UBE2L3對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化的影響

胡 迪，于 州，郭益文，胡德寶，張林林，李 新，郭 宏，丁向彬 (天津農(nóng)學(xué)院 動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384)

起初人們認(rèn)為自噬系統(tǒng)與泛素蛋白酶體途徑(ubiquitin proteasome system,UPS)是互不相干的，隨著越來越多的試驗發(fā)現(xiàn)，這兩個系統(tǒng)可以產(chǎn)生一定的關(guān)聯(lián)，可以將已經(jīng)被泛素修飾過的蛋白進(jìn)行分解，但降解的蛋白主要以可溶性、短周期和單體的錯誤折疊蛋白質(zhì)為主[1-3]。UPS主要負(fù)責(zé)降解細(xì)胞內(nèi)大部分正常以及發(fā)生異變的蛋白質(zhì)，并對細(xì)胞周期等多種生命過程中發(fā)揮重要作用[4-5]。

在心腦血管的研究中，TSUKAMOTO等[6]研究報道在心功能不全開始之前，蛋白酶體活性降低，與此同時心肌細(xì)胞也會凋亡。反過來，心肌細(xì)胞凋亡會導(dǎo)致心臟的壓力超負(fù)荷。擴(kuò)張型(DCM)和缺血性心肌病(ICM)與心臟重構(gòu)有關(guān)，SPNIG等[7]通過研究發(fā)現(xiàn)在DCM和ICM患者的心肌組織中觀察到不同水平的UPS組分、E3連接酶和UPS激活標(biāo)志物，提示UPS在潛在的病理過程中有不同程度的參與。線粒體蛋白Poldip2(polymerase delta interaction protein 2)可以通過O-連接的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)轉(zhuǎn)移酶抑制泛素蛋白酶體系統(tǒng)來控制血管平滑肌分化表型，為靶向調(diào)節(jié)血管疾病期間的VSMC表型提供了依據(jù)[8]。在肌肉發(fā)育相關(guān)研究過程中，KITAJIMA等[9]用使用缺乏關(guān)鍵蛋白酶體成分Rpt3的小鼠來研究衛(wèi)星細(xì)胞中蛋白酶體的功能，去除衛(wèi)星細(xì)胞中的Rpt3會降低蛋白酶體的活性，Rpt3缺陷衛(wèi)星細(xì)胞的蛋白酶體功能障礙損害其增殖、存活和分化能力，導(dǎo)致肌肉再生缺陷，蛋白酶體活性失活導(dǎo)致衛(wèi)星細(xì)胞的增殖缺陷和凋亡，從機(jī)制上講，蛋白酶體活性不足上調(diào)了p53通路，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，描述了蛋白酶體系統(tǒng)在成人肌肉中維持衛(wèi)星細(xì)胞的關(guān)鍵功能。

在泛素化途徑中泛素結(jié)合酶(ubiquitin-conjugating enzyme，E2)起承上啟下的關(guān)鍵作用即將被活化E1的Ub分子傳遞給E3。E2酶家族的主要特征是一個高度保守的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(UBC)，它包括激活的Ub、E1和E3酶的結(jié)合區(qū)[10]。在泛素-蛋白水解系統(tǒng)中，UBE2L3作為一種E2結(jié)合酶起著較為重要的作用。UBE2L3 的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-2和轉(zhuǎn)錄因子特化蛋白-1的調(diào)控[11]。UBE2L3基因表達(dá)水平增加，p53會結(jié)合更多的Ub分子，被識別降解，阻滯細(xì)胞的生長周期[12]。根據(jù)研究提示UBE2L3可能在肌肉發(fā)育以及細(xì)胞周期過程中起到某種不可或缺的作用，但在牛骨骼肌的生長發(fā)育過程中是否具有調(diào)控作用尚未可知。本研究利用BSMSCs體外誘導(dǎo)成肌分化模型，模擬牛骨骼肌生長發(fā)育過程，促進(jìn)或者抑制UBE2L3在細(xì)胞中的表達(dá)，研究UBE2L3對BSMSCs體外成肌分化的影響，以期為牛成肌分化中的泛素化調(diào)控機(jī)制研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源細(xì)胞為天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室分離并且凍存的原代BSMSCs。

1.2 主要試劑和儀器細(xì)胞二氧化碳培養(yǎng)箱購自日本三洋公司；qRT-PCR儀購自瑞士Roche公司的；熒光顯微鏡購自德國Leica公司；DMEM、FBS、HS、Opti-MEM均購自美國Gibco公司；Lipofectamine3000購自美國賽默飛公司；反轉(zhuǎn)錄試劑、BCA試劑盒購自北京康為公司；定量Mix購自廣州復(fù)能公司；RIPA細(xì)胞組織裂解液、電泳液、電轉(zhuǎn)液、發(fā)光液和TBS購自北京索萊寶公司；蛋白酶抑制劑混合物購自美國SIGMA公司；分化標(biāo)志因子MyHC、MyoG一抗購自DSHB公司；GAPDH一抗、羊抗鼠、羊抗兔二抗均購自上海生工公司等。

1.3 BSMSCs的復(fù)蘇、傳代及誘導(dǎo)分化BSMSCs體外誘導(dǎo)成肌分化模型的建立，具體步驟參照課題組前期已建立的試驗方法進(jìn)行[13]。細(xì)胞37℃解凍，用1 mL完全培養(yǎng)基(20%FBS+DMEM)中和，利用差速離心法吸棄上清，用3 mL完全培養(yǎng)基充分重懸，接種于60 mm培養(yǎng)皿，觀察細(xì)胞數(shù)量生長進(jìn)行傳代。加入胰酶進(jìn)行消化，完全培養(yǎng)基終止消化后收集，差速離心移棄上清，加入完全培養(yǎng)基重懸后接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中。細(xì)胞數(shù)量生長到80%以上換成分化培養(yǎng)基(2%HS+DMEM)進(jìn)行誘導(dǎo)分化。

1.4 UBE2L3的干擾以及過表達(dá)并檢測效果根據(jù)基因序列設(shè)計小片段干擾RNA，由廣州銳博公司合成。構(gòu)建UBE2L3表達(dá)載體pcDNA3.1-UBE2L3，將BSMSCs培養(yǎng)并且傳代于目標(biāo)孔板中，通過細(xì)胞計數(shù)達(dá)到要求，按照Lipofectamine 3000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，24 h后提取蛋白以及總RNA檢測UBE2L3表達(dá)量。

1.5 EdU染色法檢測細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)染24 h后，按照EdU說明書處理細(xì)胞，利用熒光顯微鏡檢測陽性細(xì)胞數(shù)，每孔重復(fù)采集3個視野。

1.6 熒光定量PCR檢測干擾及過表達(dá)效果并檢測成肌分化標(biāo)志因子用24孔板培養(yǎng)細(xì)胞，按照試劑盒說明書提示提取RNA，根據(jù)濃度反轉(zhuǎn)錄，采用熒光定量PCR檢測UBE2L3的表達(dá)情況。引物序列見表1。

1.7 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測成肌分化標(biāo)志因子選擇6孔板用來培養(yǎng)所需蛋白，分組處理后，收集進(jìn)行低溫超速離心10 min，吸取上清，吸取過程中避免接觸底壁沉淀，-80℃保存。利用BCA法檢測樣品的蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度進(jìn)行Western blot試驗檢測分化標(biāo)志因子MyoG以及MyHC。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.8 統(tǒng)計分析每組試驗設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。EdU結(jié)果采用χ2進(jìn)行分析；利用t檢驗對分析熒光定量PCR和Western blot結(jié)果進(jìn)行分析，其中熒光定量PCR結(jié)果按2-ΔΔCt計算，熒光定量PCR以GAPDH基因作為內(nèi)參對檢測的目的基因進(jìn)行歸一化，“*”表示差異顯著(P<0.05)，“**”表示差異極顯著(P<0.01)。

2 結(jié)果

2.1 增殖分化UBE2L3的表達(dá)量分別提取BSMSCs增殖期第1天和分化期第3天的總RNA和總蛋白，檢測UBE2L3的mRNA以及蛋白表達(dá)水平變化。結(jié)果可見在分化前后UBE2L3在mRNA水平上沒有顯著性差異(P>0.05)(圖1A);在蛋白表達(dá)水平上分化期UBE2L3的表達(dá)水平明顯上升(P<0.01)，且與增殖期相比差異顯著(圖1B)。

2.2 BSMSCs中UBE2L3的干擾及過表達(dá)效果檢測將依據(jù)UBE2L3序列設(shè)計3個小片段干擾RNA，以及正確的UBE2L3的過表達(dá)載體pcDNA-UBE2L3，分別轉(zhuǎn)染BSMSCs，24 h后檢測UBE2L3的表達(dá)情況，結(jié)果可知，si-UBE2L3-3的干擾效果最好(P<0.01)，可以用于后續(xù)研究(圖2)；轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-UBE2L3后，UBE2L3 mRNA以及蛋白表達(dá)量極顯著高于對照組，結(jié)果說明該載體過表達(dá)效果明顯可以用于后續(xù)試驗(圖3)。

2.3 UBE2L3對BSMSCs增殖的影響分別將干擾RNA和過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于96孔板中，24 h后用EdU染色檢測法檢測BSMSCs增殖狀態(tài)。試驗可見干擾或過表達(dá)UBE2L3后BSMSCs的增殖與對照組相比差異不顯著(P>0.05)，說明UBE2L3對BSMSCs的增殖影響效果不明顯(圖4)。

A.UBE2L3 mRNA表達(dá)量；B.UBE2L3蛋白相對表達(dá)量。GM.BSMSCs增殖期；DM.BSMSCs誘導(dǎo)分化72 h。*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01)。下同

圖2 siRNA的干擾效果檢測

圖3 UBE2L3質(zhì)粒載體的過表達(dá)效果檢測

2.4 UBE2L3對BSMSCs成肌分化的影響分別用干擾RNA與過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BSMSCs，誘導(dǎo)分化72 h。顯微鏡下觀察BSMSCs分化后肌管形成狀態(tài)，結(jié)果顯示與轉(zhuǎn)染了陰性對照的BSMSCs相比，轉(zhuǎn)染si-UBE2L3后，BSMSCs分化形成的肌管直徑大于對照組；轉(zhuǎn)染pcDNA-UBE2L3后，BSMSCs分化形成的肌管直徑與數(shù)量小于對照組(圖5)。提取BSMSCs總RNA后，檢測分化標(biāo)志因子表達(dá)量，結(jié)果顯示干擾UBE2L3的表達(dá)后，MyoG mRNA表達(dá)量極顯著上調(diào)(P<0.01)，MyHC的表達(dá)水平與對照組相比差異不顯著(P>0.05)(圖6A)；過表達(dá)UBE2L3后， MyoG mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，MyHC表達(dá)量與對照組相比極顯著降低(P<0.01)(圖6B)。通過Western blot 檢測MyoG和MyHC蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，干擾UBE2L3的表達(dá)后，MyoG和MyHC蛋白表達(dá)量極顯著高于對照組(P<0.01)(圖6C)；過表達(dá)UBE2L3后，MyoG蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，MyHC蛋白表達(dá)量極顯著低于對照組(P<0.01)(圖6D)。結(jié)果表明干擾UBE2L3可以促進(jìn)成肌分化，而過表達(dá)UBE2L3則抑制成肌分化過程。

3 討論

骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞通過某些信號通路的激活，不斷增殖分化，和肌纖維融合成肌核，致使骨骼肌纖維的肥大以及骨骼肌纖維類型的相互轉(zhuǎn)化,進(jìn)而影響肉品質(zhì)[14-15]。肌衛(wèi)星細(xì)胞在體外的成肌分化過程可以模擬其在體內(nèi)的發(fā)育過程，為體外探究細(xì)胞分化及肌肉發(fā)育機(jī)制提供了良好的細(xì)胞模型。泛素蛋白酶體系統(tǒng)作為細(xì)胞內(nèi)不可或缺的一部分，可以影響細(xì)胞的生長周期、基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)等[16]。有研究表明UBE2M可以通過Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡[17]。洪小山等[18]通過在體外培養(yǎng)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞,下調(diào)泛素結(jié)合酶E2異構(gòu)體-1(UEV1)之后發(fā)現(xiàn)，下調(diào)UEV1通過調(diào)控ATF6、CHOP、C-myc及Ki-67抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲正常細(xì)胞。由此可見泛素結(jié)合酶作為泛素蛋白酶體途徑可以影響細(xì)胞周期。細(xì)胞周期的進(jìn)展受到CDK抑制劑(如p27)的嚴(yán)格控制，泛素結(jié)合酶UBE2L3特異性地保護(hù)p27不被降解，UBE2L3的過表達(dá)穩(wěn)定了p27，延遲了G-S轉(zhuǎn)換[19]。MA等[20]利用NSCLC腫瘤研究發(fā)現(xiàn)UBE2L3通過SCF(Skp2)介導(dǎo)的p27kip1降解，以細(xì)胞周期依賴性的方式調(diào)控NSCLC細(xì)胞生長。UBE2L3可以通過調(diào)控GSK3β/P65/PUMA 信號通路，抑制肝癌細(xì)胞的凋亡[21]。綜上研究UBE2L3作為泛素蛋白酶體途徑中必不可少的一部分，會在細(xì)胞增殖分化過程中發(fā)揮作用，但在BSMSCs的作用并不清楚。通過檢測BSMSCs增殖分化過程中UBE2L3的mRNA和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果UBE2L3的蛋白表達(dá)量在BSMSCs增殖分化前后存在顯著性差異，UBE2L3在BSMSCs分化期的表達(dá)量較高，由此推斷其對BSMSCs的增殖分化過程可能存在一定的影響。

圖4 EdU法檢測干擾(A)以及過表達(dá)(B)UBE2L3對BSMSCs增殖的影響

旋毛蟲是一種肌肉特異性的寄生蠕蟲，是一種獨特的細(xì)胞內(nèi)寄生蟲。旋毛蟲對終末分化的骨骼肌細(xì)胞進(jìn)行重新編程，導(dǎo)致它們?nèi)シ只⒅匦逻M(jìn)入細(xì)胞周期，這一過程在哺乳動物骨骼肌細(xì)胞中不能自然發(fā)生，但具有巨大的治療潛力。有研究證明旋毛蟲分泌的蛋白具有E2和E3活性，其中 E2 結(jié)合酶主要是 UBE2L3(TsUBE2L3)，TsUBE2L3可以特異性的結(jié)合人RING E3 連接酶，在骨骼肌細(xì)胞中表TsUBE2L3會造成肌肉特異性蛋白泛素化水平的廣泛降低，主要影響肌動蛋白、肌節(jié)蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，進(jìn)而通過泛素化降解途徑影響這些蛋白的穩(wěn)定性[22]。試驗中通過設(shè)計UBE2L3的si-RNA抑制其表達(dá)，干擾UBE2L3后發(fā)現(xiàn)，肌管數(shù)量以及直徑明顯大于對照組，與此同時BSMSCs分化標(biāo)志因子MyoG以及MyHC的蛋白表達(dá)量上調(diào)，干擾UBE2L3表達(dá)會促進(jìn)牛肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化；構(gòu)建UBE2L3過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染72 h 后，BSMSCs分化的肌管數(shù)量以及直徑明顯小于對照組，MyoG以及MyHC的蛋白表達(dá)量下調(diào)，說明過表達(dá)UBE2L3后，BSMSCs的分化能力減弱。本研究發(fā)現(xiàn)，UBE2L3對BSMSCs的成肌分化過程中有顯著的調(diào)控作用，與上述肝癌細(xì)胞以及旋毛蟲研究類似，在BSMSCs研究過程中，UBE2L3僅表現(xiàn)了對其分化的調(diào)控能力，并沒有表現(xiàn)在肝癌細(xì)胞和旋毛蟲類似的對增殖的調(diào)控作用，這可能是UBE2L3在不同類型細(xì)胞中會發(fā)揮不同的作用，仍需要進(jìn)一步的研究。

A,C.干擾UBE2L3后MgHC和MgoG mRNA和蛋白表達(dá)量；B,D.過表達(dá)UBE2L3后MyoC和MyHC mRNA和蛋白表達(dá)量