旋毛蟲肌幼蟲期胞外囊泡對小鼠免疫保護作用

徐楓雁，張媛媛，劉曉雷，劉明遠，王學林，王 洋，白 雪 (吉林大學 動物醫(yī)學學院 人獸共患病研究教育部重點實驗室，吉林 長春130062)

旋毛蟲病(trichinellosis)是由一種常見的寄生蠕蟲，即旋毛蟲(Trichinellaspiralis)寄生于人或多種哺乳動物體內引發(fā)的嚴重的食源性人獸共患寄生蟲疾病[1]。宿主通常是因為攝食含有旋毛蟲的未煮熟或生肉引發(fā)感染，該病在人體可以引起不同的癥狀，從全身發(fā)熱、腹痛、腹瀉、惡心、嘔吐、肌肉疼痛到更嚴重的心肌炎和腦炎，嚴重時甚至可致人死亡[2]。寄生于動物體內則影響動物自身的生長發(fā)育，已經嚴重威脅到人類健康及牲畜養(yǎng)殖業(yè)[3]。近年來，抗旋毛蟲感染的候選疫苗抗原主要集中于混合的旋毛蟲排泄-分泌(excretory secretory,ES)抗原或單個相對分子質量的重組功能因子，與滅活的全蟲疫苗或蟲體粗提物以及旋毛蟲排泄分泌產物疫苗相比，單一抗原在感染旋毛蟲的小鼠體內產生的免疫保護效果通常相對較低[4]。目前，旋毛蟲疫苗的研究主要包括滅活疫苗、基因重組蛋白疫苗、亞單位疫苗，合成肽疫苗以及DNA疫苗，這些疫苗均可引起有效的保護性免疫應答[5]。盡管如此，研制抗旋毛蟲病新型候選疫苗依舊面臨著如旋毛蟲生命周期的復雜性，階段特異性抗原的多樣性，免疫逃避以及宿主的免疫調節(jié)反應等諸多挑戰(zhàn)。

胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是一種可由多種細胞分泌的具有雙層磷脂膜結構的囊泡，根據分泌方式可分為微囊泡、外泌體、凋亡小體和遷移體4種[6]。研究發(fā)現，多種寄生蟲來源的EVs對宿主具有調節(jié)宿主免疫應答，提高宿主存活率，增加宿主排蟲能力等免疫保護作用，表明完整的寄生蟲EVs具備開發(fā)疫苗的研究潛力[7-9]。TRELIS等[7]等將棘口吸蟲EVs皮下免疫BALB/c小鼠，發(fā)現小鼠存活率明顯提高，蟲卵減少60%，蟲體生長發(fā)育遲緩，體內IgG和IgM抗體水平升高。SHEARS等[8]使用超速離心法獲取鼠鞭蟲EVs，隨后皮下免疫C57BL/6小鼠發(fā)現，小鼠體內產生高水平IgG2a/c，減蟲率達60%。KIFLE等[10]對曼氏血吸蟲15,120 kDa的EVs進行蛋白質組學分析后發(fā)現其中含有多種可作為曼氏血吸蟲病候選疫苗的蛋白。

迄今為止，旋毛蟲肌幼蟲期胞外囊泡(Trichi-nellaspiralismuscle larvae extracellular vesicles,Ts-ML-EVs)對小鼠是否具有免疫保護效果尚未報道。本試驗首次以Ts-ML-EVs為研究對象，觀察其對感染旋毛蟲前后小鼠成蟲和肌幼蟲減蟲率以及體內各抗體水平、細胞因子含量的影響，為旋毛蟲有效候選疫苗的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 蟲種和實驗動物旋毛蟲(國際標準蟲種編號：ISS534)由本實驗室保存。6～8周齡健康雌性BALB/c小鼠，體質量為16～20 g，購自吉林大學白求恩醫(yī)學院實驗動物中心。

1.2 主要試劑RPMI1640、青霉素、鏈霉素購自美國Gibco公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、蛋白銀染試劑盒、化學發(fā)光顯影試劑盒均購自中國碧云天生物技術公司；10 kDa超濾管購自美國Millipore公司；小鼠IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ、IgG、IgA、IgE、IgM ELISA檢測試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司；IgG1、IgG2a ELISA檢測試劑盒購自美國mnimAbs公司；流式熒光PE-CD63和APC-CD81抗體購自上海優(yōu)寧維生物科技有限公司；SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液(5×)購自鼎國生物技術有限公司；多克隆山羊抗烯醇化酶(Enolase)抗體、單克隆兔抗熱休克蛋白70(Hsp70)抗體均購自英國Abcam公司；HRP標記的驢抗山羊IgG抗體購自美國Jackson ImmunoResearch公司；HRP標記的山羊抗兔IgG抗體和HRP標記的兔抗鼠IgG抗體購自美國Cell Signaling公司；IMS1313佐劑感謝法國賽比克公司饋贈。

1.3 旋毛蟲肌幼蟲期EVs的分離與鑒定取感染旋毛蟲35 d以上的Wistar大鼠處死，使用集樣消化法獲得旋毛蟲肌幼蟲(Ts-ML)。將Ts-ML放入事先加好2%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2培養(yǎng)16 h后取出培養(yǎng)上清，通過差速離心法去除培養(yǎng)上清中的蟲體及其他雜質，經0.22 μm濾器過濾后，使用10 kDa超濾管超濾濃縮培養(yǎng)上清并不斷用PBS置換至無色上清獲得Ts-ML-ES。培養(yǎng)基上清經10 kDa超濾管濃縮后利用超速離心法獲得Ts-ML-EVs，最后Ts-ML-EVs經透射電子顯微鏡觀察、納米顆粒追蹤分析、流式細胞術標記EVs表面特異蛋白CD63和CD81和Westren blot分析進行鑒定。

1.4 旋毛蟲肌幼蟲期EVs對小鼠的免疫程序及攻蟲試驗將32只小鼠隨機平均分為4組，具體免疫程序參考文獻[11]。將30 μgTs-ML-ES和50 μgTs-ML-EVs分別與佐劑1∶1等體積混勻后皮下多點注入小鼠體內并輕柔注射點防止疫苗漏出導致免疫失敗，PBS對照組和佐劑對照組注射等體積的PBS溶液和PBS+佐劑混合物。三免后2周每只小鼠灌胃肌幼蟲300條，灌胃后6 d每組隨機取2只小鼠處死，獲得各組旋毛蟲成蟲(Ad6)并逐個計數，比較免疫組與對照組Ad6的數量差異。攻蟲后35 d，所有小鼠全部處死，計算各免疫組的肌幼蟲減蟲率。

1.5 樣品的采集和預處理小鼠每次免疫前、末次免疫后2周、攻蟲前、攻蟲后35 d分別眼眶采血。采集的血液37℃放置1 h后再經1 500 r/min離心15 min獲得上層透明血清，分裝后放置-80℃冰箱保存，用于后續(xù)Western blot分析和ELISA檢測試驗。

1.6 Western blot分析將Ts-ML-EVs和Ts-ML-ES分別定量20 μg，與5×蛋白上樣緩沖液均勻混合后電浴10 min，冷卻至室溫后上樣到12% SDS-PAGE凝膠，上層膠電壓70 V、30 min，下層膠電壓120 V、2 h。結束后切下目的條帶，濕轉2 h后放入5%脫脂牛奶封閉液中室溫搖床封閉2 h。封閉結束后將PVDF膜分別放入加好三免的Ts-ML-EVs小鼠血清(1∶200)，多克隆山羊抗Enolase(1∶200)和單克隆兔抗Hsp70(1∶1 000)的封閉液中，4℃搖床孵育過夜。次日使用TBST洗6遍，每次5 min，然后分別將HRP標記的兔抗鼠IgG(1∶3 000)，驢抗山羊IgG(1∶50 000)和山羊抗兔IgG(1∶2 000)的二抗加入封閉液中，室溫搖床孵育2 h，結束后用TBST洗滌6次，每次5 min，最后應用UVP Chemstudio多功能化學發(fā)光成像系統拍攝結果并保存。

1.7 免疫小鼠血清抗體和細胞因子檢測將收集到的不同天數的血清分組標記好后使用ELISA試劑盒檢測抗體IgG、IgA、IgE、IgM、IgG1、IgG2a以及細胞因子IL-4、IL-10、IL-12和IFN-γ含量，每組設3個重復。酶標儀檢測吸光度(D450值)，并按照說明書繪制標準曲線，計算細胞因子濃度。

2 結果

2.1 旋毛蟲肌幼蟲期EVs的分離、純化與鑒定透射電子顯微鏡觀察到Ts-ML-EVs呈典型雙層磷脂膜囊泡樣結構(圖1)；納米顆粒追蹤分析結果顯示Ts-ML-EVs直徑為100～180 nm，峰值為126 nm(圖2)，符合寄生蟲EVs形態(tài)結構特征。通過流式細胞術檢測到EVs表面標志物CD63和CD81(圖3)；Western blot結果表明，Ts-ML-EVs中含有EVs標志蛋白Enolase和Hsp70(圖4)。

2.2 旋毛蟲肌幼蟲期EVs的SDS-PAGE和Western blot分析SDS-PAGE分析顯示Ts-ML-EVs、Ts-ML-ES、Ts-ML-EVs上清的蛋白組分成分均一、穩(wěn)定無降解，相對分子質量分布于10～190 kDa，其中大部分蛋白條帶是各組分所共有的(圖5)。但是，與Ts-ML-EVs相比，其他組分存在幾條特異性和差異性表達蛋白條帶。Ts-ML-ES相對分子質量為40 kDa 的蛋白條帶有所增加，Ts-ML-EVs相對分子質量在45～75 kDa之間的蛋白含量更高。經Western blot分析，純化后的Ts-ML-EVs可被接種3次Ts-ML-EVs后的小鼠血清特異性識別，而與健康小鼠血清呈陰性反應(圖6)，證明Ts-ML-EVs有較好的反應原性。

圖1 Ts-ML-EVs在透射電子顯微鏡下的形態(tài)

圖2 納米顆粒追蹤分析Ts-ML-EVs的粒徑大小

圖3 流式細胞術檢測Ts-ML-EVs表面抗體標志物CD63和CD81

1.蟲體蛋白；2.Ts-ML-EVs

2.3 旋毛蟲肌幼蟲期EVs對小鼠體內各特異性抗體水平影響分析將各組抗原免疫小鼠后，使用ELISA試劑盒檢測免疫后各時間段小鼠體內各特異性抗體水平變化趨勢。結果表明，與PBS組和佐劑對照組比較，Ts-ML-EVs組在首免和二免后特異

M.預染蛋白Marker；1.Ts-ML-EVs；2.Ts-ML-ES；3.Ts-ML-EVs上清；4.Ts蟲體蛋白

M.蛋白Marker；1，3 Ts-ML-ES； 2，4.Ts-ML-EVs； 1，2.健康小鼠血清； 3，4.三免Ts-ML-EVs后的小鼠血清

性IgG水平緩慢升高，三免后抗體水平迅速增加(圖7A)，差異極顯著(P<0.000 1)，表明Ts-ML-EVs能誘導機體產生一定的體液免疫應答。首免后，試驗組IgG1抗體水平迅速上升，直至三免后兩抗體水平達到最高(圖7C)。一免后，Ts-ML-EVs組IgG2a抗體水平緩慢升高，二免后抗體水平迅速上升，與對照組差異極顯著(P<0.000 1)(圖7D)，此外IgG1水平高于IgG2a，且差異顯著(P<0.05)。說明Ts-ML-EVs能誘導以Th2為主的Th1/Th2混合免疫應答。首免后IgM抗體迅速增加，二免后緩慢增加，達到最高值，三免后抗體水平呈下降趨勢(圖7B)，表明Ts-ML-EVs能誘導機體產生高水平的IgM抗體。Ts-ML-EVs組經一免、二免后IgA抗體在緩慢上升，三免后顯著升高(P<0.01)(圖7E)，表明Ts-ML-EVs能誘導機體產生一定水平的IgA抗體。Ts-ML-EVs組一免、二免后IgE抗體迅速增加，三免后Ts-ML-EVs組IgE抗體水平緩慢增加達到最高值(圖7F)，表明Ts-ML-EVs能誘導機體產生高水平的IgE抗體。

A.各組小鼠血清中IgG抗體含量變化;B.各組小鼠血清中IgM抗體含量變化;C.各組小鼠血清中IgG1抗體含量變化;D.各組小鼠血清中IgG2a抗體含量變化;E.各組小鼠血清中IgA抗體含量變化;F.各組小鼠血清中IgE抗體含量變化。*示P<0.05；**示P<0.01；***示P<0.001；****示P<0.000 1。下同

2.4 旋毛蟲肌幼蟲期EVs對小鼠體內細胞因子含量影響分析將各組抗原免疫小鼠后，使用ELISA試劑盒檢測免疫前后各時間段小鼠體內Th1和Th2型細胞因子的變化趨勢。試驗結果顯示，與PBS組和佐劑對照組相比，一免后其他2組IL-4和IL-10的水平均極顯著升高(P<0.01)，并隨著免疫次數增加不斷上升，三免2周后達到最高(圖8A，B)。而IL-12和IFN-γ的水平隨著免疫次數增加略有升高(圖8C，D)，與Th2型(IL-4、IL-10)細胞因子差異顯著(P<0.05)，2組之間無明顯差異。PBS和佐劑對照組4種細胞因子均無顯著變化。結果表明，Ts-ML-EVs能誘導機體產生細胞免疫應答，且與體液免疫應答結果一致。經過計算后結果顯示，Ts-ML-EVs的成蟲減蟲率為23.4%，肌幼蟲減蟲率為43.7%(圖9)。

A.各組小鼠血清中細胞因子IL-4含量變化；B.各組小鼠血清中IL-10含量變化;C.各組小鼠血清中IL-12含量變化;D.各組小鼠血清中IFN-γ含量變化

圖9 各試驗組的成蟲和肌幼蟲減蟲率

3 討論

EVs是直徑大小集中在50～250 nm、具有磷脂雙分子層橢圓形結構的囊泡[12]。EVs的鑒定方法通常為透射電鏡觀察、納米顆粒追蹤分析和Western blot等，隨著科學技術發(fā)展，近年來流式細胞術也越來越多地應用到EVs表面標志蛋白鑒定中，因此運用上述方法對收集到的囊泡進行鑒定。結果證明本試驗獲得的囊泡呈典型雙層囊泡結構，直徑為100～180 nm，峰值為126 nm，具有EVs表面標志物CD63和CD81，內含EVs標志蛋白Enolase和Hsp70，符合寄生蟲EVs表征，可以用于進一步的免疫保護性試驗。

目前已鑒定到寄生蟲EVs中包含部分免疫調節(jié)分子或與已知免疫調節(jié)分子相似的蛋白，除此之外EVs還含有mRNA、miRNA、脂質等物質，在蟲體侵襲及與宿主的相互作用過程中發(fā)揮重要作用[13-14]。本試驗Western blot結果顯示，Ts-ML-EVs可識別抗Ts-ML-EVs小鼠免疫血清，具有免疫反應原性，與Ts-ML ES相比多出40～45 kDa條帶，表明Ts-ML-EVs可能參與宿主抗旋毛蟲感染免疫反應。為了探究Ts-ML-EVs對小鼠免疫保護效果，本試驗將Ts-ML-EVs與IMS1313佐劑等體積均勻混合作為疫苗免疫小鼠，發(fā)現經過三免后，Ts-ML-EVs的成蟲和肌幼蟲減蟲率分別為23.4%和43.7%。Ts-ML-EVs在Ts-ML-ES中占比極低，但具有很好的免疫原性，表明Ts-ML-EVs起到一定的抗寄生蟲作用，是一種很好的抗旋毛蟲免疫候選抗原，有利于更加快速篩選免疫調節(jié)分子，研制新型候選疫苗。

COAKLEY等[15]利用多形螺旋線蟲EVs免疫C57BL/6小鼠，結果減蟲率為82%，且小鼠體內存在高滴度的IgM、IgG1和IgA抗體。本試驗結果表明，與PBS組和佐劑對照組相比，首次免疫開始后，Ts-ML-EVs免疫組小鼠體內IgG和IgM水平含量即顯著上升，并且隨著加強免疫的次數持續(xù)增加，其中以IgM變化最為明顯，首免2周后即可在小鼠體內檢測到高滴度抗體，但與其他抗體不同的是，二免2周后抗體水平達到最高值，三免后則開始緩慢下降，IgA和IgE含量也同樣升高，但沒有其他幾種抗體變化差異明顯。研究發(fā)現IgM是寄生蟲感染后獲得性免疫最先產生的抗體，激活經典的補體級聯反應的能力是IgG的1 000倍，具有加強和促進體液免疫應答的能力，在抵抗蠕蟲感染中發(fā)揮重要作用，推測IgM可能通過促進IgG的應答間接參與了抗旋毛蟲的保護性免疫應答，因此當IgG水平達到一定高度時，IgM則開始逐漸下降[11,16-17]?？赡苁怯捎赥s-ML-EVs可以誘導小鼠產生各種高滴度抗體和細胞因子，因此可以通過影響旋毛蟲生長發(fā)育過程，發(fā)揮抵抗蟲體侵襲作用。

據報道，Th1型細胞因子具有清除胞內病原體的功能，而Th2型細胞因子可以聚集和激活嗜酸性粒細胞和肥大細胞，從而抵抗寄生蟲感染[18]。本試驗細胞因子水平變化顯示Th1(IFN-γ、IL-12)和Th2(IL-4、IL-10)型免疫反應均增強，其中代表Th2型免疫反應的IL-4和IL-10細胞因子變化較明顯，而IL-4在抗旋毛蟲感染中發(fā)揮重要作用。研究表明，IgG1反映了Th2型免疫反應，IgG2a則反映Th1型免疫反應，同時發(fā)現IgG1和IgG2a含量隨著免疫次數增加不斷上升且IgG1水平高于IgG2a，差異顯著(P<0.05)。這2種抗體水平變化與細胞因子含量相符合。

綜上所述，本研究首次將Ts-ML-EVs作為疫苗免疫小鼠，發(fā)現小鼠體內抗體增加，細胞因子水平變化顯示Ts-ML-EVs可引起Th1/Th2型混合免疫反應，且以Th2型免疫反應為主，成蟲和肌幼蟲減蟲率分別為23.4%和43.7%。本試驗為篩選有效旋毛蟲疫苗抗原及進一步開展相關研究提供理論依據。