)有促進(jìn)作用，低溫處理21～35 d以及一定濃度GA3對(duì)大蒜氣生鱗莖的萌發(fā)均有促進(jìn)作用，總體來看，低溫處理28 d，GA3含量200 mg/L對(duì)打破大蒜氣生鱗莖休眠效果較好。

在打破大蒜氣生鱗莖休眠過程中，大蒜氣生鱗莖體內(nèi)MDA和可溶性糖的含量也發(fā)生變化。在大蒜氣生鱗莖低溫處理相同天數(shù)時(shí)，MDA的含量與對(duì)照組相比整體下降，與董玉惠[7]調(diào)查結(jié)果相同，推測(cè)大蒜氣生鱗莖細(xì)胞膜在高溫下比在4℃下更易受傷害，該品種耐冷性較強(qiáng)?？扇苄蕴呛侩S處理時(shí)間的增加，總體呈增長趨勢(shì)。可能是在低溫貯藏和激素處理下，大蒜氣生鱗莖打破休眠或者即將進(jìn)入萌發(fā)期，體內(nèi)有機(jī)物質(zhì)分解逐漸累積較多可溶性糖[8]。

有關(guān)解除植物休眠的方法研究，依據(jù)機(jī)理的不同可通過植物生長調(diào)節(jié)劑解除，也可通過物理方法解除，如通過低溫或高溫處理的方法。而僅僅通過低溫解除休眠的方法對(duì)植物正常生長會(huì)產(chǎn)生一定的損傷作用，試驗(yàn)中利用低溫和GA來打破休眠可能是影響到細(xì)胞的分裂和生長，進(jìn)而影響到大蒜氣生鱗莖的休眠過程。

綜上所述，通過低溫4℃和不同濃度的GA3刺激大蒜氣生鱗莖，打破休眠，加速鱗莖萌發(fā)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有一定的指導(dǎo)意義。