豬睪丸組織的形態(tài)學觀察、細胞凋亡和巴豆?；揎?/h1>
2022-03-04 03:56:44孟碟方趙怡凡方俊博馬增友武曼曼福建農林大學動物科學學院蜂學學院福建福州350002
中國獸醫(yī)學報 2022年2期
孟碟方，趙怡凡，方俊博，馬增友，武曼曼，秦 歌，彭 輝 (福建農林大學 動物科學學院/蜂學學院，福建 福州 350002)
凋亡是一種程序性細胞死亡[1],細胞凋亡或程序性細胞死亡在生殖器官中更明顯，可以在睪丸內的多個部位發(fā)生[2-4]。在雄性睪丸發(fā)育與精子發(fā)生過程中，細胞凋亡在控制生殖細胞數(shù)量和清除缺陷生殖細胞方面起著重要作用[5-6]。在增殖過程中染色體異常的精原細胞會在凋亡后被清除，在多種家畜中也已經報道過自發(fā)性精原細胞凋亡的情況。生殖細胞的成熟與支持細胞密切相關，一般支持細胞的凋亡率較低，早期過量產生的精原細胞最終會選擇性凋亡以平衡生殖細胞/支持細胞的比率[7-8]。在成年大鼠中A2-A4型精母細胞會發(fā)生凋亡[8-9]，從而保持恒定數(shù)量的細胞進入減數(shù)分裂期。
研究表明，賴氨酸?；饔冒ㄙ嚢彼嵋阴；⒈；⒍□；?、琥珀酰化、丙二?；?、戊二?；投辊；?crotonylation,Kcr)和β-羥基異丁?；?。其中賴氨酸Kcr是一種進化上保守的組蛋白標記，最初在組蛋白上發(fā)現(xiàn)，進一步研究表明大量非組蛋白也可以發(fā)生Kcr修飾。Kcr作為一種新型的酰化修飾，是由?；D移酶以巴豆酰輔酶A為底物，將巴豆?；鶊F轉移到賴氨酸殘基上而產生的一種新型修飾。該修飾類型在人類體細胞和小鼠雄性生殖細胞基因組中首次發(fā)現(xiàn)，并在雄性生殖細胞中富集[10]，參與啟動雄性單倍體細胞基因的表達[11]。Kcr修飾多發(fā)生在參與RNA加工、核酸代謝、染色體組織和基因表達的核蛋白上，多種蛋白功能和細胞過程受Kcr的調控[12]。
本試驗研究不同發(fā)育階段豬睪丸組織的形態(tài)學變化以及精子發(fā)生過程中細胞凋亡情況和Kcr修飾水平。該研究結果為揭示豬精子發(fā)生過程中的形態(tài)變化及調控機制提供參考，也為深入研究哺乳動物精子發(fā)生過程中的分子機制奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物2，4，6，8月齡杜洛克公豬睪丸取自福建某種豬場。
1.2 主要試劑DAPI染色液、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、Western blot相關試劑和免疫熒光染色試劑購自碧云天生物技術有限公司；免疫印跡二抗Odyssey?Demo Kit Ⅱ購自LI-COR公司；Anti-crotonyllysine rabbit pAb抗體、H2BK34cr pAb和H2BK20cr pAb購自杭州景杰生物科技有限公司。
1.3 睪丸組織切片制備豬睪丸組織在PBS中清洗2次，加入4%多聚甲醛溶液進行固定，1 d后取出用蒸餾水沖洗12 h。睪丸組織依次放入由低到高濃度的酒精中脫水，經過二甲苯透明和石蠟包埋，將組織塊固定在切片機上切出厚約5 μm的切片，展片和撈片后放入60℃左右恒溫烘干箱烘干備用。
1.4 HE染色用二甲苯除去睪丸切片中殘存的石蠟，再將切片放入從高到低濃度的酒精中，之后置于蒸餾水中2 min。取出切片在蘇木精染液中染色3～8 min，用蒸餾水沖洗5 min。再將切片置于1%鹽酸酒精中分化數(shù)秒，蒸餾水沖洗后再用0.6%氨水返藍，蒸餾水沖洗，在伊紅染色液中染色2～3 min。染色后的切片經無水乙醇脫水、二甲苯透明、滴上樹膠、蓋上蓋玻片封片。
1.5 TUNEL染色切片水化后滴加不含DNase的20 mg/L蛋白酶K，室溫處理15～30 min，用PBS沖洗切片3～5次。配制TUNEL檢測液，標記為TdT酶∶熒光標記液∶TUNEL檢測液=1∶9∶10。每張切片滴加50 μL TUNEL檢測液覆蓋組織樣品，室溫避光孵育1 h。PBS沖洗切片3次，滴加DAPI染色液室溫避光染色10 min。最后將抗熒光淬滅封片液滴加在切片上進行封片，在熒光顯微鏡下觀察，隨機選取5個視野，計算凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。
1.6 睪丸蛋白樣品的制備剪取100 mg左右的睪丸組織放入離心管中，加入1 mL組織裂解液(IP)和蛋白酶抑制劑(PMSF)混合液(IP∶PMSF=100∶1)以及鋼珠，將離心管置于預冷過的高通量組織研磨儀中，70 HZ，60 s進行研磨。研磨后的混合液在4℃離心機13 000×g，離心10 min。吸取上清液加入Loading bufferr充分混合，100℃水浴鍋中孵育10 min，-20℃保存。
1.7 免疫印跡制備12%SDS-PAGE凝膠，吸取等量的蛋白樣品加入凝膠電泳泳道，電壓設置為上層膠80 V/30 min，下層膠120 V/1 h進行電泳。根據(jù)目的蛋白的大小將凝膠裁下，用濕轉法將凝膠上的蛋白轉移到NC膜上。將NC膜正面向上放入含有5%脫脂奶粉的TBS/0.1% Tween 20(TBST)溶液中，室溫封閉3 h。封閉結束后，用TBST溶液按相應比例稀釋目的蛋白抗體(anti-crotonyllysine rabbit pAb按1∶1 000稀釋；H2BK34cr pAb和H2BK20cr pAb按1∶2 000稀釋)，NC膜正面向上浸沒在一抗稀釋液中4℃過夜孵育。TBST洗NC膜3次，每次5 min。再用TBST溶液按1∶20 000比例稀釋IRDye?近紅外熒光二抗，室溫避光孵育2 h。TBST室溫避光洗3次，每次5 min。Actin作為內參，用雙色紅外激光成像系統(tǒng)Odyssey CLx進行曝光拍照。
1.8 免疫熒光睪丸組織切片脫蠟后，通過不同濃度乙醇對切片進行水化處理。免疫染色洗滌液沖洗切片3次，每次5 min，使用含0.2%Triton X-100的PBS液體室溫孵育20 min通透打孔。之后用免疫染色洗滌液沖洗切片1次，在組織上滴加專用封閉液室溫封閉4 h。用一抗稀釋液按1∶500稀釋Kcr泛抗體，在切片組織上滴加一抗4℃過夜孵育。用免疫熒光洗滌液洗3次，每次5 min。熒光二抗按1∶500稀釋，室溫避光孵育2 h。用免疫熒光洗滌液沖洗切片3次，每次5 min。DAPI染色液染核，染色時間5 min。用免疫熒光洗滌液沖洗切片3次，每次5 min，最后在切片上滴加熒光抗淬滅劑后進行封片，通過LEICA熒光顯微鏡觀察并拍照。
2 結果
2.1 不同發(fā)育階段豬睪丸組織的形態(tài)學觀察豬睪丸組織切片HE染色顯示，隨著月齡的增加，精細管由不規(guī)則形狀逐漸發(fā)育成近圓形(圖1A)，管腔直徑顯著增大(圖1B)；管腔內支持細胞逐漸發(fā)育、體積增大并呈不規(guī)則椎體。被支持細胞包裹的生精細胞從4月齡開始分裂，排列逐漸有序表示精子發(fā)生正常進行(圖1A)。
A.不同發(fā)育時期豬睪丸切片HE染色(比例50 μm)；B.不同發(fā)育時期豬睪丸精細管管腔直徑
2.2 不同發(fā)育階段豬睪丸內細胞凋亡變化為了研究睪丸細胞凋亡變化情況，對睪丸組織進行凋亡染色。如圖2A所示，不同發(fā)育階段豬睪丸細胞均有少量的TUNEL陽性生精細胞。就凋亡指數(shù)而言，4，6月齡組的凋亡指數(shù)顯著高于2，8月齡組(P<0.05)。
2.3 不同發(fā)育階段豬睪丸蛋白Kcr修飾水平為了檢測豬睪丸蛋白Kcr修飾水平，提取不同發(fā)育階段豬睪丸蛋白進行免疫印跡分析。如圖3A所示，利用Kcr泛抗體檢測豬睪丸蛋白Kcr修飾水平時，每個泳道都檢測出多個條帶，說明每個發(fā)育階段的睪丸中都有較多的蛋白質發(fā)生Kcr修飾，其中大部分條帶隨著月齡增加而逐漸減弱。利用H2BK20cr和H2BK34cr位點特異性抗體分別檢測H2BK20和H2BK34位點的Kcr水平，如圖3B所示，H2BK20和H2BK34位點的Kcr修飾水平隨著月齡增加而逐漸降低。
2.4 不同發(fā)育階段豬睪丸Kcr蛋白定位將不同發(fā)育階段豬睪丸制成組織切片，通過免疫熒光試驗進一步研究Kcr蛋白在豬睪丸組織中的定位。由圖4可知，在不同月齡的豬睪丸中，睪丸間質細胞、足細胞和生精細胞內都存在Kcr修飾，隨著月齡的增加，整體修飾水平有下降的趨勢。
3 討論
豬睪丸組織切片HE染色表明，從2～6月齡豬睪丸精細管管腔內支持細胞逐漸發(fā)育、體積增大并呈不規(guī)則椎體。被支持細胞包裹的生精細胞從4月齡開始分裂產生精細胞。在嚙齒類動物中，支持細胞數(shù)量在睪丸分化后持續(xù)增加，直到大鼠出生后15 d 和小鼠青春期早期，此后數(shù)量保持不變[13-16]。在家畜上，睪丸支持細胞的增殖發(fā)生在公羊出生后的6～12周[17-19]，公豬出生后的17周前后[20]，公牛出生后的20周左右[21]。在精母細胞進入第1次減數(shù)分裂前，支持細胞之間通過特殊連接形成血液-睪丸屏障[22-24]，該屏障的形成是精子發(fā)生的關鍵，任何延遲都會阻止減數(shù)分裂的開始[24-25]。
A.藍色熒光為細胞核染色;綠色熒光為凋亡細胞染色(比例尺50 μm)；B.凋亡指數(shù)的統(tǒng)計
A.Kcr蛋白在不同發(fā)育階段豬睪丸細胞中的表達;B.H2BK20和H2BK34在豬睪丸中的Kcr修飾水平。M.蛋白Marker;1.2月齡；2.4月齡；3.6月齡；4.8月齡
圖4 Kcr蛋白在不同發(fā)育階段豬睪丸中的定位(比例尺50 μm)
在精子發(fā)生過程中，生殖細胞經歷有絲分裂、減數(shù)分裂和細胞變形產生成熟的精子。在形成精子的過程中，細胞核和染色質會發(fā)生變化。組蛋白由特異性變體到過渡蛋白，最后被魚精蛋白所取代，導致精子染色質的高度濃縮狀態(tài)[26]。精子發(fā)生的正常完成和成熟精子的最終數(shù)量取決于發(fā)育中的生殖細胞和支持細胞的相互作用。豬睪丸組織的TUNEL染色表明4，6月齡這2個月齡的凋亡細胞數(shù)量相較于2，8月齡時顯著增加，說明從4月齡開始生精細胞開始減數(shù)分裂，支持細胞已發(fā)育成熟，為維持生殖細胞和支持細胞比例的平衡，部分精原細胞出現(xiàn)凋亡。
Kcr是最近發(fā)現(xiàn)的蛋白新型修飾類型，真核細胞中的組蛋白和非組蛋白都能發(fā)生Kcr修飾。HAWKINS等[27]鑒定了人類組蛋白上130個修飾位點，包括63個已知和67個新的組蛋白標記，其中有28個Kcr位點，首次發(fā)現(xiàn)組蛋白Kcr修飾可以作為活性基因轉錄起始位點的標記和被預測為增強子的區(qū)域。在減數(shù)分裂后的雄性生殖細胞中，組蛋白Kcr的增加促進了X連鎖單倍體細胞特異性基因的表達，作為減數(shù)分裂后活性性染色體相關基因的特異性標記[10]。為進一步研究豬睪丸蛋白中的Kcr修飾情況和Kcr蛋白的定位，本試驗使用抗Kcr的泛抗體進行免疫印跡和免疫熒光檢測，免疫印跡結果顯示大部分蛋白條帶隨著豬月齡的增加而減弱，說明整體Kcr修飾水平有下降的趨勢，造成該結果的一個原因可能為在精子發(fā)生過程中組蛋白逐漸被魚精蛋白取代所致。BAKER等[13]使用抗Kcr的泛抗體在核心組蛋白H2B檢測到Kcr信號，在核小體外表面發(fā)現(xiàn)了新的PTM位點，包括H2BK116的單甲基賴氨酸和甲酰賴氨酸，推測這些位點極有可能對轉錄和表觀遺傳調控產生重要影響。在哺乳動物中，已經確定了7個組蛋白H3 Kcr修飾位點(H3K4、H3K9、H3K18、H3K23、H3K27、H3K56和H3K-122)和3個組蛋白H4 Kcr修飾位點(H4K5、H4K8和H4K12)[10,28]。在植物中，用Kcr泛抗體和H3K14cr特異性抗體進行水稻幼苗組蛋白Kcr的全基因組檢測，鑒定了4個組蛋白Kcr修飾位點，分別為H3K14、H3K79、H4K31和H4K79[29]。本研究挑選組蛋白H2BK20和H2BK34這2個位點進行Kcr修飾水平分析，結果顯示隨著月齡的增加，豬睪丸組織Kcr修飾水平逐漸降低，提示精子發(fā)生過程中組蛋白逐漸被魚精蛋白所取代，組蛋白上Kcr修飾逐漸減少。
本研究利用免疫熒光技術檢測Kcr蛋白在豬睪丸組織中的定位，結果顯示在睪丸細胞中均能檢測到Kcr蛋白定位，提示Kcr蛋白在多種類型細胞中均存在且發(fā)揮一定的作用。在同一種類型細胞中，Kcr蛋白在細胞質和細胞核中也均有定位，說明除了組蛋白能發(fā)生Kcr以外，大量的非組蛋白也能發(fā)生Kcr。隨著豬月齡的增加，切片的免疫熒光強度減弱趨勢明顯，該觀察結果與免疫印跡的結果一致。研究表明蛋白的Kcr修飾參與哺乳動物精子的發(fā)生，但具體的調控機制還不清楚，本研究后期將利用多種方法進一步揭示Kcr蛋白在豬睪丸發(fā)育過程中的功能。
孟碟方，趙怡凡，方俊博，馬增友，武曼曼，秦 歌，彭 輝 (福建農林大學 動物科學學院/蜂學學院，福建 福州 350002)
凋亡是一種程序性細胞死亡[1],細胞凋亡或程序性細胞死亡在生殖器官中更明顯，可以在睪丸內的多個部位發(fā)生[2-4]。在雄性睪丸發(fā)育與精子發(fā)生過程中，細胞凋亡在控制生殖細胞數(shù)量和清除缺陷生殖細胞方面起著重要作用[5-6]。在增殖過程中染色體異常的精原細胞會在凋亡后被清除，在多種家畜中也已經報道過自發(fā)性精原細胞凋亡的情況。生殖細胞的成熟與支持細胞密切相關，一般支持細胞的凋亡率較低，早期過量產生的精原細胞最終會選擇性凋亡以平衡生殖細胞/支持細胞的比率[7-8]。在成年大鼠中A2-A4型精母細胞會發(fā)生凋亡[8-9]，從而保持恒定數(shù)量的細胞進入減數(shù)分裂期。
研究表明，賴氨酸?；饔冒ㄙ嚢彼嵋阴；⒈；⒍□；?、琥珀酰化、丙二?；?、戊二?；投辊；?crotonylation,Kcr)和β-羥基異丁?；?。其中賴氨酸Kcr是一種進化上保守的組蛋白標記，最初在組蛋白上發(fā)現(xiàn)，進一步研究表明大量非組蛋白也可以發(fā)生Kcr修飾。Kcr作為一種新型的酰化修飾，是由?；D移酶以巴豆酰輔酶A為底物，將巴豆?；鶊F轉移到賴氨酸殘基上而產生的一種新型修飾。該修飾類型在人類體細胞和小鼠雄性生殖細胞基因組中首次發(fā)現(xiàn)，并在雄性生殖細胞中富集[10]，參與啟動雄性單倍體細胞基因的表達[11]。Kcr修飾多發(fā)生在參與RNA加工、核酸代謝、染色體組織和基因表達的核蛋白上，多種蛋白功能和細胞過程受Kcr的調控[12]。
本試驗研究不同發(fā)育階段豬睪丸組織的形態(tài)學變化以及精子發(fā)生過程中細胞凋亡情況和Kcr修飾水平。該研究結果為揭示豬精子發(fā)生過程中的形態(tài)變化及調控機制提供參考，也為深入研究哺乳動物精子發(fā)生過程中的分子機制奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物2，4，6，8月齡杜洛克公豬睪丸取自福建某種豬場。
1.2 主要試劑DAPI染色液、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、Western blot相關試劑和免疫熒光染色試劑購自碧云天生物技術有限公司；免疫印跡二抗Odyssey?Demo Kit Ⅱ購自LI-COR公司；Anti-crotonyllysine rabbit pAb抗體、H2BK34cr pAb和H2BK20cr pAb購自杭州景杰生物科技有限公司。
1.3 睪丸組織切片制備豬睪丸組織在PBS中清洗2次，加入4%多聚甲醛溶液進行固定，1 d后取出用蒸餾水沖洗12 h。睪丸組織依次放入由低到高濃度的酒精中脫水，經過二甲苯透明和石蠟包埋，將組織塊固定在切片機上切出厚約5 μm的切片，展片和撈片后放入60℃左右恒溫烘干箱烘干備用。
1.4 HE染色用二甲苯除去睪丸切片中殘存的石蠟，再將切片放入從高到低濃度的酒精中，之后置于蒸餾水中2 min。取出切片在蘇木精染液中染色3～8 min，用蒸餾水沖洗5 min。再將切片置于1%鹽酸酒精中分化數(shù)秒，蒸餾水沖洗后再用0.6%氨水返藍，蒸餾水沖洗，在伊紅染色液中染色2～3 min。染色后的切片經無水乙醇脫水、二甲苯透明、滴上樹膠、蓋上蓋玻片封片。
1.5 TUNEL染色切片水化后滴加不含DNase的20 mg/L蛋白酶K，室溫處理15～30 min，用PBS沖洗切片3～5次。配制TUNEL檢測液，標記為TdT酶∶熒光標記液∶TUNEL檢測液=1∶9∶10。每張切片滴加50 μL TUNEL檢測液覆蓋組織樣品，室溫避光孵育1 h。PBS沖洗切片3次，滴加DAPI染色液室溫避光染色10 min。最后將抗熒光淬滅封片液滴加在切片上進行封片，在熒光顯微鏡下觀察，隨機選取5個視野，計算凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。
1.6 睪丸蛋白樣品的制備剪取100 mg左右的睪丸組織放入離心管中，加入1 mL組織裂解液(IP)和蛋白酶抑制劑(PMSF)混合液(IP∶PMSF=100∶1)以及鋼珠，將離心管置于預冷過的高通量組織研磨儀中，70 HZ，60 s進行研磨。研磨后的混合液在4℃離心機13 000×g，離心10 min。吸取上清液加入Loading bufferr充分混合，100℃水浴鍋中孵育10 min，-20℃保存。
1.7 免疫印跡制備12%SDS-PAGE凝膠，吸取等量的蛋白樣品加入凝膠電泳泳道，電壓設置為上層膠80 V/30 min，下層膠120 V/1 h進行電泳。根據(jù)目的蛋白的大小將凝膠裁下，用濕轉法將凝膠上的蛋白轉移到NC膜上。將NC膜正面向上放入含有5%脫脂奶粉的TBS/0.1% Tween 20(TBST)溶液中，室溫封閉3 h。封閉結束后，用TBST溶液按相應比例稀釋目的蛋白抗體(anti-crotonyllysine rabbit pAb按1∶1 000稀釋；H2BK34cr pAb和H2BK20cr pAb按1∶2 000稀釋)，NC膜正面向上浸沒在一抗稀釋液中4℃過夜孵育。TBST洗NC膜3次，每次5 min。再用TBST溶液按1∶20 000比例稀釋IRDye?近紅外熒光二抗，室溫避光孵育2 h。TBST室溫避光洗3次，每次5 min。Actin作為內參，用雙色紅外激光成像系統(tǒng)Odyssey CLx進行曝光拍照。
1.8 免疫熒光睪丸組織切片脫蠟后，通過不同濃度乙醇對切片進行水化處理。免疫染色洗滌液沖洗切片3次，每次5 min，使用含0.2%Triton X-100的PBS液體室溫孵育20 min通透打孔。之后用免疫染色洗滌液沖洗切片1次，在組織上滴加專用封閉液室溫封閉4 h。用一抗稀釋液按1∶500稀釋Kcr泛抗體，在切片組織上滴加一抗4℃過夜孵育。用免疫熒光洗滌液洗3次，每次5 min。熒光二抗按1∶500稀釋，室溫避光孵育2 h。用免疫熒光洗滌液沖洗切片3次，每次5 min。DAPI染色液染核，染色時間5 min。用免疫熒光洗滌液沖洗切片3次，每次5 min，最后在切片上滴加熒光抗淬滅劑后進行封片，通過LEICA熒光顯微鏡觀察并拍照。
2 結果
2.1 不同發(fā)育階段豬睪丸組織的形態(tài)學觀察豬睪丸組織切片HE染色顯示，隨著月齡的增加，精細管由不規(guī)則形狀逐漸發(fā)育成近圓形(圖1A)，管腔直徑顯著增大(圖1B)；管腔內支持細胞逐漸發(fā)育、體積增大并呈不規(guī)則椎體。被支持細胞包裹的生精細胞從4月齡開始分裂，排列逐漸有序表示精子發(fā)生正常進行(圖1A)。
A.不同發(fā)育時期豬睪丸切片HE染色(比例50 μm)；B.不同發(fā)育時期豬睪丸精細管管腔直徑
2.2 不同發(fā)育階段豬睪丸內細胞凋亡變化為了研究睪丸細胞凋亡變化情況，對睪丸組織進行凋亡染色。如圖2A所示，不同發(fā)育階段豬睪丸細胞均有少量的TUNEL陽性生精細胞。就凋亡指數(shù)而言，4，6月齡組的凋亡指數(shù)顯著高于2，8月齡組(P<0.05)。
2.3 不同發(fā)育階段豬睪丸蛋白Kcr修飾水平為了檢測豬睪丸蛋白Kcr修飾水平，提取不同發(fā)育階段豬睪丸蛋白進行免疫印跡分析。如圖3A所示，利用Kcr泛抗體檢測豬睪丸蛋白Kcr修飾水平時，每個泳道都檢測出多個條帶，說明每個發(fā)育階段的睪丸中都有較多的蛋白質發(fā)生Kcr修飾，其中大部分條帶隨著月齡增加而逐漸減弱。利用H2BK20cr和H2BK34cr位點特異性抗體分別檢測H2BK20和H2BK34位點的Kcr水平，如圖3B所示，H2BK20和H2BK34位點的Kcr修飾水平隨著月齡增加而逐漸降低。
2.4 不同發(fā)育階段豬睪丸Kcr蛋白定位將不同發(fā)育階段豬睪丸制成組織切片，通過免疫熒光試驗進一步研究Kcr蛋白在豬睪丸組織中的定位。由圖4可知，在不同月齡的豬睪丸中，睪丸間質細胞、足細胞和生精細胞內都存在Kcr修飾，隨著月齡的增加，整體修飾水平有下降的趨勢。
3 討論
豬睪丸組織切片HE染色表明，從2～6月齡豬睪丸精細管管腔內支持細胞逐漸發(fā)育、體積增大并呈不規(guī)則椎體。被支持細胞包裹的生精細胞從4月齡開始分裂產生精細胞。在嚙齒類動物中，支持細胞數(shù)量在睪丸分化后持續(xù)增加，直到大鼠出生后15 d 和小鼠青春期早期，此后數(shù)量保持不變[13-16]。在家畜上，睪丸支持細胞的增殖發(fā)生在公羊出生后的6～12周[17-19]，公豬出生后的17周前后[20]，公牛出生后的20周左右[21]。在精母細胞進入第1次減數(shù)分裂前，支持細胞之間通過特殊連接形成血液-睪丸屏障[22-24]，該屏障的形成是精子發(fā)生的關鍵，任何延遲都會阻止減數(shù)分裂的開始[24-25]。
A.藍色熒光為細胞核染色;綠色熒光為凋亡細胞染色(比例尺50 μm)；B.凋亡指數(shù)的統(tǒng)計
A.Kcr蛋白在不同發(fā)育階段豬睪丸細胞中的表達;B.H2BK20和H2BK34在豬睪丸中的Kcr修飾水平。M.蛋白Marker;1.2月齡；2.4月齡；3.6月齡；4.8月齡
圖4 Kcr蛋白在不同發(fā)育階段豬睪丸中的定位(比例尺50 μm)
在精子發(fā)生過程中，生殖細胞經歷有絲分裂、減數(shù)分裂和細胞變形產生成熟的精子。在形成精子的過程中，細胞核和染色質會發(fā)生變化。組蛋白由特異性變體到過渡蛋白，最后被魚精蛋白所取代，導致精子染色質的高度濃縮狀態(tài)[26]。精子發(fā)生的正常完成和成熟精子的最終數(shù)量取決于發(fā)育中的生殖細胞和支持細胞的相互作用。豬睪丸組織的TUNEL染色表明4，6月齡這2個月齡的凋亡細胞數(shù)量相較于2，8月齡時顯著增加，說明從4月齡開始生精細胞開始減數(shù)分裂，支持細胞已發(fā)育成熟，為維持生殖細胞和支持細胞比例的平衡，部分精原細胞出現(xiàn)凋亡。
Kcr是最近發(fā)現(xiàn)的蛋白新型修飾類型，真核細胞中的組蛋白和非組蛋白都能發(fā)生Kcr修飾。HAWKINS等[27]鑒定了人類組蛋白上130個修飾位點，包括63個已知和67個新的組蛋白標記，其中有28個Kcr位點，首次發(fā)現(xiàn)組蛋白Kcr修飾可以作為活性基因轉錄起始位點的標記和被預測為增強子的區(qū)域。在減數(shù)分裂后的雄性生殖細胞中，組蛋白Kcr的增加促進了X連鎖單倍體細胞特異性基因的表達，作為減數(shù)分裂后活性性染色體相關基因的特異性標記[10]。為進一步研究豬睪丸蛋白中的Kcr修飾情況和Kcr蛋白的定位，本試驗使用抗Kcr的泛抗體進行免疫印跡和免疫熒光檢測，免疫印跡結果顯示大部分蛋白條帶隨著豬月齡的增加而減弱，說明整體Kcr修飾水平有下降的趨勢，造成該結果的一個原因可能為在精子發(fā)生過程中組蛋白逐漸被魚精蛋白取代所致。BAKER等[13]使用抗Kcr的泛抗體在核心組蛋白H2B檢測到Kcr信號，在核小體外表面發(fā)現(xiàn)了新的PTM位點，包括H2BK116的單甲基賴氨酸和甲酰賴氨酸，推測這些位點極有可能對轉錄和表觀遺傳調控產生重要影響。在哺乳動物中，已經確定了7個組蛋白H3 Kcr修飾位點(H3K4、H3K9、H3K18、H3K23、H3K27、H3K56和H3K-122)和3個組蛋白H4 Kcr修飾位點(H4K5、H4K8和H4K12)[10,28]。在植物中，用Kcr泛抗體和H3K14cr特異性抗體進行水稻幼苗組蛋白Kcr的全基因組檢測，鑒定了4個組蛋白Kcr修飾位點，分別為H3K14、H3K79、H4K31和H4K79[29]。本研究挑選組蛋白H2BK20和H2BK34這2個位點進行Kcr修飾水平分析，結果顯示隨著月齡的增加，豬睪丸組織Kcr修飾水平逐漸降低，提示精子發(fā)生過程中組蛋白逐漸被魚精蛋白所取代，組蛋白上Kcr修飾逐漸減少。
本研究利用免疫熒光技術檢測Kcr蛋白在豬睪丸組織中的定位，結果顯示在睪丸細胞中均能檢測到Kcr蛋白定位，提示Kcr蛋白在多種類型細胞中均存在且發(fā)揮一定的作用。在同一種類型細胞中，Kcr蛋白在細胞質和細胞核中也均有定位，說明除了組蛋白能發(fā)生Kcr以外，大量的非組蛋白也能發(fā)生Kcr。隨著豬月齡的增加，切片的免疫熒光強度減弱趨勢明顯，該觀察結果與免疫印跡的結果一致。研究表明蛋白的Kcr修飾參與哺乳動物精子的發(fā)生，但具體的調控機制還不清楚，本研究后期將利用多種方法進一步揭示Kcr蛋白在豬睪丸發(fā)育過程中的功能。
