具核梭桿菌體外對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞超微形態(tài)和機(jī)能的影響

張艷芳，李 鵬，劉金宵,3，潘耀謙*，劉興友.2* ( .新鄉(xiāng)學(xué)院 生命科學(xué)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)453007；3.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 45000)

具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum,F.nucleatum)屬于革蘭陰性專(zhuān)性厭氧菌。菌體中部稍膨大，兩端較尖細(xì)，外觀呈紡錘狀。本菌廣泛存在于多種動(dòng)物和人體內(nèi)，特別多見(jiàn)于口腔，是引起牙周病和牙石的常見(jiàn)病原菌[1-2]。此外，本菌還引起機(jī)體其他部位感染，包括腦、肺臟、肝臟、脾臟等器官和腹部膿腫[3]。但近年來(lái)大量研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn).nucleatum與人結(jié)直腸癌(CRC)發(fā)生有密切關(guān)系[4-6]。CRC是人類(lèi)消化道常見(jiàn)的致命性惡性腫瘤，在全球發(fā)病率很高，病死率位列惡性腫瘤的第3位，每年因CRC死亡人數(shù)高達(dá)50萬(wàn)，對(duì)人類(lèi)健康危害很大[7-8]。2012年中國(guó)腫瘤登記年報(bào)中的數(shù)據(jù)顯示其發(fā)病率和病死率居我國(guó)惡性腫瘤的第二位[9]。因此，本菌成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。KOSTIC 等[10]運(yùn)用全基因組序列探測(cè)CRC組織中微生物菌群變化，結(jié)果顯示CRC 組織內(nèi)有過(guò)量的F.nucleatum。TAHARA 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，CRC 癌旁組織黏膜和正常對(duì)照組黏膜都檢測(cè)出F.nucleatum，但前者是后者的 250 倍，而CRC組織中數(shù)量更高達(dá)1 000倍以上。研究表明，定植在腸道和癌組織的F.nucleatum可以促進(jìn)多種炎癥因子釋放，產(chǎn)生炎癥微環(huán)境，抑制癌癥相關(guān)淋巴細(xì)胞活性，削弱抗腫瘤免疫能力，激活癌變相關(guān)信號(hào)通路等多種復(fù)雜機(jī)制促進(jìn)CRC發(fā)展[12-13]。巨噬細(xì)胞不僅具有吞噬細(xì)菌和破壞瘤細(xì)胞的作用，而且可以產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞因子來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)。但浸潤(rùn)于CRC組織及其周?chē)c組織內(nèi)的巨噬細(xì)胞為何不吞噬F.nucleatum和破壞腫瘤細(xì)胞，其機(jī)理尚不清楚，有待試驗(yàn)進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌和細(xì)胞本實(shí)驗(yàn)所用的F.nucleatum25586菌株購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)；用于本研究的傳代小鼠巨噬細(xì)胞RWA264.7細(xì)胞株購(gòu)自上海梵萌生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑TSB細(xì)菌培養(yǎng)基購(gòu)自海博生物技術(shù)有限公司；ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自云克隆科技股份有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(FPS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及熒光定量試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司；哥倫比亞血瓊脂平板培養(yǎng)基購(gòu)自上海科瑪嘉微生物技術(shù)有限公司。

1.3F.nucleatum厭氧培養(yǎng)及鑒定厭氧培養(yǎng)的條件設(shè)置為90%N2、5%H2和5%CO2，溫度為37℃。培養(yǎng)的基本操作是：從-80℃冰箱中取出凍存的F.nucleatum菌株，立即放入37℃水浴鍋中融化，待完全融化后移到厭氧箱中培養(yǎng)，48 h后，看到培養(yǎng)液混濁時(shí)，立即對(duì)其進(jìn)行鑒定。用血瓊脂平板培養(yǎng)基涂劃菌落繼續(xù)培養(yǎng),涂片進(jìn)行革蘭染色檢查,用掃描電鏡做超微結(jié)構(gòu)觀察,并對(duì)F.nucleatum16S rRNA 基因擴(kuò)增和送檢做序列檢測(cè)。同時(shí)將不含F(xiàn).nucleatum的對(duì)照TSB培養(yǎng)瓶，用分光光度計(jì)測(cè)量F.nucleatum的D600值，待其值達(dá)到0.8，對(duì)應(yīng)的含F(xiàn).nucleatumTSB培養(yǎng)瓶的濃度為109CFU/mL，即可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4F.nucleatum感染巨噬細(xì)胞制備F.nucleatum懸液，從厭氧箱取出已培養(yǎng)48 h的生長(zhǎng)狀菌，將沉淀?yè)u勻，重復(fù)離心2次，棄上清后加入培養(yǎng)液，并以空白培養(yǎng)液調(diào)零，測(cè)定D600值，調(diào)整細(xì)菌濃度，當(dāng)細(xì)菌濃度達(dá)108CFU/mL時(shí)即可。接著調(diào)整細(xì)胞密度，將細(xì)胞用胰酶消化離壁后，調(diào)整為合適的密度，在6孔板中加入7 mm細(xì)胞爬片，均勻加入細(xì)胞懸液，并放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，加入準(zhǔn)備好的F.nucleatum菌懸液(對(duì)照組加入相同體積培養(yǎng)液)，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按設(shè)計(jì)的時(shí)間，于培養(yǎng)3，6，12，24，30，36，48，54，60，72 h分別采集培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞爬片和培養(yǎng)上清進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 培養(yǎng)細(xì)胞的掃描電鏡觀察按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)的時(shí)間，分別從6孔板中取出爬片，2.5%戊二醛中固定1 h，通過(guò)梯度酒精充分脫水。用導(dǎo)電膠將干燥的爬片固定在樣品臺(tái)上，用日本日立E-1045噴鍍儀噴金，立即用美國(guó)FEI QULANTA FEG 250掃描電鏡觀察。

1.6 ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子ELISA試劑盒在室溫平衡30 min，按照說(shuō)明書(shū)配制標(biāo)準(zhǔn)液。根據(jù)檢測(cè)樣品數(shù)目布板，并設(shè)好TMB空白顯色孔。按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)的時(shí)間，分別從6孔板中收集細(xì)胞培養(yǎng)液，3 000 r/min 離心5 min。之后，按照說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行操作，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中細(xì)胞因子濃度。

1.7 熒光定量qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞因子RNA轉(zhuǎn)錄利用RNA提取試劑盒對(duì)收集不同時(shí)間段的巨噬細(xì)胞按說(shuō)明提取RNA；用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)所提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所獲得的cDNA再用試劑盒中的EasyDilution 稀釋液稀釋5倍，-80℃分裝凍存。參照GenBank登錄的TNF-α、IL-1α、IL-6和 IL-8細(xì)胞因子序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)細(xì)胞因子引物(表1)。qRT-PCR反應(yīng)體系組成：SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL；上游引物(10 μmol/L)0.8 μL,下游引物(10 μmol/L)0.8 μL,cDNA 2 μL,ROX 0.4 μL和dH2O 6.0 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃反應(yīng)34 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。溶解曲線為95℃ 30 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。

表1 鼠巨噬細(xì)胞熒光定量qRT-PCR引物

2 結(jié)果

2.1F.nucleatum的鑒定結(jié)果將購(gòu)買(mǎi)的F.nucleatum25586菌株做厭氧培養(yǎng)后，對(duì)其進(jìn)行鑒定。先將在厭氧箱中培養(yǎng)好的F.nucleatum25586菌株，劃線培養(yǎng)在哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上。48 h后觀察到有圓形透明小菌落，邊緣較薄，菌落較濕潤(rùn)，具有光澤。用白金耳挑取菌落涂片，火焰固定后做革蘭染色，檢出形態(tài)一致的染成紅色的革蘭陰性梭形菌(圖1A)。用爬片培養(yǎng)的菌，經(jīng)掃描電鏡觀察，檢出了兩端較尖，腹部較膨大的梭菌。其大小一致，有的還呈現(xiàn)二分裂狀(圖1B)。通過(guò)擴(kuò)增16S rRNA基因，經(jīng)凝膠電泳后，擴(kuò)增出約1 500 bp的目的條帶。另送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示擴(kuò)增序列測(cè)序后與NCBI公布的登錄號(hào)為NC003454.1參考株同源性達(dá)99.85%,鑒定為F.nucleatum。

2.2 炎性細(xì)胞因子的檢測(cè)結(jié)果按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)的時(shí)間點(diǎn)采樣，對(duì)F.nucleatum作用鼠巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1α、IL-6和IL-8進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種炎性細(xì)胞因子表達(dá)量均升高，但有較明顯的區(qū)別。TNF-α在接種菌24 h后開(kāi)始逐增高，在48～54 h有一個(gè)小幅度緩降期，之后一直升高到72 h(圖2A)。IL-1α產(chǎn)生較快，在3 h后即開(kāi)始升高，12 h達(dá)到高峰，48 h后與對(duì)照組保持一致(圖2B)。IL-6在3 h就開(kāi)始增加，30 h是一個(gè)小高峰，此后，至36 h有小幅下降，但很快于又繼續(xù)上升至72 h(圖2C)。IL-8于 3 h就較明顯產(chǎn)生，而增幅很大，于12 h就達(dá)到峰值，且持續(xù)處于高水平狀態(tài)至72 h(圖2D)。

2.3 熒光定量qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞因子的RNA表達(dá)水平F.nucleatum作用于巨噬細(xì)胞后，導(dǎo)致4種細(xì)胞炎性因子RNA均有較高水平表達(dá)。TNF-α呈現(xiàn)波形表達(dá)，3 h開(kāi)始，6 h到達(dá)一個(gè)高峰，此后下降，到30 h又開(kāi)始返彈升高，至60 h到達(dá)更高峰，此后逐漸降低，至72 h仍處于高表達(dá)水平(圖3A)。IL-1α呈現(xiàn)正態(tài)分布式表達(dá)，3 h開(kāi)始，36 h達(dá)最高峰，此后逐漸緩慢下降，至72 h仍然處于高表達(dá)狀態(tài)(圖3B)。IL-6也呈現(xiàn)正態(tài)分布，3 h表達(dá)明顯，36 h 達(dá)到最高峰，此后緩緩降低，72 h還呈現(xiàn)高表達(dá)狀(圖3C)。IL-8呈現(xiàn)波形表達(dá)，6 h出現(xiàn)表達(dá)反應(yīng)，此后逐漸升高，至72 h還呈高表達(dá)，未見(jiàn)下降變化(圖3C)。

A.革蘭染色(1 000×)，F(xiàn).nucleatum呈陰性反應(yīng)染成紅色；B.F.nucleatum兩端較尖呈梭形，有的呈現(xiàn)分裂像(箭頭)

圖2 巨噬細(xì)胞的炎性細(xì)胞因子ELISA檢測(cè)結(jié)果比較

2.4F.nucleatum導(dǎo)致巨噬細(xì)胞變化的超微結(jié)構(gòu)觀察將F.nucleatum接種于培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞后，在共同培養(yǎng)的前24 h，F(xiàn).nucleatum生長(zhǎng)良好，菌體較大，分裂明顯，巨噬細(xì)胞在F.nucleatum作用下，形態(tài)不斷發(fā)生變化。如3 h時(shí)對(duì)照組巨噬細(xì)胞表面較光滑，細(xì)胞分裂明顯，新形成細(xì)胞的胞膜依然連接(圖4A)。接菌組的巨噬細(xì)胞處于收縮狀，呈隆突的半球形，在其胞體的表面和周?chē)写罅砍仕鬆罨蚪z狀F.nucleatum，菌體互相黏集，在細(xì)胞表面形成一層菌膜狀物(圖4B)。培養(yǎng)12 h時(shí)，對(duì)照組巨噬細(xì)胞表面有許多絨毛狀突起，新分裂細(xì)胞呈球形，細(xì)胞沒(méi)有明顯偽足(圖4C)。而接種菌的巨噬細(xì)胞變得較扁，從胞膜伸出較多的偽足對(duì)細(xì)菌進(jìn)行吞噬。此時(shí)，在細(xì)胞表面、偽足膜和細(xì)胞間則有較多的F.nucleatum黏附，細(xì)菌發(fā)育良好，有明顯的分裂增殖變化(圖4D)。

圖3 巨噬細(xì)胞的炎性細(xì)胞因子RNA qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果比較

A.對(duì)照組3 h細(xì)胞表面光滑，分裂明顯；B.接菌組3 h細(xì)胞呈收縮狀，被大量F.nucleatum(箭頭)包繞；C.對(duì)照組12 h細(xì)胞表面不光滑，有較多絨毛；D.接菌組12 h細(xì)胞有較多偽足，細(xì)胞間有大量F.nucleatum(箭頭)

培養(yǎng)24 h后，由于較長(zhǎng)時(shí)間在有氧環(huán)境下培養(yǎng)，所以厭氧F.nucleatum逐漸變小，變細(xì)，有的呈短桿狀，數(shù)量也減少。巨噬細(xì)胞的體積不斷增大，偽足變大，胞體變粗糙，常見(jiàn)有胞吐孔，后期在其突起的偽足上也有較多的胞突孔。如30 h時(shí)對(duì)照組的巨噬細(xì)胞仍然呈球形，有明顯的分裂像，新形成的細(xì)胞之間還有胞膜相連(圖5A)。而受F.nucleatum作用的巨噬細(xì)胞，其表面粗糙，有許多結(jié)節(jié)，偽足粗大而較扁，在胞體和偽足末端仍見(jiàn)有發(fā)育不良而較短小的F.nucleatum(圖5B)。培養(yǎng)48 h，對(duì)照組細(xì)胞的胞體表面有明顯的隆突，偽足粗短，還見(jiàn)有分裂形成的新細(xì)胞(圖5C)。而接菌組的巨噬細(xì)胞表面更粗糙，有大小不一的顆粒狀突起，伸出的偽足呈樹(shù)根狀，并有分叉。胞體上見(jiàn)有較大的胞吐孔，胞周和偽足處可見(jiàn)細(xì)而短，且成團(tuán)的F.nucleatum(圖5D)。此時(shí)可見(jiàn)少部分發(fā)育不良的巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡。72 h時(shí)對(duì)照巨噬細(xì)胞表面有較多結(jié)節(jié)狀突起，胞體周?chē)斐鲚^扁平的偽足，仍見(jiàn)有細(xì)胞分裂變化(圖5E)。接菌組的巨噬細(xì)胞有粗大而扁平的偽足，突出的變化是不僅胞體上見(jiàn)有明顯的胞吐孔，而且在偽足上也有較多的胞吐孔。在胞體和偽足周?chē)匀豢砂l(fā)現(xiàn)呈球桿狀黏集在一起的F.nucleatum(圖5F)。在接菌組中雖然大量的F.nucleatum一直不斷地作用于巨噬細(xì)胞，但沒(méi)有觀察到巨噬細(xì)胞因F.nucleatum作用而發(fā)生崩解壞死的變化，在巨噬細(xì)胞周?chē)冀K可看到細(xì)菌，這說(shuō)明細(xì)菌和巨噬細(xì)胞可以在一起共生。

A.對(duì)照組30 h細(xì)胞細(xì)胞呈球形，分裂像明顯；B.接菌組30 h細(xì)胞偽足粗大，偽足之間有發(fā)育不良的F.nucleatum(箭頭)；C.對(duì)照組48 h細(xì)胞有短小偽足，見(jiàn)新分裂形成的球形細(xì)胞；D.接菌組48 h細(xì)胞體積變大，有明顯的胞吐孔(紅箭頭)和殘存的F.nucleatum(白箭頭)；E.對(duì)照組72 h細(xì)胞偽足變大，體表結(jié)節(jié)增多；F.接菌組72 h細(xì)胞體表和偽足部均見(jiàn)胞吐孔(紅箭頭)，細(xì)胞仍見(jiàn)少量F.nucleatum(白箭頭)

3 討論

3.1F.nucleatum對(duì)巨噬細(xì)胞的毒害作用一般認(rèn)為，侵入是細(xì)菌致病并使其深入組織內(nèi)部的一種重要方式，而黏附則是細(xì)菌感染和侵襲宿主的第一步。據(jù)報(bào)道，F(xiàn).nucleatum有很強(qiáng)的黏附性，可結(jié)合從原核細(xì)胞到真核細(xì)胞的細(xì)胞外分子[14]。這可能與其自身的結(jié)構(gòu)和特異性產(chǎn)物有關(guān)。F.nucleatum菌體外膜有一種RadD蛋白(即精氨酸抑制性黏附素)，可介導(dǎo)F.nucleatum早期與細(xì)菌及組織細(xì)胞共聚，繼之，它產(chǎn)生的特異性FadA和Fap2又加強(qiáng)了其與細(xì)胞的黏附作用。RUBINSTEIN等[15]發(fā)現(xiàn)了F.nucleatum的黏附性FadA毒力因子，有利于其黏附和侵入包括CRC細(xì)胞在內(nèi)的上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，并加速CRC患者腸上皮細(xì)胞的癌變。ABED等[16]發(fā)現(xiàn)F.nucleatum產(chǎn)生的Fap2蛋白通過(guò)與CRC細(xì)胞過(guò)表達(dá)的D-半乳糖-β(1，3)-N-乙酰-D-半乳糖胺(Gal-GalNAc)結(jié)合，在介導(dǎo)CRC中細(xì)菌富集和細(xì)胞突變過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)把F.nucleatum接種于培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞后，大量F.nucleatum黏集在一起，包裹于巨噬細(xì)胞表面或巨細(xì)胞周?chē)?，向巨噬?xì)胞入侵。細(xì)胞較少的部位，常見(jiàn)大量F.nucleatum黏集在一起，并不分散，而在沒(méi)有細(xì)胞的部位，很少有F.nucleatum。培養(yǎng)30 h 后，雖然F.nucleatum生長(zhǎng)不良，變小變細(xì)，但它們還多呈黏集狀，位于巨噬細(xì)胞的偽足部或體表,這說(shuō)明F.nucleatum有很強(qiáng)的黏附性。當(dāng)培養(yǎng)至48 h后，常在巨噬細(xì)胞的胞體上見(jiàn)有胞吐孔，此后，胞吐孔增多，并于細(xì)胞的偽足部也可看到胞吐孔。這可能是進(jìn)入巨噬細(xì)胞內(nèi)的F.nucleatum，經(jīng)細(xì)胞內(nèi)酶消化后排出胞體；也是巨噬細(xì)胞對(duì)F.nucleatum的抗原進(jìn)行加工，并將抗原信息傳遞給淋巴細(xì)胞的一種方式。另?yè)?jù)報(bào)道，F(xiàn).nucleatum產(chǎn)生的FadA除具有很強(qiáng)的黏附性之外，還可在胞膜上與鈣黏附蛋白(E-cadherin)特異性結(jié)合，從而激活細(xì)胞的經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路，使細(xì)胞質(zhì)中β-catenin的濃度劇增，并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，激活下游靶基因表達(dá)，如 c-myc和cyclin D1等基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、分化和突變[17]。正因?yàn)镕.nucleatum作用緩和，引起的變化是以增生為主，所以本研究在培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞后期，雖可檢出凋亡細(xì)胞，但很少見(jiàn)到壞死而崩解的細(xì)胞。

3.2F.nucleatum引起白細(xì)胞介素(IL)變化的特點(diǎn)IL最初是指由白細(xì)胞產(chǎn)生又在白細(xì)胞間起調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子?，F(xiàn)在認(rèn)為，IL是一類(lèi)分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能相似，具有重要調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子。它在細(xì)胞信息傳遞、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能、介導(dǎo)細(xì)胞增殖與分化以及在炎癥反應(yīng)中起重要作用。IL是非常重要的細(xì)胞因子家族，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)30余種，其中參與炎性反應(yīng)的主要有3種，即IL-1α、IL-6和IL-8，而且這3種IL主要由激活的巨噬細(xì)胞等細(xì)胞產(chǎn)生。本研究通過(guò)ELISA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)F.nucleatum可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量IL，其中以IL-6和IL-8表達(dá)最強(qiáng)，其次是IL-1α。通過(guò)熒光定量qRT-PCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞IL-RNA，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞3種IL-RNA呈現(xiàn)高水平表達(dá)，其中IL-1α和IL-6呈正態(tài)分布狀表達(dá)，始終維持在較高的水平，而IL-8則是逐漸由低向高，表達(dá)不斷增強(qiáng)，且持續(xù)在較高水平。這說(shuō)明F.nucleatum的確能激活巨噬細(xì)胞，使其產(chǎn)生大量IL。相似的結(jié)果也見(jiàn)報(bào)道，YANG等[18]研究表明炎癥因子有助于CRC發(fā)展，通過(guò)對(duì)感染F.nucleatum小鼠血清分析，發(fā)現(xiàn)由T細(xì)胞產(chǎn)生的具有促炎反應(yīng)的 IL-17F、IL-21和IL-22細(xì)胞因子呈上調(diào)狀態(tài)。又據(jù)JIANG等[19]報(bào)道，IL-17F、IL-21和IL-22在患CRC病人體內(nèi)呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。這說(shuō)明致炎的IL與CRC的發(fā)生有關(guān)。

先前的報(bào)道認(rèn)為，炎癥性腸病是CRC 重要的高危因素，持續(xù)存在的慢性炎癥能刺激細(xì)胞不斷增生和氧化應(yīng)激，導(dǎo)致異型細(xì)胞增生，從而產(chǎn)生癌變[20]。但據(jù)新近報(bào)道認(rèn)為，F(xiàn).nucleatum與其他引起腸道腫瘤相關(guān)的細(xì)菌不同，它不能直接引起腸管炎性反應(yīng)，不會(huì)加劇結(jié)腸炎、腸炎或炎癥相關(guān)的腸道病變，但由它刺激產(chǎn)生的促炎因子卻可以加速腫瘤發(fā)生[21-22]。暴露于F.nucleatum的ApcMin/+小鼠腫瘤，表現(xiàn)出與人類(lèi)F.nucleatum陽(yáng)性CRC相同的促炎表達(dá)特征。然而，在這些小鼠中沒(méi)有觀察到任何腸炎癥狀。受試ApcMin/+小鼠在沒(méi)有任何腸炎或肉眼炎癥的情況下，F(xiàn).nucleatum則能加速腫瘤的發(fā)生。QUAH等[23]和LEE等[24]認(rèn)為IL等炎性因子能夠促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，與其能激活TLR/IL細(xì)胞信號(hào)通路有關(guān)。TLR 識(shí)別配體IL等后可通過(guò)接頭蛋白和受體維甲酸誘導(dǎo)基因 I(Rig-I)傳遞細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，激活MAPK 和NF-κB途徑，誘導(dǎo)炎癥因子(TNF-α、IL-1α、IL-6和IL-8)，血管生成因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞黏附分子和基質(zhì)降解酶的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。另?yè)?jù)RAZI等[25]報(bào)道，F(xiàn).nucleatum產(chǎn)物和髓樣細(xì)胞 TLR 結(jié)合，促進(jìn)炎性因子IL-1α、IL-6、IL-8和 IL-23 的釋放，而IL-23 能活化下游細(xì)胞，后者分泌的 IL-17、IL-22和IL-8 可活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)，激活的 STAT3 可以調(diào)節(jié) VEGF 表達(dá)，加速腫瘤血管的形成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲。由此可見(jiàn)，F(xiàn).nucleatum刺激巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子TNFα、IL-1α、Il-6和IL-8，主要是通過(guò)參與TLR/IL和MAPK/NF-κB等細(xì)胞信號(hào)通路來(lái)激活轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)血管生成、細(xì)胞的分化和生長(zhǎng)。

3.3F.nucleatum對(duì)TNF-α產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡的影響TNF-α主要是由巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的一種重要的多功能性細(xì)胞因子。據(jù)報(bào)道，TNF-α 是在細(xì)胞各階段病理生理過(guò)程中扮演重要角色的多功能性多肽類(lèi)細(xì)胞因子[26]。它既有在體內(nèi)清除異已和病原的功能，如對(duì)某些腫瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒性作用，能殺傷和抑制腫瘤細(xì)胞并導(dǎo)致凋亡，促進(jìn)中性粒細(xì)胞吞噬，抗感染，引起發(fā)熱等，又有修復(fù)組織損傷的機(jī)能，如誘導(dǎo)受損細(xì)胞的蛋白合成，促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化等。另外，它還能誘導(dǎo)發(fā)熱和IL-1α、IL-6等細(xì)胞因子產(chǎn)生[23]。這說(shuō)明TNF-α的相應(yīng)功能是隨著疾病發(fā)展的不同階段而有所表現(xiàn)的。在本研究中，當(dāng)F.nucleatum接種于培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞，此后持續(xù)培養(yǎng)48 h，巨噬細(xì)胞雖然在F.nucleatum的影響下分裂速度減慢，但并未出現(xiàn)壞死、崩解等退行性變化，但54 h后卻檢出少部分巨細(xì)胞發(fā)生凋亡變化。巨噬細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，凋亡的細(xì)胞體積變小、核濃縮、胞膜緊包細(xì)胞核，呈干縮狀，失去活細(xì)胞固有光澤，呈灰黑色。ELISA檢測(cè)見(jiàn)TNF-α此時(shí)正處于高表達(dá)階段，熒光定量qRT-PCR 檢測(cè)TNF-α的RNA表達(dá)也處于高表達(dá)水平。有報(bào)道F.nucleatum可促使細(xì)胞釋放TNF-α。這說(shuō)明巨噬細(xì)胞的凋亡與TNF-α釋放增多有關(guān)[27]。據(jù)報(bào)道，TNF-α是一種死亡因子，常以三聚體的形式與靶細(xì)胞膜上的死亡受體，即腫瘤壞死因子受體(TNFR)結(jié)合，誘導(dǎo)受體三聚化而被激活，并通過(guò)一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使腫瘤細(xì)胞凋亡[28]。由此可見(jiàn)，F(xiàn).nucleatum作用于巨噬細(xì)胞后，可引進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生高水平的TNF-α，后者可作用于代謝受制或發(fā)生異常的巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致其凋亡。另外，在一定條件下TNF-α又可與IL-1α、IL-6和IL-8等炎性細(xì)胞因子協(xié)同，激活MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而導(dǎo)致細(xì)胞分化和增殖。